P03
Základy biochemické
identifikace bakterií
Diagnostika některých
dalších grampozitivních
bakterií
Bi7170c (podzim 2017)
Osnova
●
biochemické identifikační metody substrátové
– metody rychlé, metody s kultivací
●
nesubstrátové identifikační metody
●
rod Enterococcus
●
G+ tyčky
●
diagnostika enterokoků a G+ tyček
●
úkoly
2/58
Přehled identifikačních metod
●
přímé metody (mikrob, jeho část, produkty)
– mikroskopie (průkaz ve vzorku i identifikace)
– kultivace (průkaz + identifikace)
– biochemická identifikace (jen identifikace)
– průkaz antigenu (průkaz + identifikace)
– průkaz NK (průkaz ve vzorku)
– pokus na zvířeti (průkaz ve vzorku)
●
nepřímé metody (průkaz protilátek)
3/58
Biochemická identifikace
●
rozdíly v metabolismu mezi bakteriemi
●
bakterie mění substrát (cukry, AMK, apod.) v produkt(y)
●
přednostně se metabolizují cukry před AMK
●
ideálně se produkt a substrát liší skupenstvím nebo barvou
●
pokud se neliší, užijeme vhodný indikátor
●
sledujeme více než jeden znak (atypické kmeny, možnost
rozlišit více rodů a druhů)
●
% pravděpodobnosti
●
index typičnosti (shoda s „ideálním“ kmenem:
Tin = 1,00)
4/58
% pravděpodobnosti, Tin
● 99 %, Tin = 0,95
ideální stav
● 99 %, Tin = 0,63
atypický kmen nebo chyba diagnostiky
● 49,5 %, Tin = 1,00
test je typický pro dva taxony, musíme dále rozlišit
pomocí jiného testu
5/58
Rychlé biochemické testy
●
katalázový test
– kataláza – antioxidační enzym, chrání před
oxidačním stresem
– do substrátu (H2O2) rozmícháme bakterie
– POZ = viditelné bublinky
6/58
Testy s diagnostickými proužky
●
Oxidáza – cytochromoxidázový test
– využívání cytochrom c oxidázy pro produkci energie
– OXI+ (bakterie využívá cytochrom c oxidázu, a tedy
O2 jako terminální akceptor elektronů pro produkci
energie); P. aeruginosa,
V. cholerae
– OXI- (bakterie využívá
pro produkci energie jiné
cytochromy, nebo O2 pro
produkci energie
nevyužívá vůbec);
většina rodů čeledi
Enterobacteriaceae
7/58
Testy s diagnostickými proužky (2)
●
PYR test
– enzym PYRáza (pyrrolidonyl arylamidáza)
– odlišení S. pyogenes od ostatních β-hemolytických
streptokoků
●
INAC test (Indoxyl-acetátový test)
– odlišení M. catarrhalis od N. meningitidis a
N. gonorrhoeae
●
stripy pro detekci běžných β-laktamáz
8/58
Jednoduché zkumavkové testy
●
přednostně se metabolizují cukry před AMK:
– cukry org. kyseliny→ → pH klesá
– AMK deaminace vznik amoniaku→ → → pH roste
– metabolizování komplexního média:
●
pH nejdříve klesá (dokud jsou k dispozici cukry) →
pH opět roste (metabolizovaní AMK)
●
acidobazické indikátory:
– detekce změn pH v průběhu růstu mikrobů
– detekce utilizace konkrétních substrátů (např.
