P07a
Úvod do serologie, precipitace a
aglutinace
Dynamika titru,
komplementfixační reakce
a neutralizace
Reakce se značenými složkami
Bi7170c (podzim 2017)
Osnova
●
přímé a nepřímé metody
●
antigen a protilátka
●
titr, dynamika titru protilátek
●
precipitace, aglutinace, aglutinace na nosičích
●
komplement, komplement fixační reakce
●
neutralizační reakce
●
třídy protilátek, avidita
●
princip metod se značenými složkami
●
imunofluorescence, ELISA, Western blot
●
imunochromatografické metody
2/98
Přímé vs. nepřímé metody
přímé
●
hledáme mikroba, jeho
část či jeho produkt
(produktem může být
například nějaký bakteriální
antigen či jed – toxin)
●
agens je přítomno nyní
3/98
nepřímé
●
hledáme protilátky
●
protilátka není součástí ani
produktem mikroba
(produkt makroorganismu,
odezvou na činnost mikroba)
●
agens bylo přítomno někdy
v minulosti
Přímé metody – přehled
4/98
Metoda Průkaz
ve vzorku
Identifikace
kmene
Mikroskopie ano ano
Kultivace ano ano
Biochemická
identifikace
ne ano
Průkaz antigenu,
toxinu
ano ano
Pokus na zvířeti ano v praxi ne
Molekulární metody ano v praxi ne*
*netýká se molekulární epidemiologie
(sledování příbuznosti kmenů)
Nepřímé metody – přehled
●
precipitace
●
aglutinace
●
aglutinace na nosičích
●
komplementfixační reakce (KFR)
●
neutralizační reakce
●
metody se značenými složkami:
– imunofluorescence
– ELISA
– Western blot
– imunochromatografie
5/98
Antigeny
●
látka navozující produkci protilátek
●
vázán do vazebného místa protilátky
●
proteiny a (poly)sacharidy jsou imunogenní
●
lipidy a nukleové kyseliny jsou imunogenní pouze v
kombinaci s proteiny nebo sacharidy
●
příklady: virové částice a jejich části, buněčné
stěny a jejich části (lipoteichoové kyseliny,
lipopolysacharidy), bičíky, fimbrie, toxiny bakterií
6/98
Buněčná stěna bakterií:
Gram negativní (G–)
7/98
Lipopolysacharidy
●
součást buněčné stěny G– bakterií
●
imunogenní vlastnosti (stimuluje specifickou imunitu)
●
Lipid A (endotoxin)+ základní (core) polysacharid +
specifický polysacharid (O antigen)
●
uvolňuje se z bakteriálních buněk po lýze (např.
imunitním systémem)
●
v případě těžkých infekcí může vést k septickému
šoku
8/98
Buněčná stěna bakterií:
Gram pozitivní (G+)
9/98
Lipoteichoové kyseliny
●
součást buněčné stěny G+ bakterií
●
imunogenní vlastnosti (stimuluje specifickou imunitu)
●
uvolňuje se z bakteriálních buněk po lýze (např.
lysozymem nebo β-laktamovými ATB)
●
v případě těžkých infekcí může vést k septickému
šoku (menší počet případů než LPS)
10/98
Protilátky
●
glykoproteiny tvořené jako odpověď na antigenní
výzvu
●
z rodiny imunoglobulinů
●
součást humorální (látkové) imunity
●
produkovány B-lymfocyty
●
proteiny a sacharidy jsou imunogenní samy→
protilátky jsou imunogenní struktury → možné
vytvořit protilátky proti protilátkám
11/98
Protilátky (2)
12/98
Třídy (izotypy) protilátek
●
IgG:
– monomery (2 vazebná místa), proniká do tkání
– opsonizace, aktivace komplementu klasickou
cestou, imunologická paměť (opakované setkání s
antigenem), neutralizace toxinů
– tvoří se o něco později než IgM
– jediné procházejí placentou (novorozenci mají
stejnou hladinu IgG protilátek jako dospělý)
13/98
Třídy (izotypy) protilátek (2)
●
IgM:
– pentamer → neproniká to tkání
– teoreticky 10 vazebných míst (prakticky je jich
5 prostorově blokováno)
– aktivuje komplement, snadno aglutinuje
– vytvářeny jako první (jejich produkce nevyžaduje
izotypový přesmyk)
– pokud dojde k infekci fétu, jsou IgM přítomny již
při narození (IgM musely být vytvořeny fétem
nikoli matkou)
14/98
Třídy (izotypy) protilátek (3)
●
IgA:
– slizniční protilátky (tvořeny jen B-lymfocyty ve
sliznicích)
– poločas rozpadu asi 1 týden → vyskytují se u
