P01
Mikroskopie a kultivace
v lékařské mikrobiologii
Testování citlivosti na
antibiotika
Diagnostika stafylokoků
Bi7170c (podzim 2017)
Osnova
●
úvodní pokyny
●
rod Staphylococcus
●
diferenciální diagnostika rodu Staphylococcus
●
praktické úkoly
– mikroskopie a kultivace
– dif. dg. rodu Staphylococcus
– Staphytest 16
– difúzní diskový test
2/60
Bezpečnost práce
v mikrobiologické laboratoři
●
postudujte a podepište Provozní řád praktických cvičení
z lékařské mikrobiologie + První pomoc – předepsaný
postup při laboratorních nehodách
3/60
Úvodní pokyny
●
šatní skříňky pro studenty jsou 1., 2. a 4. od okna
●
nepoužívejte 3. skříňku, i kdyby byla otevřená
(skříňka studentů střední zdravotnické školy)
●
klíče od šatních skříněk nechávejte vždy na háčcích
vedle dveří, visí zde i klíček od WC (vracejte na místo
po použití toalety)
●
vstup studentů do prostor ústavu za praktikárnou
je zakázán
4/60
Nakládání s odpady
●
malé kousky můžete dát do nádobek na svých stolech
●
použité zápalky mají své vlastní misečky
●
větší odpadky vyhazujte do koše vedle umyvadel
●
rozbité sklo patří do žlutého kbelíčku vedle koše
●
mikroskopické preparáty připravené přímo vámi
patří po použití do dezinfekce
5/60
Literatura
●
protokoly k praktickým cvičením (IS MU) nutné!
●
budete potřebovat Lékařskou mikrobiologii obecnou
(2005) a Lékařskou mikrobiologii speciální (2003)
●
volitelně:
– Lékařská mikrobiologie
– vyšetřovací metody
– Klinická mikrobiologie
6/60Foto: archiv MÚ
Podmínky zápočtu
●
účast v praktiku by měla být pokud možno
stoprocentní (možná jedna neomluvená absence, další
musí být omluvené)
●
i přes absenci je nutné doplnit si příslušné
znalosti, vyplnit protokol a kontrolní otázky
●
při více omluvených absencích vhodné praktikum
nahradit v jiné skupině (po předchozí domluvě s
daným vyučujícím)
●
pro zápočet je také nutno mít vyplněny všechny
kontrolní otázky na IS MU
●
zápočtový test (12 otázek, jedna správná odpověď,
alespoň 7/12 dobře)
7/60
Pokyny k vyplňování protokolů
●
obrázky opravdu kreslete (nakreslete koky, nepište
„vidím koky“)
●
obrázky kreslete barevně, noste pastelky (alespoň
červená a modrá)
●
kreslete to, co vidíte (pokud se vám koky
v mikroskopu dotýkají, kreslete je tak, nekreslete jen
obrysy, ale probarvujte)
●
pokud nevidíte to, co máte vidět, upozorněte
asistenta (!)
●
protokoly jsou kontrolovány u zkoušky a mají vliv
na výslednou známku!
8/60
Stafylokoky
●
G+ koky, ve shlucích
(lat. staphyle – hrozen)
●
fakultativně anaerobní,
nesporulujicí, nepohyblivé
●
kataláza pozitivní,
oxidáza negativní
(kromě S. sciuri),
poměrně odolné proti
vyschnutí, vyšším
koncentracím solí
(diagnostický znak)
9/60
Stafylokoky (2)
●
rozdělení podle schopnosti koagulovat plazmu:
– koaguláza pozitivní (S. aureus, S. intermedius)
– koaguláza negativní (S. epidermidis, S. hominis,
S. haemolyticus, S. saprophyticus)
10/60
Staphylococcus aureus
(zlatý stafylokok)
●
významný koaguláza pozitivní stafylokok
●
u třetiny lidí žije na kůži si sliznicích a nevyvolává potíže
(dokud není porušena obranyschopnost)
●
charakteristickým rysem infekcí je tvorba
ohraničených zánětlivých ložisek (abscesů)
– absces = dutina plná hnisu (rozpadající se
leukocyty, bakterie), ohraničená stěnou z fibrinu a
fibroblastů, okolní tkáň je zanícená
– vznik pomocí plazmakoagulázy (volné i vázané, tzv.
clumping faktoru)
●
široká škála faktorů virulence (koagulázy, kataláza,
hyaluronidáza, lipázy, nukleázy, ...)
