P04 | Dekontaminační metody | | Diagnostika enterobakterií a | bakteriálních původců gastrointestinálních infekcí Bi7170c (podzim 2017) Osnova • dekontaminační metody - desinfekce, vyšší stupeň desinfekce - sterilizace - mytí a dezinfekce rukou • čeleď Enterobacteriaceae • rod Campylobacter, rod Helicobacter • čeleď Vibrionaceae • úkoly Bakterie a vnější prostředí • fyzikální a chemické faktory - optimum - inhibiční mez (mez růstu) - baktericidní mez (mez přežití) , © i © | © | © | © dolní mez přežití dolní mez růstu ^ horní mez růstu horní mez přežití (letální, mikrobicidní) (inhibiční) °Ptimum (mez množení) (usmrcující hodnota) 3/54 Dekontaminace * fyzikální a chemické postupy likvidace mikrobu, hmyzu a hlodavců mimo organismus - likvidace hmyzu a hlodavců někdy zvlášť (asanace) - nezařazujeme likvidaci mikrobů v organismu (ani lokální, tzn. antiseptika) * baktericidní mez = kombinace intenzity působícího faktoru (faktorů) a času 4/54 Přehled dekontaminačních metod • předpis č. 306/2012 Sb. • Vyhláška o podmínkách předcházení vzniku a šíření infekčních onemocnění a o hygienických požadavcích na provoz zdravotnických zařízení a ústavů sociální péče Sterilizace Zničení všech mikrobů v daném prostředí Vyšší stupeň desinfekce Zničení naprosté většiny mikrobů, některé formy života mohou přežívat (cysty prvoků a pod.) Dezinfekce Zničení patogenních mikrobů (závisí na okolnostech) Dezinsekce Zničení škodlivého hmyzu Deratizace Zničení škodlivých hlodavců 5/54 I Asepse a antisepse přístup: - pasivní -> asepse - aktivní -> antisepse - předpokládá se primárně sterilní nebo patogenů prosté prostředí, bráníme kontaminaci vzorku - pracovní postupy, sterilní/jednorázové pomůcky, uspořádání pracovních prostor, ... antisepse: - dezinfekce, sterilizace (někdy též použití antiseptik) 6/54 I Zásady správné dekontaminace • výběr vhodné metody/prostředku • vhodný: - musí bezpečně ničit všechny organismy (sterilizace) - musí bezpečně ničit všechny patogenní organismy (dezinfekce) - nesmí ničit sterilizovaný/dezinfikovaný materiál - musí být prakticky použitelný • použití dostatečné intenzity a doby působení 7/54 I Kroky před a po dekontaminaci • před dekontaminací je časté mechanické očištění (např. chirurgické nástroje) a osušení, postupy upravuje vyhláška - u rukou postupujeme obráceně (dezinfekce -> mýdlo) • po dekontaminaci mohou následovat oplach nebo odvětrání působící chemikálie, uchování dekontaminovaných předmětů • uchovávání (tj. doba, jak dlouho předmět vydrží sterilní) upravuje vyhláška 8/54 Dezinfekce * fyzikální metody: - var za atmosférického tlaku (nejméně 30 minut) - varv přetlakových nádobách (nejméně 20 minut) - UV záření, filtrace, žíhání, spalování - pasterizace • ošetření nízkou teplotou po dlouhou dobu (LTLT: Low Temperature - Long Time) • např. mléko při teplotě 62,5 °C po 30 minutách • ošetření vysokou teplotou po krátkou dobu (HTST: High Temperature - Short Time) - např. mléko při teplotě 72 °C za 15 sekund • UHT (Ultra High Temperature) - např. mléko a smetana na 135 - 150 °C po 1 - 2 sekun^_4 Dezinfekce (2) * chemické metody: - oxidační činidla: • peroxidy: peroctová kyselina (CH3COOOH, Persteril), působí i na spory, houby, TBC; 0,5% roztok = vyšší stupeň dezinfekce; nevýhody: agresivita, nestabilita, odbarvování textilií • peroxid vodíku (H202), podobné účinky, méně agresivní, ale také méně účinný • chlorové preparáty: chlornan sodný (NaClO, Savo), chlornan vápenatý (Ca(CIO)2, chlorové vápno), chloramin (chloramin T, dříve chloramin B) 10/54 Dezinfekce (3) * chemické metody: - oxidační činidla: • jodové preparáty: jodová tinktura; Jodonal B, Jodisol, Betadine obsahují jód v komplexu • manganistan draselný (již se nevyužívá) - formaldehyd (konzervace, ve směsích), kresol - ethanol (70% roztok, ve směsích) - tenzidy: Orthosan BF 12, Ajatin, Septonex - anorganické kyseliny a zásady - těžké kovy - kombinované přípravky (Incidur) I Spektrum účinku dezinfekce • A = baktericidní (usmrcují vegetativní formy bakterií a mikroskopické kvasinkové houby) • B = virucidní (usmrcují viry) • C = sporocidní (inaktivují spory bakterií) • T = tuberkulocidní (působí na původce tuberkulózy) • M = mykobaktericidní (působí i na atypická mykobakteria) • V = fungicidní (působí proti mikroskopickým kvasinkám i vláknitým houbám) 12/54 Umývání a dezinfekce rukou • pojmy z legislativy: - Mechanické mytí rukou (MMR) - mytí mýdlem, předchází CHDR - Hygienické mytí rukou (HMR) - mytí dezinfekčním mýdlem - Hygienická dezinfekce rukou (HDR) - dezinfekce např. alkoholovými prostředky, doporučené ve zdravotnictví - Chirurgická dezinfekce rukou (CHDR) • umývání a dezinfekce rukou je nezbytná i při použití rukavic 13/54 Rotační tření levého palce sevřeného v pravé dlani a naopak; Rotační tření v obou směrech sevřenými prsty pravé ruky o levou dlaň a naopak; Po usušení jsou Vaše ruce dezinfikovaný. 14/54 Nejčastěji vynechávaná místa BACKOF H AND FRONT OF HAND pathtoradianthealth.corn 15/54 Vyšší stupeň dezinfekce • dezinfekční přípravek se širokým spektrem účinnosti (Persteril, glutaraldehyd, apod.) • nemusí ničit cysty prvoku a vajíčka červů • pro zdravotnické prostředky, které nemohou být dostupnými metodami sterilizovaný • používají se k výkonům a vyšetřování mikrobiálně fyziologicky neosídlených tělních dutin (flexibilní endoskopy) • dvoustupňová dezinfekce = vyšší stupeň dezinfekce + oplach pitnou/čištěnou vodou - používá se k výkonům a vyšetřování mikrobiálně fyziologicky osídlených tělních dutin 16/54 I Fyzikální sterilizace • vlhkým teplem (sytou vodní parou) pod tlakem (autoklávování) - předměty z kovu, skla, porcelánu, keramiky, textil gumy, plastů, aj. - 121 °C + přetlak 1,05 bar / 20 minut - 134 °C + přetlak 2,04 bar / 10 minut - 134 °C + přetlak 2,04 bar / 60 minut (priony) • cirkulujícím (proudícím) horkým vzduchem - předměty z kovu, skla, porcelánu, keramiky - 160 °C / 60 minut; 170 °C / 30 minut; 180 °C / 20 minut I Fyzikální sterilizace (2) * plazmou - vysokofrekvenční elektromagnetické pole nebo vysokonapěťový výboj - ve vysokém vakuu působením na páry peroxidu vodíku, nebo jiné chemické látky uvolňují volné radikály kyslíku (hydroxyl, hydroperoxyl) - účinek je dán nízkoteplotní plazmou plynu (peroxid