čerstvých infekcí
– dimery
– blokáda adhezních molekul (reagují s adhezními
molekulami bakterií), opsonizace, nemá schopnost
aktivovat komplement
15/98
Třídy (izotypy) protilátek (4)
●
IgE:
– uvolňuje mediátory zánětu (histamin, serotonin,
prostaglandiny, leukotrieny),
– zodpovědné za reakce časné přecitlivělosti a
alergické reakce
– úloha v antiparazitární obraně (červi)
– nestanovuje se jejich hladina
●
IgD:
– nízké koncentrace v séru, nízká afinita k Ag
– nachází se hlavně na povrchu B-lymfocytů, kde
má funkci receptoru pro antigen → v mikrobiologii
se nevyužívá
16/98
Afinita a avidita protilátek
●
afinita = síla interakce jednoho vazebného místa s
jedním antigenem
●
avidita = (celková) síla, kterou polyvalentní
protilátka interaguje s polyvalentním antigenem
●
avidita vzrůstá s afinitou jednoho vazebného místa pro
jeden antigen a s počtem simultánně se uplatňujících
vazebných míst
●
časné IgG protilátky jsou nízkoavidní, pozdní IgG
protilátky jsou vysokoavidní
●
pentamer IgM, protilátky s více (prakticky až pěti)
vazebnými místy, vázat antigeny s velmi velkou
aviditou, ačkoliv afinita jednotlivých vazebných míst
bývá malá 17/98
Serologické metody
●
všechny pracují s vazbou antigenu a protilátky,
které spolu tvoří komplex
●
liší se pouze způsob detekce komplexu Ag-Ab
●
průkaz antigenu laboratorní protilátkou:
– přímý průkaz
– detekce antigenu ve vzorku od pacienta,
identifikace/antigenní analýza kmene mikroba
– laboratorní protilátka získána ze zvířete
●
průkaz protilátky laboratorním antigenem:
– nepřímý průkaz
– použije se pacientovo sérum (v němž hledáme
protilátky) 18/98
Interpretace
●
průkaz antigenu:
– pozitivní výsledek znamená přítomnost mikroba
v těle pacienta
●
průkaz protilátek:
– pozitivní výsledek znamená, že mikrob byl
přítomen v těle pacienta (nevíme kdy v minulosti)
– odhad času, kdy se mikrob setkal s pacientem:
●
relativní množství protilátek (titr) a jeho
změny v čase (dynamika titru)
●
třída protilátek: IgM/IgG
●
avidita protilátek (na počátku infekce jsou
přítomny nízkoavidní Ab)
19/98
Interpretace nepřímého průkazu
●
primární a sekundární imunitní odpověď
20/98
Interpretace nepřímého průkazu (2)
●
akutní infekce: velké množství protilátek, převážně
třídy IgM, případně IgM i IgG (1)
●
po prodělané infekci: malé množství protilátek,
pouze IgG (imunologická paměť) (2)
●
chronická infekce: různé možnosti podle aktivity
infekce, mikrobiálního druhu apod.
21/98
(1)
(2)
Interpretace nepřímého průkazu (3)
●
obtížné zjistit absolutní koncentraci protilátek
proti konkrétnímu antigenu (ne celkové množství
imunoglobulinů) v jednotkách mol/l, mg/l apod.
●
zjišťuje se relativní množství konkrétních protilátek
postupným ředěním pacientova séra:
– pozitivní reakce i po vysokém zředění v séru je→
velké množství protilátky
– pozitivní reakce jen při nízkém zředění v séru→
je malé množství protilátky
22/98
Ředění séra geometrickou řadou
●
technicky nejjednodušší způsob, jak ředit sérum
pacienta
●
nejčastěji použití geometrické řady s koeficientem 2
●
vycházíme z neředěného séra, nebo ze séra o určitém
předředění (např. 1:5, 1:10, 1:50 apod.)
●
v každém z dalších důlků je sérum dvojnásobně
zředěno oproti předchozímu: neředěné zředěné→ 2x
zředěné→ 4x zředěné→ 8x zředěné→ 16x zředěné→
32x zředěné→ 64x zředěné→ 128x zředěné→ 256x
→→ →
23/98
Ředění v serologii
●
desetinásobné zředění:
– v biochemii: 1 díl séra : 9 dílů fyziol. roztoku
(psáno ředění 1:9)
– v serologii: 1 díl séra : 9 dílů fyziol. roztoku
(psáno ředění 1:10)
●
provedení stejné, ale zápis je jiný (!)
●
jde jen o praktickou stránku zápisu (srovnejte:
1:9, 1:19, 1:39, 1:79, 1:159, …
1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, ...)