11/60
Faktory virulence S. aureus
●
ne všechny kmeny S. aureus disponují všemi faktory
virulence
12/60http://www.ratsteachmicro.com
Vznik abscesu
13/60autovaccine.de
Staphylococcus aureus (2)
●
onemocnění:
– pyogenní: pyodermie (impetigo, folliculitis,
furunculus atd.), hnisání ran, abscesy vnitřních
orgánů, osteomyelitidy, bronchopneumonie,
endokarditidy, sepse, …
– infekce spojené s působením toxinů: exfoliativní
dermatitis (SSSS), syndrom toxického šoku,
enterokolitida
– intoxikace: stafylokoková enterotoxikóza
14/60
Staphylococcus aureus – bulózní
impetigo
●
velké puchýře, které rychle praskají a zůstávají po nich
červená mokvající ložiska, nejčastěji na obličeji
15/60.adhb.govt.nz
Staphylococcus aureus – impetigo
16/60pathmicro.med.sc.edu
●
puchýře uložené v epidermis naplněné hnisem,
typicky u dětí
Staphylococcus aureus – otitis
externa s furunklem
17/60merck.com
Staphylococcus aureus – infekce
kůže s krustami
18/60.dermatology.co.uk
Staphylococcus aureus – mozkový
absces
19/60
Koaguláza negativní stafylokoky
●
S. epidermidis, S. hominis, S. haemolyticus a asi
čtyřicet dalších druhů a poddruhů
●
hlavní součástí běžné bakteriální mikroflóry kůže
●
oportunní patogeny, možní původci močových infekcí
(hlavně S. saprophyticus), případně i infekcí ran,
katetrových sepsí aj.
●
nález se hodnotí jinak např. ve výtěru v nosu či ve
stolici, jinak v moči a zcela jinak v hemokultuře
20/60
Staphylococcus epidermidis
●
nejběžnější koaguláza negativní stafylokok
●
oportunní patogen
– nejčastěji neutropenici, imunokompromitovaní (tj.
i novorozenci), intravenózní uživatelé drog (heroin)
– nemocní se zavedenými či implantovanými
pomůckami (intravenózní katetry, umělé srdeční
chlopně, shunty, kardiostimulátory, permanentní
močové katetry, kloubní protézy, šrouby, …)
→ tvorba biofilmových infekcí
●
infekce krevního řečiště (bakteriémie), nejčastěji v
souvislosti se zavedenými intravenózními katetry
– může dojít ke katetrové sepsi s příznaky šoku
21/60
Přehled identifikačních metod
●
přímé metody (mikrob, jeho část, produkty)
– mikroskopie (průkaz ve vzorku i identifikace)
– kultivace (průkaz + identifikace)
– biochemická identifikace (jen identifikace)
– průkaz antigenu (průkaz + identifikace)
– průkaz NK (průkaz ve vzorku)
– pokus na zvířeti (průkaz ve vzorku)
●
nepřímé metody (průkaz protilátek)
22/60
Diagnostika rodu Staphylococcus
●
mikroskopie: G+ kok
●
kultivace: na KA kolonie větší (1-3 mm), ploché,
máslovité konzistence, pigmentované (nejčastěji
bílé, krémové, zvláště po delší kultivaci žluté až
nazlátlé – hlavně u zlatého stafylokoka)
●
biochemické testy: kataláza pozitivní, oxidáza
negativní, biochemicky lze rozlišit jednotlivé druhy
(např. STAPHYtest 16)
●
antigenní analýza a speciální testy možné
23/60
Dg. rodu Staphylococcus (2)
24/60
Autor: Prof. MVDr. Boris Skalka, DrSc.