cukrů nebo AMK
9/58
Jednoduché zkumavkové testy (2)
●
acidobazické indikátory:
– fenolová červeň
●
běžně používaná pro
buněčné kultury a
biochemické testy
– bromthymolová modř
●
sledování fotosyntetické
aktivity a biochemické testy
10/58
Jednoduché zkumavkové testy (3)
●
substrát je rozpuštěn v tekutině, přimícháme testovaný
kmen změna zbarvení v celém objemu, nebo jako→
prstenec u hladiny
– arabinózový test pro rozlišení E. faecalis a E. faecium
POZ = žlutá (E. faecium)
NEG = zelená (E. faecalis)
●
kmen je rozmíchán v tekutině, přidáme proužek
napuštěný substrátem
– VPT test pro detekci tvorby acetoinu (POZ = červená)
– ONPG test pro detekci β-galaktosidázy (nezbytná pro
utilizaci laktózy); rozlišení rodů Citrobacter (POZ =
žlutá) a Salmonella (NEG = bezbarvá)
●
o-nitrofenol (žlutý) + galaktóza (bezbarvá)
11/58
Jednoduché zkumavkové testy (4)
●
agar obsahující substrát
– Citrát dle Simmonse pro detekci růstu bakterií na
citrátu jako jediném zdroji uhlíku;
rozlišení Enterobacter aerogenes
(POZ = modrá) a
E. coli (NEG = tmavě zelená)
12/58
Složité zkumavkové testy
●
test (půda) MIU (Motility, Indol, Urea)
– pohyb – pohyblivé bakterie se rostou do okolí
vpichu, nepohyblivé podél vpichu
– tvorba indolu – po přidání Kovácsova činidla se
vytvoří červený prstenec
– štěpení urey – půda se zbarví fialově
13/58
Složité zkumavkové testy (2)
●
Hajnova půda (Kligler's Iron Agar, KIA)
– štěpení laktózy (A = NEG, B = POZ)
– štěpení glukózy (C = NEG, D = POZ)
– produkce H2S (POZ = zčernání půdy)
– tvorba plynu (POZ = potrhaná půda,
bublinky, půda vysunutá nahoru)
– očkování vpichem
a tzv. hádkem
14/58
Příklad vyhodnocení Hajna+MIU
Test Hajna MIU
Reakce Glc Lac H2
S Mot Ind Ure
Pseudomonas
aeruginosa
- - - - - +
Escherichia coli + + - + + -
Proteus
mirabilis
+ - + + - +
Salmonella
enterica
+ - + +/- - -
Citrobacter
freundi
+ +/- (+) + - -
15/58
Testy v plastových panelech
●
miniaturizace sady jednoduchých zkumavkových testů
●
počty testů v sadách se liší
●
destičky s lyofilizovanými substráty
●
přidání suspenze bakterií ve fyz. roztoku nebo
v dodaném suspenzním médiu
●
zbytek bakteriální suspenze se využije jako
zkumavkový test (VPT, ONPG)
●
u nás nejběžnější testy od firmy Erba Lachema
(např. STAPHYtest 16, STREPTOtest 16, ENTEROtest
16, NEFERMtest 24, apod.)
16/58
Testy v plastových panelech (2)
●
NEFERMtest 24 (Erba Lachema)
– jeden test tvoří tři řádky
po osmi jamkách
●
API 20 E (bioMérieux)
– princip stejný, provedení se
mírně liší
17/58
Vyhodnocení destičkových testů
●
oktalové kódy podle poz. a neg. výsledků
●
trojici výsledků se přiřadí číslice od nuly po sedmičku
(dvojice výsledků pak číslice nula až tři)
●
kód vyhledáme v kódové knize nebo v příslušném
softwaru
18/58
Další identifikační testy
●
zkoumání další enzymové výbavy či faktorů virulence
– schopnost koagulovat králičí plazmu
– hyaluronidázový test
– diagnostické použití ATB (optochin, bacitracin)
– chromogenní půdy
●
nové identifikační metody
– MALDI-TOF (ionizace laserem za přítomnosti matrice,
spojení s detektorem doby letu)
19/58
Chromogenní půdy
●
selektivně diagnostické půdy
●
chromogen = molekula, která využita jako substrát
mikrobem mění barvu různé barvy kolonií podle→
utilizovaného chromogenu
●
chromogen = substrát + chromofor
●
podobnost s ONPG testem
(ONPG je bezbarvý,
o-nitrofenol žlutý)
●
URIselect, půdy pro
kandidy, MRSA, listerie atd.