24/98
Geometrická řada
●
bez předředění původního séra (na začátku máme
původní sérum, ve zkumavkách máme připraveno
stejné množství fyziologického roztoku, jaké odebereme
z původního séra)
25/98
Geometrická řada (2)
●
s předředěním původního séra, zde např. 1:100 (na
začátku máme zředěné sérum, ve zkumavkách máme
připraveno stejné množství fyziologického roztoku, jaké
odebereme z původního zředěného séra)
26/98
Titr protilátek
●
po naředění séra pacienta podobně jako v úkolu 1
přidáme antigen
●
v závislosti na konkrétním typu reakce buď přímo
vidíme výsledek reakce (aglutinát, precipitát), nebo
ho musíme znázornit přidáním dalších složek (např.
komplementu, červených krvinek apod.)
●
nejvyšší ředění séra, kde ještě vidíme pozitivní
reakci, se nazývá titr
27/98
Titr protilátek
●
nejvyšší ředění séra, kde ještě vidíme pozitivní
reakci, se nazývá titr
●
neprokazujeme přítomnost původce choroby, ale
pouze reakci části imunitního systému (!) →
značná individuální variabilita imunitní odpovědi
mezi jednotlivými pacienty
28/98
individuální variabilita mezi
málo reaktivním a
vysoce reaktivním pacientem
(tj. stejně vysoký titr dvou
různých pacientů v různých
fázích infekce)
Titr protilátek: dynamika titru
●
nelze se spolehnout na samotnou výši titru
●
vycházíme z dynamiky výše titru
●
při prvním styku s Ag trvá až 10 dní, než je možné je
běžnými serologickými metodami prokázat → v prvních
dnech infekce jsou serologické reakce často negativní
●
prokázat můžeme nejen vzestup titru protilátek, ale i
pokles (subakutní infekce)
●
velikost titru a dynamika titru neodpovídá vývoji
klinických příznaků (!)
●
množství protilátek často vrcholí až po vymizení
příznaků
29/98
Titr protilátek: dynamika titru (2)
●
1 – 2: serokonverze
●
3 – 4: vzestup titru
●
5 – 6: pokles titru
30/98
Diagnostika čerstvé infekce
●
vyšetřují se dva vzorky séra
●
první (akutní) vzorek odebrán co nejdříve na
začátku onemocnění, popř. ihned při podezření na
určitou infekci
●
druhý (rekonvalescentní) vzorek odebírán
po 10 a více dnech od prvního vzorku
●
párová séra:
– první vzorek je uchováván v ledničce dokud není
odebrán i druhý vzorek; poté jsou oba hodnoceny
současně
– signifikantní je alespoň čtyrnásobný vzestup titru
protilátek mezi prvním a druhým vzorkem nebo
serokonverze (1. vzorek negativní, 2. pozitivní) 31/98
Diagnostika čerstvé infekce (2)
●
nepárová séra:
– druhý vzorek je vyšetřen zvlášť
– signifikantní je osminásobný rozdíl (kvůli možné
laboratorní chybě; běžná laboratorní chyba u
serologických reakcí je jedno ředění)
– serokonverze vyžaduje, aby pozitivní nález ve
druhém vzorku byl o jedno ředění vyšší než základní
ředění (např. základní ředění 1:4, pozitivní nález ve
2. vzorku alespoň 1:8)
32/98
Společné vlastnosti precipitace a
aglutinace
●
dvě nejjednodušší serologické reakce
●
pracujeme jen s antigenem a protilátkou bez
dalších složek
●
dokazujeme antigen: použijeme zvířecí (či
monoklonální) protilátku, titr není relevantní
informace
●
dokazujeme protilátku: použijeme laboratorní
antigen, zajímá nás titr protilátek (relativní množství
protilátek)
33/98
Precipitace, aglutinace, aglutinace
na nosičích
●
precipitace: antigeny jsou ve formě izolovaných
makromolekul (rozpustné koloidní antigeny)
●
aglutinace: antigen je součástí buňky mikroba
(pracujeme s celými mikroby, antigen je
korpuskulární)
●
aglutinace na nosičích: precipitace převedená na
aglutinaci; původně izolované koloidní antigeny
jsou navázány na cizí částici – nosič (latex,
erytrocyt, polycelulóza atp.)