Diferenciální diagnostika
stafylokoků
●
určení do rodu Staphylococcus:
– Gramovo barvení: rozlišení G+/G–, kok/tyčka
– kultivace na selektivní půdě (KA s 10 % NaCl, 6,5
% NaCl se využívá pro kultivaci enterokoků)
– katalázový test pozitivní (prokázání enzymu
katalázy, 3% H2O2), oxidáza negativní
●
rozlišení S. aureus od CoNS (koag. neg. stagylokoky)
– S. aureus má pozitivní koagulázu vázanou (clumping
factor) i volnou a hyaluronidázu
●
další rozlišení v rámci rodu pomocí komerčních
testů (např. STAPHYtest 16 atd.)
25/60
Diferenciální diagnostika
stafylokoků (2)
●
méně spolehlivá vodítka:
– CoNS produkuji je delta hemolyzin, zlatý stafylokok i
alfa a beta hemolyzin → S. aureus mívá výraznější
hemolýzu na KA
– S. aureus mívá větší průměr kolonií a nazlátlé
zbarvení (hlavně po delší kultivaci)
– S. aureus tvoří větší shluky v mikroskopii
26/60
Diferenciální diagnostika
stafylokoků (3)
27/60
Testování citlivosti na ATB
●
diagnostiku uzavírá testování citlivosti na antibiotika,
zpravidla difusním diskovým testem
●
konkrétní provedení může být různé
28/60
kvalitativní testy
kvantitativní testy
ATB terapie
●
u stafylokoků je lékem volby oxacilin
●
u močových infekcí cefalosporiny první generace
●
makrolidy jen u alergických osob
●
linkosamidy mají význam u infekcí pohybové soustavy
(dobrý průnik do kostní dřeně)
●
aminoglykosidy raději jen v kombinaci
●
glykopeptidová antibiotika (vankomycin a
teikoplanin) jsou rezervní
– u kmenů rezistentních na oxacilin, takzvaných MRSA
a MRSKN
– v případě rezistence nebo přílišné toxicity, lze také
použít linezolid a další nové látky 29/60
Detekce MRSA
●
meticilin rezistentní stafylokoky (MRSA) jsou
epidemiologicky závažné kmeny, často způsobující
nozokomiální infekce
●
příčinou je změna tzv. penicillin binding proteins (PBP)
– transpeptidázy účastnící se výstavby buněčné stěny
– kódovány genem mecA (PBP2a)
– beta-laktamy inhibují jejich účinek
●
na problém upozorní malá zóna u oxacilinu (může být
způsobena i jinými vlivy)
●
za průkazné se považuje, je-li malá zóna nejen u
oxacilinu, ale i u cefoxitinu
●
speciální kultivační půdy 30/60
Úkol 1: Mikroskopie infekčního
materiálu
●
prohlédněte si mikroskopický preparát hemokultury,
obarvený podle Grama
●
nezapomeňte přikápnout imerzní olej, použijte imerzní
objektiv 100×
●
pátrejte po grampozitivních kocích ve shlucích a
také po erytrocytech, případně leukocytech
31/60
Foto: O. Z.
Úkol 2a: Nativní preparát
●
plastové zkumavky obsahují výtěry rozmíchané v
médiu
●
kápněte na sklíčko, kapku překryjete krycím
sklíčkem a pozorujte epitelie, popř. leukocyty, a
mezi nimi mikroby
●
výsledky zakreslete a popište
32/60
Úkol 2a: Ukázka nativního
preparátu C. A. T.