20/58
MALDI-TOF
●
rozdělení nabitých částic podle jejich molekulových
hmotností v elektrickém/magnetickém poli
●
díky matrici lze analyzovat i velké biomolekuly (při
přímé ionizaci vzorku laserem dochází ke štěpení molekul
nežádoucím způsobem)
●
směs vzorku a matrice je ionizována laserem ionty→
analyzované látky jsou urychleny silným elektrickým
polem vstupují do trubice detektoru měření doby→ →
letu částice výpočet poměru molekulové hmotnosti a→
náboje částice
●
hmotnostní spektrum se poté porovnává se
známými profily uloženými v knihovně
21/58
MALDI-TOF (2)
●
Matrix-assisted laser desorption/ionization –
Time of flight
22/58
MALDI-TOF (3)
23/58
MALDI-TOF (4)
●
příklady spekter
24/58
Rod Enterococcus
●
G+ koky, ve dvojicích nebo krátkých řetízcích
●
fakultativně anaerobní, KAT-, OXI-
●
vysoce odolné: až 6,5 % NaCl, 40 % žluči, azid
sodný (půda Slanetz-Bartley), pH 4,8 až 11,
půlhodinové zahřátí na 60 °C, primární rezistence na
cefalosporiny
●
součástí normální mikroflóry střeva
●
původci močových infekcí, nozokomiální kmeny jsou
často rezistentní (bakteriémie, katetrové sepse,
meningitidy, endokarditidy, inf. žlučových cest, …)
●
E. faecalis (90 %), E. faecium (5–10 %)
●
VRE – vankomycin rezistentní enterokoky 25/58
Rod Enterococcus (2)
●
G+ koky, dvojice, řetízky
●
žluč eskulinový agar (tmavě hnědé
až černé drobné kolonie nebo zbarvují
dvorec kultivační půdy černě)
●
půda Slanetz-Bartley (růžové až červené kolonie)
26/58
medmicro.info;
prof. MVDr. Boris Skalka, DrSc.
Rod Listeria
●
G+ tyčky, krátké,
●
fakultativně anaerobní, KAT+
●
odolné (růst při vyšších koncentracích NaCl nebo
žlučových solí, růst při nízkých teplotách)
●
L. monocytogenes (listerióza), L. ivanovi (listerióza
ovcí)
●
listerióza:
– nejčastěji alimentární infekce (nedostatečně
pasterované mléko, sýry, krůtí a drůbeží maso,
zelenina)
– nejčastěji probíhá bezpříznakově, popř.
nevolnost, zvracení, průjem
27/58
Rod Listeria (2)
●
listerióza:
– nejnebezpečnější u oslabených jedinců (nemoc,
stáří, gravidita)
– infekce ran, meningitida, meningoencephalitida nebo
encefalitidami dospělých
– infekce placenty, plodových obalů a celkové
generalizované onemocnění plodu provázeného
sepsí
– potraty ve druhém a třetím trimestru, narození
mrtvých nebo těžce nemocných novorozenců
(umírají brzy po porodu)
28/58
Koryneformní tyčky („difteroidy“)
●
termín používaný zpravidla pro nesporulující G+
tyčky, kyjovitého tvaru, někdy rovné či zahnuté
●
v minulosti všechny v rodu Corynebacterium
●
vytvořeny nové rody (Arcanobacterium, Rhodococcus,
Dermatophilus, Turicella, …)
●
Arcanobacterium haemolyticum – tonsilitidy, infekce
ran; KAT-, reverzní CAMP test
●
Rhodococcus equi – infekce imunokompromitovaných
pacientů (transplantace, AIDS)
29/58
Reverzní CAMP test
30/58
Rod Corynebacterium
●
G+ nesporulující tyčky
kyjovitého tvaru,
někdy pleomorfní
●
typické uspořádání
v palisádách a
tzv. havraních křídlech
●
fakultativně anaerobní, půdy s teluričitanem
●
odolné k vyschnutí a NaCl, nerostou na agaru bez
přídavku krve
●
Corynebacterium diphtheriae
●
nedifterická (=nezáškrtová) korynebakteria
(součást mikroflóry kůže)
31/58
Corynebacterium diphtheriae
●
původce záškrtu (diftérie)