34/98
Precipitace
35/98
Aglutinace
36/98
Aglutinace na nosičích
37/98
Prstencová precipitace k detekci
antigenu S. pyogenes
●
umožňuje zjistit, který z extraktů streptokoka obsahuje
antigen S. pyogenes:
– zvířecí sérum
s protilátkami
– různé extrakty
kmenů
●
POZ: prstenec na styku
tekutin
38/98
Precipitace: reakce RRR, RPR,
VDRL
●
netreponemové testy
●
průkaz nespecifických protilátek proti kardiolipinu
●
provedeny v různých formátech:
– VDRL (Venereal Disease Research Laboratory) je
flokulační (precipitační) test na sklíčku
– RRR (rychlá reaginová reakce), je obdobou
(úpravou) reakce VDRL, používají se jamky
– reakce RPR (rapid plasma reagin), kde je odečítání
reakce vylepšeno o makroskopickou vizualizaci
pomocí karbonových částic, nebo pigmentů
39/98
Precipitace: reakce RRR, RPR,
VDRL (2)
●
odečet RPR, znázornění karbonovými částicemi
40/98
Precipitace v průkazu protilátek –
RRR
●
detekujeme protilátky, které jsou pozitivní u syfilis,
ačkoli to nejsou protilátky proti Treponema
pallidum
●
protilátky proti kardiolipinu
●
reakci provádíme pouze kvalitativně
●
první důlek je pozitivní kontrola, druhý negativní,
pak má každý pacient jen jeden důlek
●
smíchá se vždy 0,05 ml séra + 0,05 ml kardiolipinu
●
RRR může být falešně pozitivní, proto je pozitivitu
potřeba potvrdit např. testem TPHA
41/98
Precipitace – mikroprecipitace v
agaru
●
mikroprecipitace v agaru dle Ouchterlonyho (tato
reakce není v dnešních úkolech)
●
do důlku uprostřed je nalita tekutina obsahující antigen
●
Ag difunduje agarem
●
obsahuje-li sérum Ab,
difundují proti němu
a na jejich styku
vznikne precipitační
linie
●
např. nepřímá
diagnostika
plicní aspergilózy
42/98
+-
-
Antigen 
Aglutinace: demontrace různých
možností provedení
43/98
Aglutinace: antigenní analýza
●
obyčejně u obligátních patogenů (salmonely,
shigely, yersinie) a u střevních izolátů E. coli při
podezření na EPEC (děti do 3 let) nebo EHEC
+–
44/98
1:2 1:4 1:8
Demonstrace aglutinační reakce u
tularémie:
●
1. řada:
aglutinát je viditelný
v ředění 1:2 a 1:4,
nikoli však již 1:8 a vyšším
titr je 1:4
●
2. řada:
v žádném důlku
není aglutinace →
žádný titr,
negativní reakce
45/98
Úkol 2: Aglutinace – průkaz Ab
●
prohlédněte si mikrotitrační destičku se séry, u nichž
aglutinačně hledáme protilátky proti Yersinia
enterocolitica
●
v 1. důlku je sérum naředěno 1:100 a dále s
koeficientem 2
●
jako antigen zde slouží samotná bakteriální buňka
●
aglutinace je mapovitý povláček na dně důlku
(buňky jsou provázány protilátkami)
●
negativní reakce je kompaktní pravidelná tečka
(sedimentované bakteriální buňky)
●
stanovte a zapište titr protilátek (pokud jsou
přítomny), zakreslete výsledek
46/98
Úkol 2: Aglutinace – průkaz Ab (2)
●
titr je nejvyšší ředění s pozitivní reakcí
●
aglutinace je mapovitý povláček na dně důlku
(buňky jsou provázány protilátkami)
●
negativní reakce je kompaktní pravidelná tečka
(sedimentované bakteriální buňky)
47/98
pozitivní negativní
Úkol 2: Aglutinace – detekce
protilátek proti yersiniím
48/98
K+ pozitivní, titr = 1 : 200
Č. 1 negativní
Č. 2 pozitivní, titr = 1 : 800
Č. 3 negativní
Č. 4 pozitivní, titr = 1 : 200
1:100 1:200 1:400 1:800
Aglutinace
Sedimentace volných bakterií
Treponema pallidum pasivní
hemaglutinace (TPHA)
●
aglutinace na nosiči, nosičem je erytrocyt (odtud
červená barva)
●
vyhodnoťte TPHA jako v úkolu 3a
●
pozitivní reakce vznik mapovitého povláčku
●
negativní reakce sedimentace
částic na dno důlku
●
dnes se v tomto testu červené
krvinky nahrazují polycelulózovými
částicemi – zkratka TPPA
49/98
Treponema pallidum pasivní
hemaglutinace (TPHA)
50/98
pozitivní kontrola
negativní kontrola
pacienti 1, 2 a 3
technické důlky negativní kontrola
každého pacienta
vlastní reakce
+++ ++ + +/-
Komplement
●
humorální složka imunity
●
soubor sérových a membránových glykoproteinů
– nejdůležitější jsou C1–C9
●
fungují v kaskádě, základem je štěpení neaktivní
složky na menší biologicky aktivní část (mediátory
zánětu C3a, C4a, C5a) a větší část s proteolytickou
aktivitou (fragmenty b)
●
konečný produkt kaskády je membránu atakující
komplex (C5b, C6, C7, C8, 13-18 C9) tvořící pór v
membráně → lyze buňky
51/98
Komplement (2)
●
dráhy aktivace komplementu:
– liší se od sebe způsobem aktivace klíčové složky C3
– nejdůležitější moment při aktivaci komplementu