vodíku, kyselina peroctová) při teplotě do 50 °C, čas od 30 do 75 minut (podle přístroje) - termolabilní nástroje a pomůcky 18/54 Fyzikální sterilizace (3) • radiační - využití Y"záření v dávce minimálně 25 kGy - používá se pro sterilizaci nových výrobků, hlavně lékařských předmětů pro jedno použití z plastických hmot, textilie apod. • ohněm (mikrobiologické kličky, odpady) • tlakem (paskalizace, 6000 bar, potravinářství) • ostatní: frakcionovaná sterilizace, filtrace, ... 19/54 Chemická sterilizace * pro termolabilní materiál, který nelze sterilizovat fyzikálními způsoby sterilizace * sterilizačním médiem jsou plyny předepsaného složení a koncentrace a sterilizace probíhá za stanoveného přetlaku nebo podtlaku a teplotě do 80 * páry formaldehydu nebo ethylenoxidu Kontrola účinnosti dekontaminace * orientačně (smyslově) - charakteristický zápach * stanovení skutečné koncentrace dezinfekčních prostředků (chemická analýza) * chemická kontrola sterilizace (využití indikátorů; např. Bowie-Dick test - test správného odvzdušnení a průniku páry) * biologická kontrola - využití spor odolných kmenů rodů Bacillus nebo Geobacillus (fí. atrophaeus, G. stearothermophilus) fvv^vvn ^~om 21/54 Čeleď Enterobacteriaceae • G- tyčky, většinou pohyblivé (kromě shigel, klebsiel a Y. pestis), • OXI- (KAT+), biochemicky značně aktivní • komenzálové, saprofyté, patogeny střevní i mimostřevní (obligátní i oportunní patogeny) • klinicky nejdůležitější čeleď G- tyček 22/54 Čeleď Enterobacteriaceae: patogeny • způsobující celkové (systémové) infekce: - Yersinia pest is (mor) - antropopatogenní serovary salmonel (sérovary Typhi, Paratyphi A, B a C - břišní tyfus) • obligátní patogeny způsobující zpravidla střevní infekce: - zoopatogenní serovary salmonel (sérovary Enteritidis, Typhimurium - salmonelózy) - shigely, Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis • podmíněně patogenní enterobakterie: - rody Escherichia, Klebsiella, Proteus, Serratia, Enterobacter, ... 23/54 Yersinia pestis původce moru prenasec: blecha morová (Xenopsylla cheopsis) zdroj: krysy, potkani a jiní hlodavci formy onemocnění: - dýmějový (bubonický) mor - plicní forma - septická forma Dýmějový (bubonický) mor hemoragie a srážení krve -» bubon (zvětšená uzlina) v podpaží odtud označení černá smrt 25/54 Antropopatogenní salmonely S. enterica spp. enterica sérovary Typhi a Paratyphi septická onemocnění břišní tyfu s/para tyfu s vstupní branou je trávicí trakt (kontaminovaná voda) -> inkubační doba 10-14 dní -> primárni bakteriémie, vysoké teploty, silné bolesti hlavy S. Typhi - antigény O: 9, 12 - antigény H: d - antigény pouzdra: Vi Widalova reakce (aglutinace) ncidence na 100 000 obyvatel m <5 m 100 - 500 M 1.000 http://centrumcest0vnimediciny.c2 26/54 Zoopatogenní salmonely • S. enterica spp. enterica sérovary Enteritidis, Typhimurium, aj. • fekálně-orální přenos - kontaminované potraviny (zejména vejce, syrové drůbeží a vepřové maso) • salmonelózy (průjmy bez krve, horečka, zvracení, oslabených jedinců možná sepse) • vysoká infekční dávka (cca 105-108 bakterií) = nutnost pomnožit se v nějaké potravině • S. Enteritidis - antigény O: 1, 9, 12 - antigény H: g, m Rod Shigella • Shigella dysenteriae, S. flexneri, ... • fekálně-orální přenos, typická nemoc „špinavých rukou", možný i alimentární přenos (voda, mléko, ...) • shigelóza = bacilární úplavice/dysenterie (průjmy s krví a hlenem, horečka, křeče v břiše, zvracení) • nízká infekční dávka (cca 102 bakterií) 28/54 Escherichia coli • důležitá součást střevní mikroflóry (produkce kolicinu a mikrocinů), omezuje kolonizaci střeva jinými bakteriemi • patogeny ve střevě: - EPEC (enteropatogenní EC) - novorozenecké průjmy - ETEC (enterotoxigenní EC) - průjmy (cestovatelské) - EIEC (enteroinvazivní EC) - krvavé průjmy - EHEC = STEC (enterohemoragické, shiga-like toxigenní EC) - hemolyticko-uremický syndrom (průjem, zvracení, horečka, následuje anémie, petechie, ... až selhání ledvin a neurologické příznaky) • zejména sérotyp 0157:H7 (dále 026, 055, 0111) • nízká infekční dávka (< 50 bakterií) 29/54 Escherichia coli (2) • patogeny ve střevě: - EAEC (enteroagregativní EC) - cestovatelské průjmy - DAEC (difúzně-adherentní EC) - cestovatelské vodnaté průjmy se zvracením • patogeny mimo střevo: - UPEC (uropatogenní EC) - kmeny způsobující respirační infekce, sepse, infekce ran, novorozenecké meningitidy... • epidemie v Německu 2011 (EAEC O104:H4, která získala geny pro shiga toxin od STEC horizontálním přenosem) 30/54 Escherichia coli (3) microbewiki.kenyon.edu Delivery of LT or ST enterotoxin* ETEC normal cylnptwm DAEC f\ /™\ intimate /"\ attachment of bacteria condensation and microvillous effacement \ delivery ot Shiga toxin EH£C Initial adherence via RFP in Limite uft,^P attachment aclin condensation and micioviVoUt effacement EPEC aggregative adherence rrucus bionim Delivery of cylotoxin EAEC invasion phago&omal rupture laleral spread to adjacent ceil 31/54 Rod Klebsiella • opouzdřené bakterie • Klebsiella pneumoniae, K. oxytoca, K. ozaenae • nozokomiální patogeny - infekce močových cest 32/54 Rod Proteus • Próteus mirabilis, Próteus vulgaris • původci močových infekcí • typický je plazivý růst (tj. neroste jen v místě inokulace, ale šíří se po povrchu agaru do stran), tzv. Raussův fenomén či fenomén příbojové vlny Multirezistentní enterobakterie * rezistence na větší množství antibiotik • častí producenti širokospektrých betalaktamáz typu Multirezistentní enterobakterie (2) Percentage resistance H < 1% E3 lto < 5% 5 to < 10% H ID to <25% M Z5to < 50% H No data reported or less than 10 isolates l l Notincluded Multirezistentní izoláty K. pneumoniae, rezistence ke 3. gen. cefalosporinö, fluorochinolonöm a aminoglykosidöm, rok 2013 Liechtenstein Luxembourg Malta ;c;. 