●
difterický toxin (nezbytná přítomnost genu tox,
přenášený β-bakteriofágem, ireverzibilně blokuje
proteosyntézu zánik infikované buňky)→
●
pseudomembrána z fibrinu, pod níž jsou bakterie
produkující toxin nekróza okolních buněk→
●
pseudomembrány vznikající ve sliznici HCD mohou
vést k jejich mechanické obstrukci, edému sliznice a
následně k udušení
●
akutní infekce léčena podáním antitoxinů
●
prevence očkováním (hexavakcína)
32/58
Corynebacterium diphtheriae (2)
masivní zvětšení krčních
uzlin u diftérie
33/58
pseudomembrána
Nedifterická korynebakteria
●
součástí běžné mikroflóry kůže
●
infekce ran, katétrové sepse, postihují vnitřní orgány
při průniku do organismu
●
Corynebacterium jejkeium:
– dříve „korynebakterium skupiny JK“
– nozokomiální infekce (až 40 % hospitalizovaných
pacientů, zřídka na kůži zdravých jedinců)
– katétrové sepse, polyrezistence
●
Corynebacterium pseudotuberculosis – lymfadenitidy,
pneumonie, záněty kůže
●
Corynebacterium urealyticum – pyelonefritidy, cystitidy
34/58
Rod Bacillus
●
G+ tyčky, robustní, rovné až konkávní konce, tvoří
endospory, často pohyblivé, obvykle KAT+
●
většina zástupců běžně přítomna v prostředí (tvorba
endospor)
●
v klinickém prostředí časté kontaminace
●
podle morfologie spor rozdělení do tří skupin:
– oválné spory, nevyklenují buňku (B. anthracis,
B. cereus, B. subtilis, ...)
– oválné spory, vyklenují buňku
(G. stearothermophilus, B. polymyxa, ...)
– sférické spory, vyklenují buňku (B. sphaericus)
35/58
Rod Bacillus (2)
●
rozdělení dle morfologie endospor:
36/58
Bacillus anthracis
●
obligátní patogen, původce anthraxu (sněť
slezinná, uhlák)
●
plicní anthrax: spory pronikají do plicních alveolů →
makrofágy do mediastinálních uzlin (zpočátku
připomíná chřipkovité onemocnění) hemoragická→
nekróza uzlin a bakteriémie septický šok a respirační→
selhání; bez včasného podání ATB letalita až 100 %
●
kožní anthrax: papula v místě vstupu vřed se→
silným edémem a hemoragickou nekrózou v centru →
regionální lymfadenitida sepse u neléčení infekce→
●
střevní anthrax: nauzea, zvracení, horečka, bolesti
břicha, krvavé průjmy sepse; letalita až 50 %→
●
lékem volby jsou penicilinová ATB 37/58
Další druhy rodu Bacillus
●
B. cereus – součástí střevní mikroflóry, alimentární
enterotoxikózy při přemnožení; devastující infekce oka
●
B. subtilis, Geobacillus (dříve Bacillus)
stearothermophilus – spory přežívají vysoké teploty,
indikátory účinnosti sterilizátorů
38/58
Léčba infekcí způsobených
enterokoky a G+ tyčkami
●
enterokoky a listerie rezistentní na cefalosporiny
●
E. faecalis ampicilin, E. faecium je k ampicilinu
primárně rezistentní
●
ko-trimoxazol, doxycyklin, jako rezerva vankomycin
●
vankomycin rezistentní kmeny (VRE)
– zejména u hematoonkologických pacientů
– linezolid (oxazolidinony, inhibice proteosyntézy)
– quinupristin/dalfopristin (streptograminy, inhibice
proteosyntézy)
39/58
Enterokoky Listerie Koryneform. Bacillus
G+ koky
v krátkých
řetízcích
G+ tyčky,
mohou tvořit
řetízky či
palisády
G+ tyčky
skládající se
vedle sebe
(palisády,
„havraní
křídla“)
G+ robustní
tyčky,
sporulující
(nemusí být
viditelné)
šedavé,
velké asi
jako S.
agalactiae,
většinou bez
hemolýzy,
ale i s virid.
