P02
Diagnostika streptokoků
Bi7170c (podzim 2017)
Osnova
●
rod Streptococcus
●
dg. rodu Streptococcus
●
úkoly
2/31
Rod Streptococcus
●
G+ koky, KAT-, OXI-
●
dvojice, řetízky
●
nepohyblivé
●
kultivace na KA
●
rozdělení dle hemolýzy (α – viridující, β – hemolitické,
γ – nehemolytické)
●
dělení dle Lancefieldové: antigenní skupiny, nejčastěji
A, B, C, E, F, G, H, ...
(skup. D – dnes enterokoky, S. bovis)
3/31
Přehled streptokoků
Změny na KA
α-hemolýza
(viridace)
Streptococcus pneumoniae
skupina „ústních streptokoků“
β-hemolýza Streptococcus pyogenes (sk. A dle
Lancefieldové)
Streptococcus agalactiae (sk. B dle
Lancefieldové)
skupina „non-A-non-B“ streptokoků
γ-hemolýza
(žádná)
streptokoky bez hemolýzy
4/31
Streptococcus pyogenes
●
streptos = ohebný, zkroucený jako řetěz; puon = hnis;
gennao = tvořit
●
group A streptococcus (GAS)
●
úplná β-hemolýza,
drobné kolonie
●
PYR test, bacitracinový test
●
původce akutní tonsilitidy (angíny), hnisavých
zánětů měkkých tkání (nekrotizující fasciitis),
spály, erysipelu (tzv. růže) a flegmón (neohraničených
bakteriálních zánětů), pneumonií, meningitid, sepsí;
●
pozdní následky (revmatická horečka, akutní
glomerulonefritida) - ASLO
5/31
Akutní tonsilitida (angína)
●
nejčastější bakteriální původce S. pyogenes
●
další původci: S. pneumoniae, staphylokoky, hemofily,
influenza virus, herpes viry, coxsackie viry, EBV, ...
●
horečka, oboustranná bolest v krku, zduřené uzliny
6/31
Spála (scarlatina)
●
angína s exantémem a projevy na sliznici (petechie)
●
streptokok produkuje pyrogenní (erytrogenní) toxin
7/31
Erysipel (růže)
●
ostře ohraničený zánět, nejčastěji v oblasti bérců a
obličeji
●
infekce kůže se šíří do kožních lymfatických cév, při
opakovaném poškození chronické lymfatické otoky
8/31
Streptococcus agalactiae
●
agalactia = porucha tvorby mléka (záněty mléčné žlázy
především u krav)
●
group B streptococcus (GBS)
●
neúplná β-hemolýza, větší kolonie
●
pozitivní CAMP test
●
původce močových infekcí (u žen
v urogenitálním traktu a GIT)
●
infekce novorozenců (sepse, pneumonie,
meningitidy)
●
infekce gravidních žen
9/31
„non-A-non-B“ streptokoky
●
β-hemolýza, ale nepatří ani do GAS (S. pyogenes) ani
do GBS (S. agalactiae)
●
faryngitidy (záněty hltanu), často přítomny bez
klinických projevů
●
S. dysgalactiae, S. equi
●
obyčejně se neurčují, v případě potřeby se blíže
identifikují průkazem antigenu
10/31
Streptococcus pneumoniae
●
„pneumokok“, dříve Diplococcus pneumoniae
●
dvoří dvojice (nikoli řetízky), lancetovitý
(kopíčkovitý) tvar buněk
●
α-hemolýza
●
opouzdřené buňky mají hlenovité kolonie (kapky oleje)
●
v R-fázi netvoří pouzdro
●
v malém množství i u zdravých osob
●
sinusitidy, pneumonie, otitis media, meningitidy,
sepse, endokarditidy
●
nepovinné očkování (Pneumo23, Prevenar13, Synflorix)
11/31
Streptococcus pneumoniae (2)
12/31
„Ústní streptokoky“
●
též alfa streptokoky nebo viridující streptokoky (obvykle
α-hemolytické streptokoky, kromě pneumokoka)
●
normální součástí mikroflóry ústní dutiny a částečně i
faryngu
●
fyziologicky se neustále dostávají v malém množství do
krve (ve velkém množství způsobují subakutní
bakteriální endokarditidy - adherují na poškozené
srdeční chlopně)
●
útvar na chlopni = „vegetace“ - forma biofilmu (matrix
tvoří krevní destičky a fibrin)
●
S. mutans – zubní kaz (nejrychleji tvoří org. kyseliny)
●
S. salivarius, S. sanguinis, S. mitis
13/31
„Ústní streptokoky“ (2)
14/31
Streptococcus salivarius K12
adherovaný k HEp-2 buňkám
Léčba
●
lék volby penicilin
●
při prokázaných alergiích makrolidy
●
léky další volby doxycyklin, kotrimoxazol, ampicilin, aj.