je tvorba C3b z C3
– klasická (aktivace komplexem Ag-Ab,
fylogeneticky nejmladší, musí se nejdříve vytvořit
protilátky pro boj s infekcí)
– lektinová (varianta klasické dráhy, mannose-binding
lectin; lektiny jsou proteiny schopné specificky
rozpoznávat a vázat cukry volné i vázané)
– alternativní (aktivace povrchem patogenu,
fylogeneticky nejstarší, C3b slouží k opsonizaci
patogenu) 52/98
Komplement fixační reakce (KFR)
●
využívá vlastností komplementu:
– schopnost vázat se jen na komplex Ag-Ab
(neváže se na samotný antigen ani na
samotnou protilátku)
– vede k lyzi buňky
●
navázání komplementu na komplex Ag-Ab není
samo o sobě viditelné přidáváme indikátorový→
systém
●
indikátorový systém (tvořen Ag a Ab, aby se na něj
mohl komplement také vázat)
– antigen = beraní erytrocyty; protilátka = králičí
Ab proti beraním erytrocytům (amboceptor)
53/98
KFR: princip pozitivní a negativní
reakce
54/98
KFR: princip pozitivní a negativní
reakce (2)
●
POZ = erytrocyty sedimentují
(komplement byl vyvázán
komplexem hledaného Ag a Ab)
●
NEG = hemolýza (komplement
nebyl vyvázán komplexem
hledaného Ag a Ab, zbyl a mohl
lyzovat erytrocyty)
●
nevyužívá se pacientův komplement (variabilita
mezi pacienty); inaktivuje se zahřátím tak, aby nebyly
poškozeny pacientovy protilátky (30 min/56 °C)
●
využívají se 2 hemolytické jednotky morčecího
komplementu (hemolytická jednotka = množství,
které právě stačí hemolyzovat jednu pracovní dávku
senzibilizovaných erytrocytů) 55/98
Falešná pozitivita a negativita KFR
●
falešná negativita:
– příliš mnoho komplementu hemolyzuje erytrocyty
i v přítomnosti hledaného komplexu Ag-Ab
– předcházíme mu kontrolou (titrováním)
komplementu (např. ředění 2, 1, 0,5, 0,25
hemolytické jednotky)
●
falešná pozitivita:
– některá složka séra vyvazuje komplement sama
o sobě (nebo je sérum chylózní či kontaminované)
– test antikomplementarity = běžně provedený
test, ale bez přidání antigenu pokud je i tak→
vyvázán komplement, výsledek se nehodnotí a krev
je nutné odebrat znovu 56/98
Úkol 3: Schematická analýza KFR
vč. testování antikomplementarity
●
v následujících schématech rozhodněte, ve kterých
případech zůstává po první fázi volný komplement
(zakroužkujte co platí)
●
připojte slovní popis výsledku (hemolýza,
sedimentace erytrocytů)
57/98
Úkol 4: Stanovení protilátek
(respirační nákazy)
●
pacient s dlouhotrvajícími respiračními problémy, málo
klinických projevů, nejpravděpodobnější diagnóza
atypické pneumonie
●
atypická pneumonie může být způsobena mnoha
respiračními viry, avšak také některými bakteriemi
(Mycoplasma, Chlamydia)
●
případná mykoplasmová/chlamydiová etiologie
by znamenala možný účinek ATB
●
u virů by ATB smysl neměla
58/98
Úkol 4: Stanovení protilátek
(respirační nákazy) (2)
●
celá destička patří jednomu pacientovi
●
máme šest respiračních patogenů, každý je ve dvou
řádcích (akutní vzorek a rekonvalescentní)
●
první sloupec je test antikomplementarity
●
následuje sedm ředění séra – ve druhém sloupci 1 : 5
a pak geometrickou řadou s koeficientem 2
●
kromě virů (chřipka A, chřipka B, parainfluenza,
adenovirus, RS virus), je ve škále i bakterie
Mycoplasma pneumoniae
59/98
Úkol 4: Stanovení protilátek
(respirační nákazy) (3)
●
odečtěte titry KFR u jednotlivých pacientů
●
věnujte pozornost kontrolám
antikomplementarity séra v prvním důlku
●
výsledek zakreslete, zapište titr a pokuste se o
interpretaci nálezu
60/98
Úkol 4: Stanovení protilátek
(respirační nákazy) (4)
●
chřipka A: oba titry 1:5 (pacient se s onemocněním
dříve setkal, ale nejedná se o akutní onemocnění)
●
chřipka B
●
parainfluenza
●
adenovirus
●
RS virus
●
Mycoplasma pneumoniae:
– vzestup titru v 1:10 na 1:160 (16 násobný
vzestup, alespoň čtyřnásobný vzestup je
signifikantní)
– silné podezření na právě probíhající infekci
Mycoplasma pneumoniae 61/98
žádné protilátky, tzn., že se
pacient s infekcí nikdy nesetkal
Neutralizační reakce
●
serologické metody, při nichž protilátka brání
běžným projevům antigenu (nejčastěji viru)
– virus neutralizační test:
●
Ab neutralizuje infekčnost viru
●
buněčná (tkáňová) kultura naočkovaná směsí viru
s Ab zůstane beze změny (metabolický efekt, pH,
fenolová červeň)
– hemaglutinačně inhibiční test
●
v přítomnosti Ab není virus schopen
aglutinovat erytrocyty (nikoli hemolyzovat!)