33/60
●
epiteliální bb. s adherovanými bakteriálními buňkami (malé
tečky); pacientka s bakteriální vaginózou
Úkol 2b: Příprava fixovaného
preparátu, Gramovo barvení
●
obarvěte podle Grama čisté kultury předložených
mikrobů, výsledky pozorování zakreslete a zapište
●
Gramovo barvení:
– příprava: natřít, nechat uschnout, fixovat plamenem
– barvení: krystalová violeť 30 s, (voda), Lugolův
roztok 30 s, (voda), alkohol 15–20 s (do viditelného
výstupu barviva), voda, safranin 60 s, voda, osušit,
imerzní olej, imerzní objektiv zvětšující 100×
●
tři kmeny budou G+ koky, jeden G– tyčka
34/60
Úkol 3a: Tekuté půdy
●
pomnožovací:
– nejběžnější a univerzální
– bujón pro aerobní kultivaci a VL-bujón pro anaerobní
kultivaci (VL = viande-levure, obsahuje masokvasničný
extrakt)
●
selektivně pomnožovací:
– pomnožení určité bakterie a potlačení množení jiných
– selenitový bujón pro salmonely
●
obohacené pomnožovací:
– z kvalitnějších extraktů (např. BHI = mozkosrdcová
infuze), hydrolyzátů (kasein), vitamínů (kvasničný
hydrolyzát) atd. pro náročnější bakterie (streptokoky,→
hemofily, patogenní neisserie) 35/60
Úkol 3a: Pevné půdy
●
základní:
– základem je masopeptonový bujon, NaCl a 1,5 %
agaru
– pro málo náročné bakterie
– obohacené: přidávají se další složky jako cukry,
růstové faktory, krev atp.
●
diagnostické:
– přidání složek, které různě reagují na různé druhy
metabolismu
– krevní agar, půdy pro biochemické určení
mikrobů, půdy chromogenní a fluorescenční
36/60
Úkol 3a: Pevné půdy (2)
●
selektivní:
– látky potlačující růst některých skupin mikrobů,
podporují růst cílových mikroorganismů
– KA s 10 % NaCl pro stafylokoky
– KA s amikacinem pro streptokoky a enterokoky
– KA s azidem sodným pro enterokoky
●
selektivně diagnostické:
– kombinace dvou předchozích skupin
– ENDO – selektivní složka fuchsin, diagnostická
složka fuchsin odbarvený siřičitanem a laktóza)
– XLD, MAL – pro detekci salmonel
37/60
Úkol 3a: Půdy pro speciální účely
●
MH agar (Müllerův-Hintonové agar):
– in vitro testování citlivosti na antimikrobiální látky
– slouží zároveň ke sledování pigmentů bakterií
– podobný MPA – místo peptonu (brání difuzi
antimikrobiálních látek) kaseinový hydrolyzát a škrob
(detoxikuje některé metabolity mikrobů)
●
půdy pro sledování faktorů virulence:
– půda s kongočervení pro detekci stafylokokového biofilmu
– žloutková půda pro histotoxická klostridia
38/60
Úkol 3a: Půdy v klinické
mikrobiologii
39/60
Název Druh Barva Typ Bakterie
bujon tekuté půdy nažloutlá pomno-
žovací
aeroby
VL-bujon anaeroby
selenitový
bujon
selektivně
pomnož.
salmonely
Sabouraudův
agar
pevné půdy
ve
zkumavce
skoro
bezbarvá
selektivní* houby
Löwentein-
Jensen
bílá až velmi
světle
zelená
obohacená mykobakteria
(pův. TBC)
krevní agar pevné půdy
v misce
červená obohacená
diagnostická
většinu bakterií
Endova
půda
růžová selektivně
diagnostická
především
enterobakterie
*pokud je přidáno ATB
Název Druh Barva Typ Bakterie
MH pevné
půdy na
Petriho
miskách
skoro
bezbarvá
speciální atb citlivost
NaCl červená
-hnědá
selektivní stafylokoky
WCHA/VL-agar červená jako KA anaeroby
XLD (a blízký
MAL)
oranžová selektivně
diagnostická
salmonely
čokoládový
agar
hnědá obohacená hemofily,
neisserie
Hemofilový/
Levinthalův
agar
nažloutlá obohacená hemofily
Slanetz-Bartley světlounce
růžová
selektivně
diagnostická
enterokoky
Úkol 3a: Půdy v klinické
mikrobiologii (2)
40/60
Úkol 3b: Růst na krevním agaru
●
vyplňte tabulku na první straně v řádcích „Úkol č. 3“
●
do „jiných“ napište to zajímavé, co se nevejde jinam
●
snažte si povšimnout rozdílů mezi koloniemi
G+ koků a G– tyčky (zvláště pak pigmenty,
konzistence, hemolýza apod.)