či hemol.
podobné
entero-
kokům,
hemolýza je
či není
velmi drobné
kolonie
(podobné
mouce)
plsťovité
kolonie,
někdy i
výrazná
hemolýza
Enterokoky a G+ tyčky:
přehled kultivace a mikroskopie
40/58
MikroskopieKultivace
Diagnostika enterokoků
●
biochemické testy: KAT-, štěpení arabinosy
(E. faecalis neštěpí, půda je zelená, E. faecium štěpí,
žlutá), ENCOCCUStest
●
antigenní analýza: zpravidla se nepoužívá (dle
Lancefieldové antigenní skupina D
●
citlivost lze testovat na běžném MH agaru bez krve
●
speciální půdy na skríning VRE
41/58
Diferenciální diagnostika
enterokoků
●
Gramovo barvení: grampozitivní koky, grampozitivní
tyčinky a ostatní bakterie
●
stafylokoky: KAT+, růst na agaru s 10 % NaCl
●
streptokoky: nepřítomnost růstu na Slanetz-Bartleyho
či žluč-eskulinové půdě, popř. PYR testem (kromě
S. pyogenes negativní)
●
enterokoky: růst na Slanetz-Bartleyho či
žluč-eskulinové půdě, PYR test pozitivní
●
vzájemné rozlišení enterokoků arabinózovým testem
nebo složitějším ENCOCCUS testem
42/58
Diagnostika G+ tyček
●
biochemické testy: KAT+ (Arcanobacterium KAT–),
biochemicky lze rozlišovat koryneformní tyčinky
navzájem (API Coryne, Remel)
●
růst při nízkých teplotách, vysokých koncentracích
NaCl a hemolytické interakce se používají v diagnostice
listerií
●
průkaz antigenu – např. průkaz difterického toxinu
Elekovým testem
43/58
Diferenciální diagnostika G+ tyček
●
u G+ tyčinek ale není jednoznačný algoritmus!
●
Gramovo barvení: odliší grampozitivní tyčinky od
ostatních (bacily robustní tyčky, často tvorba endospor
●
bacily kultivačně charakteristické (velké plsťovité
kolonie)
●
druhové určení je možné biochemickými testy, testy
citlivosti na antibiotika apod.
●
pokud tyčky nesporulují a nejsou robustní, mělo
by jít o listerie nebo některou z koryneformních
tyček (samotná nepřítomnost endospory není důkaz!)
●
další rozlišení je možné biochemicky, růstem při
různých teplotách, testy hemolytických interakcí
(synergismů, antagonismů) apod. 44/58
Úkol 1: Mikroskopie kmenů
●
obarvěte podle Grama osm kmenů
●
G+ koky, G+ tyčky, jeden kmen G– tyčka
●
Bacillus – robustní tyčinky, někdy s nálezem
centrálně až subterminálně uložených endospór, jež
mohou, ale nemusí vyklenovat tyčku
●
Listeria – mikroskopicky drobnější než Bacillus,
neuspořádané v palisádách, ale spíše v krátkých
řetízcích
●
Corynebacterium – kyjovité, uspořádané do palisád či
„havraních křídel“
45/58
Úkol 2: Morfologie kolonií G+ koků
a tyčinek
●
popište kolonie, odhadněte rody bakterií
●
Bacillus – velké, ploché, suché, plsťovité kolonie,
„rozlézající“ se po povrchu agaru, někdy s výraznou
hemolýzou, jindy zcela bez ní
●
Listeria – bezbarvé až našedlé kolonie, velmi
podobné enterokokovým, bez hemolýzy nebo s
hemolýzou
●
Corynebacterium (a blízké rody) – šedavé nebo
bělavé kolonie podobné stafylokokovým, ale někdy i o
hodně menší, většinou bez hemolýzy
46/58
Úkol 3: Některé běžné biochemické
a kultivační testy
●
úkol 3a: katalázový test (Listeria, Corynebacterium i
Bacillus pozitivní)
●
úkol 3b: růst na Slanetz-Bartleyho půdě (pro
enterokoky, pozitivní jsou ty, které nejen rostou, ale
navíc mají typickou růžovou až červenohnědou barvu)
●
úkol 3c: růst na žluč-eskulinové půdě (pro
enterokoky a listerie, pozitivní jsou černé kolonie)
47/58
medmicro.info;
prof. MVDr. Boris
Skalka, DrSc.