5CDC.iljirlii.iTE££>- 35/54 Campylobacter jejuni • G- zahnutá tyčka (nepatří mezi enterobakterie), 0X1+ • kampylobakterióza - průběh a závažnost onemocnění srovnatelná se salmonelózou (nebývá zvracení) • fekálně-orální přenos - kontaminované potraviny (zejména drůbeží maso) 9 speciální kultivace (viz úkol č. 7): - černá „půda pro kampylobaktery" (CCDA - charcoal-cefoperazone-deoxycholate agar); ^^^^^H||!l teplota 42 °C zvýšená tenze C02 prodloužená kultivace na 48 hodin neroste na KA a EN DO 36/54 Helicobacter pylori • G- zahnutá (spirálovitá) tyčka (nepatří mezi enterobakterie) • v žaludku -> mohutnou ureázovou aktivitou si upravuje mikroprostředí (využití pro dg.) • podíl na vzniku gastroduodenálních vředů • speciální půda ^^H^X^^í^ (kultivace 5 dni) c o NH2 +H20 urease »2NH 4-CO 37/54 Čeleď: Vibrionaceae • G- krátké zakřivené tyčky, pohyblivé, OXI+ • ve vodě v teplých oblastech • Vibrio cholerae - cholera (těžké průjmové onemocnění, zvracení), sérotypy Ol a 0139 • halofilní vibria: I - V. vulnificus (infekce ran, sepse) - V. parahaemolyticus (gastroenteritis, krvavé průjmy) I Diferenciální diagnostika • Gramovo barvení pro odlišení G- tyček • ENDO: z klinicky významných rostou enterobakterie, Vibrionaceae a G- nefermentující tyčky (GNFB; praktikum P06) • Hajnova půda pro odlišení GNFB (vše negativní) • Oxidáza pro odlišení vibrií (pozor, některé GNFB mohou mít také pozitivní oxidázu; rod Plesiomonas má také pozitivní oxidázu, ačkoliv patří do čeledi En terobacteria cea e) 39/54 Rozlišení enterobakterií • ENDO: možné orientační rozlišení obligátních patogenů (většinou L-) a potenciálních patogenů (většinou L+) • další půdy: - XLD (salmonely černé, shigely růžové, ostatní enterobakterie žluté, G+ bakterie jsou inhibovány) - MAL, Deoxycholát-citrátový (DC) agar (obě půdy podobné XLD, určené pro enterobakterie) - CIN pro yersinie • biochemické testy (Hajná, MIU, ENTEROtesty aj.) • antigenní analýza (zpravidla sklíčková aglutinace) 40/54 I Úkol 1: Mikroskopie kmenů * obarvěte podle Grama sedm kmenů (kromě kmenu N, ten je pro Vás již obarven) • jeden z kmenů bude G+, výsledek si poznamenejte, dále už s ním ale nebudeme pracovat 41/54 Úkol 2: Kultivace na KA a ENDO * popište kolonie na KA a ENDO • na KA můžete vidět hemolýzu, není ale důležitá pro diagnostiku • nezapomeňte že L+ kmeny mají nejen červené (též růžovočervené nebo kovový lesk) kolonie, ale i okolní půdu (jinak je to jen pigment) * kmeny, které nerostou ani na jedné z půd a morfologicky se jeví jako zahnuté mohou být kampylobakter - tyčky, které nejsou zahnuté budou probírány až v dalším z praktik 42/54 Úkol 3: Skupinová dg. G- tyček rostoucích na ENDO * úkol 3a: Hajná - pátráme po GNFB, biochemicky neaktivním kmenu (tj. celá půda je červená), pokud je půda žlutá, tvoří kmen fermentuje Glc nebo Lac, pokud je černá, pak kmen tvoří sirovodík • úkol 3b: Oxidáza - pro odlišení vibrií (OXI+) a enterobakterií (OXI-), GNFB mohou být 0X1+ i OXI- 43/54 Ukol 3: Skupinová dg. G- tyček rostoucích na E N DO - HAJNÁ Hajnova půda (Kligler's Iron Agar, KIA) - štěpení laktózy (A = N EG, B = POZ) - štěpení glukózy (C = NEG, D = POZ) - produkce H2S (POZ = zčernání půdy) - tvorba plynu (POZ = potrhaná půda, bublinky, půda vysunutá nahoru) / - očkování vpichem a tzv. hádkem B fr.wik Úkol 4: Další kultivační a biochemické testy • úkol 4a: popište kmeny na XLD (salmonely mají bledé kolonie s černým středem) a dalších selektivních půdách • úkol 4b: ENTEROtest 16 (17 reakcí: 1. je ONPG, 2. až 9. jsou v prvním řádku, 10. až 17. ve druhém řádku) 45/54 Úkol 5: Antigenní