●
rezervní ATB vankomycin (zatím žádné rezistence)
●
testování in vitro citlivosti – difuzní diskový test na MH
agaru s krvinkami (na obyčejném MH agaru prakticky
nerostou)
15/31
Diagnostika streptokoků
●
mikroskopie: G+ koky
●
kultivace: na KA kolonie šedé až bezbarvé, většinou
drobné, S. agalactiae má větší kolonie
●
hemolýza: α- β- i γ-hemolýza
●
nerostou na KA s 10 % NaCl (půda pro stafylokoky),
ani na Slanetz-Bartley či žluč-eskulinové půdě (pro
enterokoky)
●
KAT-, OXI-
●
rezistentní na aminoglykosidy (společně s
enterokoky)
16/31
Diagnostika streptokoků (2)
●
streptokoky s αhemolýzou
(viridací)
lze dále určovat
biochemickými testy
●
např. při nálezu v
hemokultuře nebo likvoru
dourčujeme původce
●
vzorek z dutiny ústní či
krku nikoliv, jsou tam
běžnou flórou
17/31
●
streptokoky s β- a γhemolýzou
lze dále
určovat latexovou
aglutinací (protože mají
slabou biochem. aktivitu)
●
určení non-A-non-B
streptokoků dle
Lancefieldové
Diferenciální dg. streptokoků
●
hodnotíme hemolýzu (viridace, hemolýza částečná či
úplná, bez hemolýzy)
●
β-hemolýza:
– S. pyogenes (poz. PYR test a bacitracinový test)
– S. agalactiae (poz. CAMP test)
●
α-hemolýza:
– S. pneumoniae poz. optochinový test na rozdíl od
ostatních viridujících streptokoků
18/31
Diferenciální dg. streptokoků (2)
19/31
G+ kok
stafylokok streptokok enterokok
streptokok
s viridací
streptokok
s hemolýzou
streptokok
bez hemolýzy
S. pneumoniae
ústní streptokok
S. pyogenes (SAG)
S. agalactiae (SBG)
non-A-non-B streptokok
Úkol 1: Mikroskopie kmenů
●
obarvěte podle Grama všech osm kmenů
●
jeden z kmenů bude G- tyčinka (výsledek si
poznamenejte a dále s ním nebudeme pracovat)
20/31
Úkol 2: Kultivační a biochem. testy
●
Úkol 2a: Katalázový test k odlišení stafylokoků
– kolonie vmícháme do kapky H2O2
– POZ = bublinky (stafylokok dále s kmenem→
nepracujeme)
– NEG (streptokok nebo enterokok)
●
Úkol 2b: Růst na Slanetz-Bartleyově agaru
– POZ = růst kmenu (enterokok dále s kmenem→
nepracujeme)
– stejnému účelu sloužila i žluč-eskulinová půda
21/31
Úkol 3: Kultivace na KA
●
pozorujte a zapište typ hemolýzy (viridace,
částečná hemolýza, úplná hemolýza, beze změny)
●
popište další vlastnosti kolonií (snažte si
povšimnout rozdílů mezi jednotlivými kmeny, tj.
různých velikostí, pigmentace, typu hemolýzy apod.)
