P07b
Diagnostika anaerobních
bakterií
VLLM0522c (podzim 2017)
Osnova
●
rod Clostridium
●
přehled nejběžnějších druhů nesporulujících
anaerobů
●
diagnostika anaerobů
●
anaerobióza
●
úkoly
2/41
Rod Clostridium
●
G+ tyčky, anaerobní, spóry (oválné či kulaté
endospory vyklenující buňku)
●
kvůli správné funkci některých enzymů vyžadují k růstu
nižší redoxní potenciál (snížení cysteinem,
thioglykolátem apod.)
●
některé druhy tolerují malá množství kyslíku
(enzymy superoxiddismutáza, peroxidáza, kalatáza)
●
saprofyté v půdě (hnilobné procesy) a ve vodě,
součástí normální mikroflóry člověka i živočichů
●
k rozšíření napomáhá tvorba vysoce odolných
endospor (přitomny v půdě, vodě, prachu →
kontaminace potravin)
●
čím kratší inkubační doba, tím horší prognóza 3/41
Clostridium tetani
●
G+ tyčka, anaerobní, rovné,
štíhlé, terminální endospora
(„paličky na buben“)
●
saprofyt savců (zejména koní)
●
původce tetanu (vstupní branou obvykle hlubší
znečištěné rány, méně často popáleniny, vředy apod.)
●
pro klíčení spor nutné anaerobní prostředí (zhmožděné
a ischemické okolí rány, hnisavé procesy, cizí těleso v ráně)
●
za projevy infekce zodpovědný tetanický toxin
●
závažnost klinických projevů závislá na množství
produkovaného neurotoxinu
●
očkování součástí hexavakcíny, přeočkování jednou
za 10 – 15 let
4/41
Clostridium tetani (2)
●
tetanus – patofyziologie:
– tetanospasmin proniká do neuronu → poškození
exkrečního aparátu neuronů → zábrana
uvolňování inhibičních mediátorů (GABA, glycin) →
zablokována normální inhibice motorických neuronů →
snížení prahu dráždivosti motorických neuronů →
tonické křeče příčně pruhovaného svalstva
●
tetanus – klinické příznaky:
– tonické křeče (při plném vědomí) žvýkacích svalů
(trismus), mimických svalů (risus sardonicus),
svalů laryngu a krku, svalů trupu (opistothonus),
dýchacích svalů (vede k udušení)
– zvýšené pocení a teplota, komplikace (zlomeniny, ...)
5/41
Clostridium tetani (3)
6/41
Clostridium botulinum
●
G+ tyčka, anaerobní, rovné,
velké, oválná subterminální
endospora
●
komenzál ve střevech zvířat ve vodě, půdě, …→
●
tvoří botulotoxin otravy potravinami→
kontaminovanými sporami (nedostatečně sterilizované
masové a zeleninové konzervy; 100 °C 10–15 minut)
●
botulotoxin je endopeptidáza → hydrolýza proteinů
zodpovědných za transport vezikul s acetylcholinem
→ inhibice uvolňování acetylcholinu → paralýza
příčně pruhovaných svalů
●
využití v kosmetice (botox)
7/41
Clostridium botulinum (2)
8/41
Clostridium botulinum (3)
9/41
Clostridium botulinum (4)
●
formy botulismu:
– alimentární botulismus:
●
požití toxinu v potravě (mikrob samotný není v
těle přítomen)
●
nevolnost, zvracení, bolesti břicha, pokles očního
víčka (ptóza), rozšíření zornic (mydriáza), ztížené
polykání, zácpa, zástava močení, symetrické
sestupné paralýzy, ochrnutí dýchacích svalů
●
vědomí a citlivost zůstávají nezměněny
– traumatický botulismus (infekce rány)
– kojenecký botulismus (toxin produkován přímo ve
střevě dítěte)
10/41
Klostridia anaerobních traumatóz
●
C. perfringens, C. septicum, C. novyi
●
různé klinické projevy (typicky inkefce měkkých
tkání – kůže, podkoží, svaly) od kontaminace ran,
přes hnisavě-nekrotické procesy s lokálním účinkem
toxinů po plynatou sněť (vysoce invazivní nekrotické
procesy s celkovou intoxikací)
●
některé kmeny způsobují svými toxiny nekrotizující
enterokolitidy
●
celková stabilizace pacienta, chirurgické ošetření
ran, ATB, léčba kyslíkem v hyperbarické komoře
11/41
Plynatá sněť
12/41
Clostridium difficile
●
přítomno ve střevech (5 % zdravých dospělých, více u
dělí a kojenců)
●
způsobuje lehčí průjmy, ale i pseudomembranózní
kolitidu
●
onemocnění často nozokomiálního původu (po
podání antibiotik)
– především klindamycin, širokospektré peniciliny
(amoxicilin+klavulanát) a cefalosporiny (cefoxitin)
– tato ATB eliminují normální střevní mikroflóru →
přemnožení C. difficile (rezistentní)
– léčba metronidazol, vankomycin per os, fekální
transplantace (FMT – fecal microbiota transplantation)
13/41
Clostridium difficile (2)
14/41
Clostridium difficile (3)