analýza • úkol 5a: vyloučení EPEC (sklíčková aglutinace se dvěma polyvalentními séry) - pro detekci 12 serovarů EPEC nonavalentní sérum (I, II, III) a trivalentní sérum (IV) - pokud je jedno z nich pozitivní, pokračujeme s příslušnými trivalentními resp. monovalentními séry - neužívá se vždy, obyčejně však u obligátních patogenů (salmonely, shigely, yersinie) a u střevních izolátů E. coli při podezření na EPEC (děti do 3 let) nebo STEC * úkol 5b: určení sérovaru salmonely (sklíčková aglutinace se dvěma séry, obě musí být pozitivní; S. Enteritidis pozitivní tělový antigén 9, bičíkový g, m) Úkol 6: test citlivosti na ATB * antibiotická citlivost se neurčuje u kmenů ze stolice (u bakteriálních průjmů podání ATB prodlužuje dobu vylučování patogenů ze střeva, doporučují se probiotika) • antibiotická citlivost se určuje u kmenů z moče - spektrum testovaných ATB zahrnuje i léky používané při léčbě močových infekcí (např. nitrofurantoin) 47/54 Úkol 7: Dg. kampylobakterů speciální kultivace: - černá „půda pro kam pyl o ba který" (CCDA charcoal-cefoperazone-deoxycholate agar); neroste na KA a EN DO - teplota 42 °C - zvýšená tenze C02 - prodloužená kultivace na 48 hod OXI+ (typicky opožděná pozitivita) Úkol 8: Ureázový test v diagnostice helikobakterů • helikobaktery nerostou na běžných půdách (mají speciální půdu, kultivace 5 dní) • využívá se štěpení urey (ureázová aktivita je tak silná, že můžeme pracovat přímo s odebraným vzorkem (žaludeční tkáň) • POZ = červená • NEG = žlutá clsdiagnostics.com 49/54 Úkol 9: Dg. čeledi Vibrionaceae • mikroskopicky zahnutá tyčka • kultivace: - pomnožení v alkalické peptonové vodě - pevná půda TCŽS (thiosíran-citrát-žluč-sacharóza) • pro biochemickou identifikaci můžeme použít sadu ENTEROtest 16, ale s jinou maticí • antigenní analýza: sérovary Ol a 0139 • další biochemické testování sérovaru Ol (biovary Classic a El Tor) 50/54 Úkol 10: Vliv různých faktorů na růst a přežití bakterií • úkol 10a: vliv teploty na bakterie (posudte, které případy jsou inhibice růstu a které usmrcení bakterií) • úkol 10b: vliv dezinfekčního činidla na bakterie (určete minimální baktericidní koncentraci daného dezinfekčního činidla) • úkol 10c: vliv času v kombinaci s teplotou (sterilizace při dané teplotě po daný čas) 52/54 Úkol 11a 12: Výběr vhodného dezinfekčního činidla; kontrola účinnosti dezinfekce • úkol 11: popište různé situace a použité dezinfekční prostředky do tabulky • úkol 12a: zkontrolujte účinnost horkovzdušného sterilizátoru a rozhodněte, zda je možné ho používat • úkol 12b: zapište si místo steru z prostředí a jeho (ne)sterilitu 53/54 I Po tomto cvičení byste měli umět: • správně použít dekontaminační metody (dezinfekce, vyšší stupeň dezinfekce, sterilizace) pro různé druhy materiálů a situací • správně si mýt a dezinfikovat ruce • popsat nejdůležitější zástupce čeledí Enterobacteriaceae a Vibrionaceae a rodů Campylobacter a Helicobacter vč. diagnostických postupů, které vedou k úspěšné identifikaci • posoudit, kdy je vhodné využít antigenní analýzu • jmenovat klinicky nejdůležitější sérovary salmonel, escherichií a vibrií 54/54