22/31
Úkol 4: Streptokoky s viridací
●
Úkol 4a: Optochinový test
– odlišení S. pneumoniae od ostatních viridujících
streptokoků
– pneumokok je citlivý k optochinu, neměříme zónu
inhibice (optochin se dnes již nepoužívá léčebně,
zůstal jen v diagnostice)
●
Úkol 4b: Biochemické určení „ústního“ streptokoka
– streptokoky z likvoru a hemokultur
– STREPTOtest 16 (17 reakcí: 1. je VPT, 2. až 9. jsou
v prvním řádku, 10. až 17. jsou ve druhém řádku)
23/31
Úkol 5: Streptokoky s hemolýzou
●
Úkol 5a: PYR test
– diagnostický proužek
– kolonie se umístí na reakční plošku proužku, po 10
minutách se přikápne činidlo
– POZ = červené zbarvení
●
Úkol 5b: CAMP test
– příklad synergického působení dvou hemolyzinů,
a to hemolyzinu S. agalactiae a β-hemolyzinu
S. aureus
– nelze použít k dg. S. aureus (ne všechny zlaté
stafylokoky produkují β-hemolyzin)
24/31
Úkol 5b: CAMP test
25/31
●
na agar se naočkuje laboratorní kmen zlatého
stafylokoka tvořící β-hemolyzin, kolmo k němu se
očkují testované kmeny
Úkol 5c: aglutinační test
●
lahvičky se směsí latex.
částic s navázanými
protilátkami
●
z obrázku určete, se
kterým testovaným
sérem kmen aglutinuje
26/31
Úkol 6: test citlivosti na ATB
●
odečtěte difusní diskový test – změřte zóny a
porovnejte s referenčními hodnotami
●
horší patogeny většinou citlivější než mírnější
patogeny
●
využíváme MH agar s krvinkami (na běžném MH by
většina streptokoků nevyrostla)
27/31
Úkol 7: Dg. pozdních následků
streptokokových infekcí - ASLO
●
po každé streptokokové infekci protilátky, vč. protilátek
proti streptolyzinu O (streptokokový toxin)
●
v případě, že množství těchto protilátek po infekci
stoupá, zkříženě reagují s některými strukturami
organismu → pozdní následky streptokokových
infekcí
●
revmatická horečka, akutní glomerulonefritida
●
ASLO: zjištění míry protilátkové odpovědi po
prodělané streptokokové infekci (neprokazujeme tedy
infekci – ta už proběhla – ale zda nedochází k vývoji
autoimunitní reakce)
28/31
Úkol 7: ASLO
●
neutralizace hemolýzy
●
streptolyzin O za běžných okolností (nepřítomnost
protilátek) hemolyzuje červené krvinky
NEG = hemolýza
●
v přítomnosti protilátky antistreptolyzinu O dochází
k zábraně hemolýzy a krvinky mohou sedimentovat
POZ = zábrana hemolýzy
●
titr nad cca 200 m.j. riziko pozdních následků
29/31
Jamka 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Hodnota
m.j.
100 120 150 180 225 270 337 405 506 607 759 911
Pozdní
následky
nehrozí
hra-
niční
hrozí
Úkol 7: ASLO (2)
●
destička se odečítá naležato, první řádek je
pozitivní kontrola
●
další řádky jsou jednotliví pacienti
●
hodnoty ředění jsou uvedeny v protokolu
30/31
Po tomto cvičení byste měli umět:
●
popsat zástupce rodu Streptococcus, vč. diagnostických
postupů, které vedou k úspěšné identifikaci
●
zhodnotit možnost tvorby biofilmu na srdečních
chlopních a případných následků tohoto stavu
●
vysvětlit význam testu ASLO a vysvětlit vztah
k pozdním následkům streptokokových infekcí
31/31