15/41
Přehled klostridií
16/41
C. tetani původce tetanu
C. botulinum producent botulotoxinu
C. perfringens,
C. septicum, C. novyi, aj.
klostridia plynatých snětí
(+ enteropatogenita)
C. difficile enteropatogenní
Přehled nejběžnějších druhů
nesporulujících anaerobů
●
text
17/41
Koky Tyčky
G+ Peptococcus
Peptostreptococcus
Propionibacterium***
Eubacterium
G– Veillonella Fusobacterium, Leptotrichia*
Bacteroides, Prevotella,
Porphyromonas**
* tyčky se zašpičatělými konci
** tyčky s rovnými konci
*** není obligátní anaerob
Nesporulující anaerobní G+ koky
●
rody Peptococcus a Peptostreptococcus
– běžná mikroflóra GIT a vaginy infekce→
endogenního původu
– zánětlivé procesy v malé pánvi (poporodní
endometritidy, …), periodontitidy, abscesy
(peritonsilární, plicní, ...), sinusitidy, otitidy,
peritonitidy při proniknutí střevního obsahu do dutiny
břišní
18/41
Nesporulující anaerobní G+ tyčky
●
rod Propionibacterium
– tyčky kyjovitého tvaru morfologicky podobné rodu
Corynebacterium
– běžná mikroflóra dutiny ústní, GIT, urogen. traktu
– nejvýznamnější Propionibacterium acnes
– produkuje lipázy → vznik a rozvoj akné
– izolován i z hemokultur při endokarditidách a sepsích
●
rod Eubacterium
– běžná mikroflóra dutiny ústní, GIT, urogen. traktu
– bakteriální vaginózy, smíšené anaerobní infekce
19/41
Nesporulující anaerobní G– koky
●
rod Veillonella
– běžná mikroflóra flóru dutiny ústní (součást
zubního plaku), nosohltanu, GIT a urogen. traktu
– smíšené anaerobní infekce (zejména) ústní dutiny,
výjimečně meningitidy, osteomyelitidy
– Veillonella parvula původcem endokarditidy či
sepse
20/41
Nesporulující anaerobní G– tyčky
●
běžná mikroflóra lidského těla (dutina ústní,
nosohltan, GIT, urogen. trakt)
●
značně pleomorfní (obyčejně tyčky, ale i koky nebo
vlákna), netvoří spóry, pestrá biochemická aktivita
využití v diagnostice→
●
původci infekcí endogenního původu
●
terapie ATB (klindamycin, linkomycin, metronidazol,
chloramfenikol, peniciliny s inhibitory beta-laktamáz)
většinou v kombinaci s chirurgickým výkonem
21/41
Nesporulující anaerobní G– tyčky (2)
●
rod Bacteroides
– nejčastěji izolované z infekcí (dutina břišní, malá
pánev, vagina, dutina ústní, …)
– Bacteroides fragilis
●
rod Porphyromonas
– infekce dutiny ústní (gingivitidy, gingivostomatitidy) a
urogenitálního traktu
– Porphyromonas gingivalis
●
rod Prevotella
– infekce HCD (anginy, sinusitidy)
– Prevotella melaninogenica
22/41
Nesporulující anaerobní G– tyčky (3)
●
rod Fusobacterium
– polymorfní, až vřetenovitý tvar
– infekce chirurgických a traumatických ran, komplikují
rány po kousnutí zvířetem, směsné kultury při
pneumonii, hrudním empyému, intraabdominální
infekci a abscesech
– Fusobacterium nucleatum (součást zubního plaku)
– Fusobacterium necrophorum (nekrotizující tonsilitida)
●
rod Leptotrichia
– součást ústní mikroflóry
– Leptotrichia buccalis (orodentální infekce)
23/41
„Veillonova flóra“
●
název pro skupinu anaerobních G+ a G–
nesporulujících bakterií kolonizujících kůži a
sliznice člověka
●
není možné jednoznačně označit hlavního původce
onemocnění
●
za původce onemocnění se pokládají rovnoměrně
všechny bakterie, kterých bývá izolován větší počet →
za etiologického původce se pokládá celá tzv. Veillonova
flóra
●
součástí např. rody Peptococcus, Peptostreptococcus,
Veillonella, Eubacterium, Propionibacterium,
Fusobacterium , Bacteroides, ...