– ASLO = průkaz antisteptolyzinu O (protilátky
schopné vyvolat autoimunitní reakci), není to
nepřímý průkaz 62/98
ASLO (dg. pozdních následků
streptokokových infekcí)
●
po každé streptokokové infekci tvorba Ab, vč. Ab proti
streptolyzinu O (streptokokový toxin)
●
v případě, že množství těchto protilátek po infekci
stoupá, zkříženě reagují s některými strukturami
organismu → pozdní následky streptokokových
infekcí
●
revmatická horečka, akutní glomerulonefritida
●
ASLO: zjištění míry protilátkové odpovědi po
prodělané streptokokové infekci (neprokazujeme tedy
infekci – ta už proběhla – ale zda nedochází
k vývoji autoimunitní reakce)
●
hledáme přímo protilátky (ne patogen) ASLO tedy→
není nepřímý průkaz (patogenu) 63/98
ASLO (2)
●
neutralizace hemolýzy
●
streptolyzin O za běžných okolností (nepřítomnost
protilátek) hemolyzuje červené krvinky
NEG = hemolýza
●
v přítomnosti protilátky antistreptolyzinu O dochází
k zábraně hemolýzy a krvinky mohou sedimentovat
POZ = zábrana hemolýzy
●
titr nad cca 200 m.j. riziko pozdních následků
64/98
Jamka 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Hodnota
m.j.
100 120 150 180 225 270 337 405 506 607 759 911
Pozdní
následky
nehrozí hraniční hrozí
ASLO (3)
●
destička se odečítá naležato, první řádek je
pozitivní kontrola
●
další řádky jsou jednotliví pacienti
●
hodnoty ředění jsou uvedeny v protokolu
65/98
Úkol 5: HIT – hemaglutinačně
inhibiční test
●
máme několik pacientů s podezřením na klíšťovou
encefalitidu, již testovaných pomocí KFR (viz úkol 4)
●
HIT jako nezávislý test k ověření výsledků KFR
(pozor jedná se o jiné pacienty než v úkolu 4)
●
v přítomnosti Ab není virus schopen aglutinovat
erytrocyty (nikoli hemolyzovat!)
– POZ = sedimentace erytrocytů (protilátka
zabránila shlukování, erytrocyty sedimentují)
– NEG = shluk krvinek (protilátka nebyla přítomna
nebo jí byla příliš málo, nedokázala zabránit viru ve
shlukování krvinek)
66/98
Úkol 5: HIT – hemaglutinačně
inhibiční test (2)
67/98
Úkol 5: HIT – hemaglutinačně
inhibiční test (3)
●
odečtěte výsledky HIT u klíšťové encefalitidy – čtyři
pacienti (K, L, M, N), u každého akutní a
rekonvalescentní sérum
●
v prvním řádku je pozitivní kontrola
●
v prvním sloupci ředění 1 : 5 a dále geometrická
řada s koeficientem 2 (1 : 10, 1 : 20 atd.)
●
učiňte pravděpodobný závěr (akutní infekce/pouze
paměťové protilátky/...)