41/60
Úkol 4: Růst bakterií na krevním
agaru s 10 % NaCl
●
selektivní půda pro stafylokoky
●
zhodnoťte schopnost růstu předložených kmenů na
krevním agaru s 10 % NaCl
●
zapište „+“ pokud kmen roste a „–“ pokud neroste
42/60
Úkol 5: Katalázový test
●
prokažte přítomnost enzymu katalázy
●
setřete kličkou kolonie předložených kmenů a vneste je
do kapky 3% H2O2 na podložním sklíčku
●
zaznamenejte reakci u všech kmenů, do tabulky pište
„+“ a „–“
●
nelze přeskočit předchozí kroky identifikace, pozitivní
katalázu má spousta bakterií, relativně průkazná je jen
tehdy, víme-li, že náš kmen je G+ kok
43/60
Úkol 6: Testy pro diferenciaci
S. aureus
●
6a) Test na clumping faktor (test vázané
plasmakoagulázy)
●
6b) Plasmakoagulázový test (test volné
plasmakoagulázy)
●
6c) Detekce hyaluronidázy
44/60
Úkol 6a: Test na clumping faktor
(test vázané plasmakoagulázy)
●
kolonie se vmíchají do kapky králičí plasmy na
podložním sklíčku
●
pozitivita se projeví jako tvorba sraženin či vloček
v kapce plasmy (viz obrázek na další obrazovce)
●
nejde vlastně o koagulaci, ale o aglutinaci plasmy
●
test není příliš spolehlivý
45/60
46/60
memiserf.medmikro.ruhr-uni-bochum.de
Úkol 6b: Plasmakoagulázový test
(test volné plasmakoagulázy)
●
klasický test pro odlišení zlatého stafylokoka (koaguláza
pozitivního stafylokoka)
●
kličkou nabrané kolonie vmícháme do králičí
plasmy ve zkumavce
●
pokud plasma koaguluje (má konzistenci želé), je
kmen koaguláza pozitivní
●
dejte pozor při zakreslování
do protokolu (volná hladina
vs. koagulovaná plazma)
47/60microbiology.scu.edu.tw
Úkol 6c: Detekce hyaluronidázy
●
hyaluronidáza produkovaná zlatým stafylokokem
(ne však koaguláza negativními stafylokoky) rozpouští
pouzdro (kapsulu) opouzdřených bakterií
●
používá se druh Streptococcus equii, pro člověka
nepatogenní
●
ztráta pouzdra se projeví změnou vzhledu streptokoka
(ztráta mukózního vzhledu v blízkosti S. aureus)
●
velmi levný a spolehlivý test (na rozdíl od clumping
faktoru)
●
najděte pozitivní kmen, který ve svém okolí
rozpustil slizový obal streptokoka
48/60
Úkol 6c: Detekce hyaluronidázy (2)
49/60
Úkol 6c: Detekce hyaluronidázy (3)
50/60
Úkol 6: Komerční testy
●
v praktiku je neprovádíme z důvodu finanční náročnosti
●
provedením připomínají clumping factor
●
jsou spolehlivější než volná koaguláza
51/60www.microbes-edu.org
Úkol 6: Komerční testy (Staphaurex)
52/60www.microbes-edu.orghttp://www.pathologyinpractice.com
Úkol 7: Bližší určení stafylokoků
pomocí biochemického mikrotestu
(STAPHYtest 16)
●
za normálních okolností zlaté stafylokoky
STHAPHYtestem neurčujeme, stačí nám testy z úkolů
6a, b a c, popřípadě komerční testy
●
test tedy slouží k diagnostice koaguláza