24/41
Lactobacillus acidophilus
●
nejvýznamnější zástupce rodu („Döderleinův bacil“)
●
G+ tyčky, často v řetízcích, mikroaerofilní (ne
anaerobní, nicméně rostou v nedokonalé anaerobióze
běžných anaerostatů)
●
běžná mikroflóra dutiny ústní, GIT, vaginy
●
laktobacily utilizují sacharidy na laktát snížení pH→
zastavuje množení hnilobných bakterií→ (využití i v
potravinářství)
●
utilizace glykogenu (z rozpadajících se epitelií) ve
vagině snížení pH brání usídlení patogenů→
●
může způsobovat endokarditidy, novorozenecké
meningitidy, endometritidy, abscesy, ...
25/41
Vztah bakterií ke kyslíku
* V praxi někdy vyrostou – běžně dosahovaná anaerobióza není dokonalá.
** V praxi někdy nevyrostou – běžně dosahovaná anaerobióza není dokonalá.
Takové bakterie (EOS – Extremely oxygen sensitive) běžně nelze kultivovat.
26/41
Prostředí Normální ↓O2 ↑CO2
Bez O2
Striktní aeroby ano ano ano ne*
Fakultativ. anaeroby ano ano ano ano
Aerotolorantní bakt.
Mikroaerofilní bakt. ne ano (ano) ne*
Kapnofilní bakterie ne (ano) ano ne*
Striktní anaeroby ne ne ne ano**
Diagnostika anaerobů
●
mikroskopie: barvíme podle Grama, rozlišujeme na
koky a tyčky, G+ a G–; anaerobní tyčky pleomorfní
(nacházíme i vláknité formy a koky), u spor sledujeme
morfologii a uložení (světlolomné útvary, nikoliv jen
ztluštění tyčky!)
●
kultivace: pevné půdy (anaerobióza pomocí anaerostatu
či anaerobního boxu), tekuté půdy přelité parafinem
(VL bujón, VL krevní agar a různé speciální půdy);
většinou prodloužená kultivace na 2 dny až týden
●
biochemie: většinou KAT– a OXI–, možné vzájemné
rozlišení biochemicky a analýza plynů chromatografií
●
antigenní analýza a nepřímý průkaz se v diagnostice
anaerobů příliš nepoužívají
27/41
Diagnostika anaerobů (2)
●
přednost má tekutý vzorek, např. hnis, nejlépe
zaslaný ve stříkačce s krytkou (po odstříknutí
přebytečného vzduchu) – dříve doporučený postup, kdy
se na stříkačce ponechala jehla a zabodla do gumové
zátky se již z bezpečnostních důvodů nedoporučuje
●
výtěr zanořen v transportní půdě (např. Amiesova
půda)
●
lze domluvit s laboratoří naočkování vzorku přímo na
půdy např. peroperačně
28/41
Kultivace anaerobních bakterií
●
rostou často v nepravidelných koloniích, někdy
výběžkaté okraje, někdy pigment
●
typický je pro ně značný (hnilobný) zápach
●
pro kultivaci anaerobů používáme VL krevní agar
●
získávání anaerobiózy:
– mechanicky: VL bujony přelijeme parafinovým
olejem
– fyzikálně: v anaerobním boxu se nahradí vzduch
směsí anaerobních plynů, vháněných z bomby
– chemicky: z organických kyselin tvoří H2 a CO2 →
na palladiovém katalyzátoru reaguje H2 s O2 za
vzniku vody O→ 2 se spotřebovává
29/41
Anaerobní box
30/41
Mikrobiologický ústav, foto O. Z.