Úkol 4: Vzájemné rozlišení
enterokoků
●
úkol 4a: arabinózový test pro druhové rozlišení dvou
nejběžnějších druhů enterokoků (E. faecalis neštěpí,
půda je zelená, E. faecium štěpí, žlutá)
●
úkol 4b: ENCOCCUStest (vyhodnoťte podle návodu,
pouze 8 reakcí, neurčujte index typičnosti a %
pravděpodobnosti)
48/58
Úkol 5: Další metody k diagnostice
listerií
●
úkol 5a: růst listerií při 4 °C (listerie je schopna
růst při nízkých teplotách; některé druhy yersinií a
pseudomonád také.)
●
úkol 5b: demonstrace růstu Listeria monocytogenes
na chromogenní půdě (půda ALOA, modré
zbarvení všech kolonií listerií, přičemž patogenní
druhy navíc mají kolem sebe halo (odlišně zbarvené
okolí kolonie).
49/58
Úkol 5b: Chromogenní půda ALOA
50/58
HALO
modré zbarvení všech kolonií listerií, patogenní druhy
mají kolem sebe halo
Úkol 6: Vztah enterokoků a G+
tyčinek k antibiotikům
●
úkol 6a: odečtěte diskový difuzní test
●
úkol 6b: demonstrace testu citlivosti u kmene
Enterococcus faecium (k ampicilinu primárně
rezistentní)
●
úkol 6c: demonstrace kmene VRE
51/58
Úkol 7: Demonstrace Elekova testu
●
precipitace mezi toxinem z toxického kmene a
antitoxinem z papírového proužku napuštěného
antisérem
52/58
Úkol 8a: Oxidázový test
●
filtrační papírek na diagnostickém proužku napuštěný
příslušným reagens přitiskněte na kolonie
testovaného kmene
●
proužek položte do víčka Petriho misky otisknutými
koloniemi nahoru
●
POZ = do 30 s intenzivní
modré zbarvení
●
OPOŽDĚNĚ POZ = do 2 min
intenzivní modré zbarvení
●
NEG = beze změny nebo
modrání až po uplynutí 2 min
53/58
Úkol 8b: produkce β-galaktosidázy
ONPG-test
●
filtrační papírek na diagnostickém proužku napuštěný
vhodným reagens (o-nitrofenyl-β-D-galaktopyranosid)
se vloží do suspenze připravené z kultury
testovaného kmene
●
β-galaktosidáza štěpí ONPG na o-nitrofenol (žlutý) a
galaktózu (bezbarvá)
●
inkubace v termostatu,
výsledek reakce odečítáme
po 4 hodinách
●
POZ = zežloutnutí suspenze
●
NEG = beze změny
54/58
Úkol 8c: Hajnova půda
●
Hajnova půda
– štěpení laktózy (nahoře)
(A = NEG, B = POZ)
– štěpení glukózy (dole)
(C = NEG, D = POZ)
– produkce H2S
(POZ = zčernání půdy)
● v případě pozitivity H2S
v podstatě nelze posoudit
fermentaci glukózy!
– tvorba plynu
(POZ = potrhaná půda,
bublinky, půda vysunutá
nahoru)
55/58
Úkol 8d: MIU
●
pohyb – pohyblivé bakterie se rostou do okolí vpichu,
nepohyblivé podél vpichu
●
tvorba indolu – POZ = červený prstenec
●
štěpení urey – POZ = půda se zbarví fialově
56/58
Úkol 8: Vyhodnocení Hajna+MIU
Test Hajna MIU
Reakce Glc Lac H2
S Mot Ind Ure
Pseudomonas
aeruginosa
- - - - - +
Escherichia coli + + - + + -
Proteus
mirabilis
+ - + + - +
Salmonella
enterica
+ - + +/- - -
Citrobacter
freundi
+ +/- (+) + - -
57/58
Po tomto cvičení byste měli umět:
●
vysvětlit význam a podstatu biochemických
identifikačních metod v mikrobiologii
●
popsat nejběžnější testy, které se v mikrobiologii
využívají a spojit je s konkrétní příklady využití
v diagnostice a umět provést nejběžnější testy
●
popsat zástupce rodu Enterococcus a hlavní klinicky
významné G+ tyčky, vč. diagnostických postupů, které
vedou k úspěšné identifikaci
●
diskutovat význam VRE, jejich diagnostické a
terapeutické možnosti
●
obecně vysvětlit princip a význam precipitace v agaru a
popsat Elekův test
58/58