●
kontrola antigenu – kontroluje, že antigen (virus) bez
protilátky je schopen shlukovat
●
kontrola erytrocytů – kontroluje, že erytrocyty
neshlukují samy od sebe
68/98
Úkol 5: HIT – hemaglutinačně
inhibiční test (4)
●
správně mělo vyjít:
– jeden z pacientů je zřejmě akutně nemocen
– dva se s infekcí setkali
– jeden se nesetkal
69/98
Princip metod se značenými
složkami
●
základem jsou imunochemické reakce Ag-Ab in vitro
●
vysoce citlivé metody (citlivější než KFR, neutralizace
nebo aglutinace na nosičích; ty jsou zase citlivější než
obyčejná precipitace nebo aglutinace)
●
vlastnosti protilátek využívané v reakci:
– schopnost vázat se na široké množství Ag
– schopnost vázat se na povrch plastů (polystyren)
– specifita (i pro jednotlivé třídy Ab)
– síla vazby (kompex Ag-Ab je stabilní při použití
různých separačních metod nebo promývání)
●
pro detekci a kvantitativní vyjádření výsledku jsou
Ag nebo Ab značeny indikátorem 70/98
Princip metod se značenými
složkami (2)
●
indikátor:
– lze měřit s vysokou přesností a reprodukovatelností
– radioizotopové metody: radioaktivní izotopy (125I)
– neradioizotopové metody: enzym, fluorescenční
látka, koloidní částice apod.
●
vícesložkové reakce fungující jako řetězec (řetězec
různých Ag a Ab, poslední v řadě značen indikátorem)
●
první složka se váže na povrch, dále se postupně
navazují další jednotlivé složky
●
jeden z kroků je použití vzorku od pacienta (pokud
hledanou složku obsahuje, v dalších krocích se naváží
další složky a reakce bude pozitivní)
71/98
Princip metod se značenými
složkami (3)
●
promývání:
– pokud by v reakci zůstaly i nenavázané složky,
nedokázali bychom odlišit pozitivní a negativní reakci
– po každém kroku reakce následuje promytí →
zůstanou přítomny pouze složky navázané na
pevný povrch, resp. poslední článek řetězce
– je-li řetězec přerušen, promytí odplaví vše za
místem přerušení
72/98
Biokonjugace
●
chemická metoda vytvářející stabilní kovalentní
vazby mezi dvěma molekulami, z nichž alespoň
jedna je biomolekula (např. imunoglobulin)
●
druhá molekula může být např. fluorescenční barva,
enzym, léčivo, …
●
obě molekuly jsou spojeny linkerem
73/98
Konjugát
●
jedná se o protilátku proti protilátce
●
protilátka proti druhově specifickým Ig příslušného
izotypu (proti IgG, IgM, IgA)
●
biokonjugací je na protilátku navázán
– fluorofor (imunofluorescence)
– enzym, nejčastěji alkalická fosfatáza a křenová
peroxidáza (ELISA)
– částice, nejčastěji latexová, uhlíková, koloidní
zlato (imunochormatografie)
74/98
Imunofluorescence
přímá
75/98
Imunofluorescence
nepřímá
76/98
Imunofluorescence
nepřímá (2)
77/98
Výsledek přímé a nepřímé IMF
●
z podstaty nemůžeme odlišit přímou a nepřímou
metodu
●
nepřímé metody jsou citlivější (zesílení signálu)
78/98
Úkoly 6 a 7: Přímá a nepřímá IMF
●
popište jak vypadá výsledek přímé a nepřímé IMF
●
doplňte do schématu, která část je antigen,
protilátka, sekundární protilátka a značka
●
červeně vybarvěte složku získanou od pacienta,
modře vybarvěte složky dodané laboratoří
79/98
IMF vs. imunohistochemie
80/98
ELISA
●
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
●
jedna z nejpoužívanějších metod k detekci
antigenů i protilátek
●
možnost automatizace a vyšetření velkého počtu
vzorků naráz (obyčejně 96-jamkové destičky, jeden
pacient má jeden důlek)
●
k dispozici soupravy k průkazu Ag a Ab skoro proti
všem mikrobům v jednotlivých třídách Ig
●
nulové radiační nebezpečí oproti radioizotopovým
metodám → malé nároky na laboratoř a personál
●
dnes již poměrně levná metoda
81/98
ELISA (2)
82/98
alkalická fosfatáza
ELISA (3)
●
popište pozitivní a negativní reakci
83/98
Ověření avidity protilátek
u pozitivního pacienta
●
avidní roztok = roztok urey, který rozrušuje vazbu
Ag-Ab (nízkoavidní Ab podléhají rozrušení vazby více →
mohou být odstraněny v promývacím kroku)
●
možné vypočítat aviditu pomocí hodnot
absorbance v „nornálním“ důlku (N) a důlku s avidním
roztokem (Av)
index avidity: Av/N × 100× 100