zdroj anaerobních
plynů
prostor pro
vkládání misek
vstupy pro ruce
personálu
Anaerostat
31/41
vzduchotěsné víčko
palladiový katalyzátor
(pod víčkem)
konstrukce pro
ukládání Petriho misek
generátor anaerobiózy
(sáček s chemikáliemi)
tlakový
ventil
šroubovací
uzávěr
Úkol 1: Mikroskopie klinického
vzorku a mikroskopie kmene
●
úkol 1a: Prohlídka klinického vzorku (popište směs
patogenů, leukocyty, epitelie, atd.)
●
úkol 1b: Mikroskopie podezřelých kmenů (rozlište
G+ a G– koky a tyčky, pokuste se najít spóry)
32/41
Úkol 2: Anaerostat a anaerobní box
●
popište anaerostat a anaerobní box podle obrázku
z prezentace
33/41
Úkol 3: Kultivace na agarových
půdách
●
popište kultivační výsledky daných kmenů na
aerobních i anaerobních půdách
●
popište morfologii kolonií
34/41
Úkol 4: Druhová diagnostika
anaerobů biochemickými testy
●
odečtěte ANAEROtest 23
●
výsledky sloupců „B“ a „A“ se při výpočtu kódu
nezapočítávají, získáte tedy šestimístný kód za
sloupce H až C
●
u druhého z kmenů vyjdou dvě možnosti výsledku
●
předpokládejte, že tento kmen byl již testován na
citlivost na penicilin a byl shledán citlivým nejde→
tedy o zástupce (primárně na penicilin resistentního)
rodu Bacteroides
35/41
Úkol 5: Citlivost anaerobů na
antibiotika
●
lékem volby u většiny anaerobů penicilin
●
rezistentní je však rod Bacteroides (v užším slova
smyslu – rody Prevotella a Porphyromonas, které se
z něj kdysi odštěpily, jsou citlivé)
●
antibiotická citlivost se u anaerobů dříve prováděla
difusním diskovým testem (nikoli na MH, ale na VL
krevním agaru)
●
nyní se ale zpravidla používá E-test
●
odečtěte hodnotu MIC a určete, zda je daný kmen
citlivý nebo rezistetní (odečítá se v místě, kde se
kříží okraj zóny s testovacím proužkem)
36/41
Úkol 6a: Průkaz toxinu (lecitinázy)
Clostridium perfringens
●
Clostridium perfringens tvoří specifickou lecitinázu,
jež je možno neutralizovat specifickou protilátkou
●
polovina misky je potřena protilátkou (anti-lecitinázou),
druhá potřena není
●
toxický efekt lecitinázy spatříte jako oblast
precipitace kolem kmene na žloutkovém agaru
●
pravý toxin je
neutralizován
antitoxinem,
jiné lecitinázy
neutralizovány
nejsou
37/41
Úkol 6a: Průkaz toxinu (lecitinázy)
Clostridium perfringens
●
pravý toxin je neutralizován antitoxinem, jiné
lecitinázy neutralizovány nejsou
●
„Negativní I“ vůbec neprodukuje lecitinázu
●
„Negativní II“ produkuje, ale nějakou jinou, než
nás zajímá
38/41
Úkol 6b: Průkaz toxinu Clostridium
tetani
●
průkaz toxinu Clostridium tetani se prování
očkováním tetanické myš
●
typická je pozice ocásku a končetin (zakreslete)
39/41
microvet.arizona.edu Obrázek Petra Ondrovčíka (graficky upraveno)
Úkol 6c: Detekce A a B toxinů
Clostridium difficile
●
odečtěte imunochromatografické testy tří pacientů
40/41
test
přítomnosti
klostridiového
antigenu
test toxinů
A a B
kontrola
Po tomto cvičení byste měli umět:
●
popsat hlavní zástupce rodu Clostridium, včetně testů,
které slouží pro jejich identifikaci, popř. identifikaci
jejich toxinů
●
popsat nejběžnější druhy nesporulujících anaerobů,
jejich diagnostiku a obvyklou léčbu
●
popsat základy anaerobní kultivace a možnosti získání
anaerobiózy
41/41