negativních stafylokoků
53/60
Úkol 7: Bližší určení stafylokoků
pomocí biochemického mikrotestu
(STAPHYtest 16) (2)
●
STAPHYtest 16, zahrnuje ve skutečnosti 17 reakcí
●
jako první se odečítá test VPT ve zkumavce,
červená tekutina ve zkumavce = pozitivní VPT,
bezbarvá tekutina = negativní
●
první řádek STAPHYtestu = 2. – 9. reakce
●
druhý řádek STAPHYtestu = 10. – 17. reakce
●
vypočítejte kód a porovnejte s kódovníkem
●
kód je šestimístný (prvních pět číslic je ze trojic testů,
šestá číslice je z dvojice)
54/60
Úkol 7: Bližší určení stafylokoků
pomocí biochemického mikrotestu
(STAPHYtest 16) (3)
●
1. kmen: 703 651 = S. aureus, 99,8 %, Tin=1,00
55/60
Úkol 7: Bližší určení stafylokoků
pomocí biochemického mikrotestu
(STAPHYtest 16) (4)
● 2. kmen 703 241 = S. epidermidis, 97,95 %,Tin=1,00
56/60
Úkol 8a: Citlivost stafylokoků k
antibiotikům
●
odečtěte difusní diskový test – změřte zóny a
porovnejte s referenčními zónami
●
máte k dispozici šestici antibiotik (FOX = cefoxitin, DA
= klindmycin, E = erythromycin, SXT = ko-trimoxazol,
TE = tetracyklin, C = chloramfenikol; v praxi se
používají dvě šestice, označované S1 a S2, my máme
test S1)
●
každý set je proveden na kmen STKN (koaguláza
negativního stafylokoka) a STAU (zlatého stafylokoka).
57/60
Úkol 8a: Citlivost stafylokoků k
antibiotikům – zóny citlivosti
58/60
Antibiotikum Zkr. „C“ je-li ≥
než (mm)
„I“ je-li
mezi
(mm)
„R“ je-li <
než (mm)
Cefoxitin (cefalosporin);
interpretace: oxacilin a další
CXT ≥
22/25*
22/25*
*
Erythromycin (macrolid) E ≥ 21 18–20 < 18
Clindamycin
(linkosamid)
DA ≥ 22 19–21 < 19
Ko-trimoxazol (směs) SXT ≥ 17 15–16 < 15
Tetracyklin (tetracyklin) TE ≥ 22 19–21 < 19
Chloramphenikol C ≥ 18 < 18
*CXT: 22 mm S. aureus, 25 mm koagulázanegativní stafylokoky
Úkol 8b: Demonstrace
screeningové půdy na MRSA
●
máte několik kmenů na speciální screeningové půdě pro
MRSA (opakování z jarního semestru)
●
modré kolonie jsou kolonie kmenů MRSA
●
jiné (růžové či bílé kolonie) jsou methicilin rezistentní
kolonie jiných stafylokoků, než je S. aureus
●
žádné kolonie znamenají, že jde o methicilin-citlivý
kmen
59/60
Po tomto cvičení byste měli umět:
●
popsat základní vlastnosti rodu Staphylococcus
●
jmenovat nejdůležitější druhy rodu, včetně
nejčastějších infekcí, které způsobují
●
popsat diagnostický proces, který vede k určení izolátů
až na úroveň druhu
●
popsat vztah virulenčních faktorů stafylokoků a nemocí,
popř. průběhu nemocí (např. vztah koagulázy a
abscesů atp.) a využití těchto vlastností při diagnostice
●
použít mikroskopii naivního a fixovaného preparátu
barveného Gramovým barvením v diagnostice
●
vhodně použít různé kultivační půdy pro diagnostiku
mikroorganismů
60/60