●
poté nalezneme index aviditypoté nalezneme index avidity
84/98
Western blot (imunoblot)
●
to blot = přesát (z agaru na nitrocelulózovou
membránu)
●
slovní hříčka:
– Southern blot = analýza DNA (Edwin Southern)
– Northern blot = analýza RNA
– Western blot = analýza proteinů
– Eastern blot = detekce posttranslačních modifikací
●
technika přípravy hrubé směsi antigenů
●
elektroforetické rozdělení (SDS-PAGE): antigeny
jsou nejdříve za pomoci detergentu (SDS) rozděleny v
polyakrylamidovém gelu (PAGE) podle mol. hmotnosti
85/98
Western blot (2)
●
po rozdělení elektroforézou SDS-PAGE získáme gel s
jednotlivými frakcemi (polypeptidové proužky)
●
přesátí: z gelu můžeme přesát proužky buď opět
elektroforeticky nebo prostou kapilaritou (starší již
málo používaná metoda, časově náročná)
●
blokování: zbylá místa na membráně je třeba
vyblokovat (membrána váže proteiny!) levným
proteinem (BSA, kasein zředěné odstředěné mléko)→
●
detekce:
– na membráně jsou rozdělené Ag → metoda slouží
jen k detekci protilátek
– postupujeme jako při reakci ELISA
86/98
Western blot (3)
87/98
Western blot (4)
88/98
medmicro.info
●
vzhled proužku s přiloženou šablonou
Imunobloty (vyhodnocení)
●
jsou-li přítomny alespoň dva specifické pruhy
(zvýrazněné na šabloně) hodnotí se jako pozitivní
– výjimky např. u borreliových infekcí:
●
u IgG stačí, je-li pozitivní jen jeden pruh, je-li to
pruh vlsE (je vysoce specifický)
●
u IgM stačí, je-li pozitivní jen jeden pruh, je-li to
pruh ospC (je vysoce specifický)
89/98
Imunobloty (vyhodnocení) (2)
●
u moderního typu blotů se používají rekombinantní
antigeny, který jsou umístěny na povrch proužků
speciální technologií (místo SDS-PAGE)
●
imunoblot se umístí do skeneru a vyhodnotí se
stupeň „tmavosti“ pomocí speciálního software
●
možnost klasického vizuálního hodnocení
●
vyhodnoťte pozitivní kontrolu (předpokládá se, že bude
pozitivní pro borreliózu, ne nutně anaplasmózu),
negativní kontrolu a vzorky číslo 1 až 7
90/98
Imunobloty (vyhodnocení) (3)
91/98
Imunobloty (vyhodnocení) (4)
92/98
Imunochromatografické testy
●
jednoduše použitelná „zařízení“ pro odhalení
příslušného analytu (detekce patogenních
mikroorganismů, jejich toxinů apod.)
●
funguje na principu kapilarity (není potřeba promývat),
kdy analyt cestuje porézní vrstvou, promíchá se s
konjugátem a prochází přes testovací a kontrolní zónu
●
nitrocelulózová membrána, na které jsou
imobilizovány Ab tvořící testovací a kontrolní zónu
●
dále jsou obsaženy tři různé podložky:
– pro aplikaci vzorku
– konjugát (Ab-částice; koloidní zlato, latex, uhlík, …)
– absorpční (napomáhá vzlínání vzorku)
93/98
Imunochromatografické testy (2)
94/98
Imunochromatografické testy (3)
95/98Eltzov E. et al. Electroanalysis 2015, 27, 2116 – 2130
Po tomto cvičení byste měli umět:
●
diskutovat rozdíl mezi přímými a nepřímými metodami
●
popsat co je to antigen a co protilátka, včetně
vhodných příkladů v oblasti mikrobiologie
●
popsat obecný princip serologických reakcí
●
popsat precipitaci, aglutinaci a aglutinaci na nosičích,
včetně příkladů
96/98
Po tomto cvičení byste měli umět:
●
vysvětlit, co je to titr a dynamika titru, včetně
konkrétních případů, na kterých vysvětlíte o jaké
stádium onemocnění se jedná
●
vysvětlit, jakou roli má komplement v imunitních dějích
a které vlastnosti komplementu využívá serologie ve
svých metodách
●
vysvětlit princip KFR, včetně objasnění možností vzniku
falešné pozitivity a negativity a opatření, které
laboratoř činí, aby jim zabránila
●
vysvětlit rozdíl mezi aglutinací a neutralizací a uvést
neutralizační metody používané s serologii
●
diskutovat význam ASLO, včetně jeho provedení
97/98
Po tomto cvičení byste měli umět:
●
vysvětlit úlohu jednotlivých tříd protilátek
●
vysvětlit pojmy afinita a avidita včetně možností
uplatnění v diagnostice
●
vysvětlit principy metod se značenými složkami a jejich
využití v diagnostice
●
popsat rozdíly mezi přímým a nepřímým uspořádáním
metod se značenými složkami
98/98