P08
Acidorezistentní bakterie
Spirochety
Bi7170c (podzim 2017)
Osnova
●
acidorezistence
●
rod Mycobacterium (TBC, lepra,
mykobakteriózy)
●
Actinomyces spp., Nocardia spp.
●
spirochety
2/57
Acidorezistence
●
vysoký obsah lipidů v buněčné stěně
– vysoce hydrofobní
– tvoří fosfolipidy, glykolipidy a lipoproteiny
– mykolové kyseliny
●
obtížná barvitelnost (hydrofilními) organickými
barvivy (nebarví se Gramovým barvením)
●
odolnost ke kyselinám (využití při Ziehl-Neelsenově
barvení), zásadám (využití při kultivaci) i alkoholům
●
typická pro mykobakterie
●
částečně pozorováno u aktinomycet a nokardií
3/57
Acidorezistence (2)
4/57
Rod Mycobacterium
●
G+ nepohyblivé, nesporulující, aerobní
●
dlouhá generační doba kultivace až v řádu týdnů→
●
acidorezistence, alkalirezistence
●
přežívání uvnitř makrofágů (hlavní roli má buněčná
imunita minimum protilátek)→
●
odolné k vyschnutí a dezinfekčním látkám (nestačí
spektrum A; T = TBC, M = atypické mykobakterie)
●
M. tuberculosis – TBC
●
M. leprae – lepra (malomocenství)
●
M. bovis; M. bovis BCG (očkovací kmen)
●
atypické mykobakterie 5/57
Tuberkulóza (TBC)
●
Mycobacterium tuberculosis (bacil Kochův, BK),
vzácně M. bovis
●
obvykle vstup přes plíce (vzácně přes GIT nebo ránou)
●
vznik primárního komplexu (zánětlivé ložisko v
plicním parenchymu, zánět a zvětšení příslušné
regionální mízní uzliny) → buněčná imunita hojení→
fibrotizací nebo kalcifikací
●
spontánní celkové zhojení
●
ložiska infekce (granulomy neboli tuberkly)
kaseifikují (latentní forma) jádro se rozpadne a→
zkapalní infekční obsah se uvolňuje to bronchů→
vykašlávání (otevřená TBC)→
●
šíření krví (inf. kteréhokoli orgánu) – miliární TBC6/57
Postprimární TBC
●
za několik týdnů až mnoho let po primární infekci
(reaktivace primární infekce, někdy superinfekce)
●
reaktivace po opakované infekci mykobakteriemi,
progrese primární infekce např. po těžké respirační
infekci, u oslabených jedinců (stáří, alkoholici,
imunokompromitovaní)
●
otevřená TBC
– kašel, hemoptýza
(chrchlání krve),
zvýšená teplota,
hubutí
– někdy bezpříznaků
7/57
Léčba TBC
●
vždy kombinace antituberkulotik (vznik rezistence)
●
1. řada: izoniazid, rifampicin, pyrazinamid,
etambutol, streptomycin
●
2. řada: amikacin, kanamycin, capreomycin, ofloxacin,
ciprofloxacin, cykloserin, rifabutin, …
●
MDR (multidrug-resistant): izoniazid a rifampicin
●
XDR (extensively drug-resistant): izoniazid, rifampicin,
fluorochinolony, amikacin/kanamycin/capreomycin
●
léčba 4 až 12 měsíců:
– iniciální: čtyřkombinací po 2 měsíce (snížení množ.)
– pokračovací: dvojkombinací (sterilizace ložiska)
8/57
Očkování proti TBC
●
donedávna povinné očkování novorozenců živou
vakcínou BCG (kalmetizace, bacille Calmette-Guérin)
– připraveno z kmene M. bovis pasážováním
●
donedávna povinné přeočkování při negativním výsledku
kožního tuberkulinového testu
●
2010 – plošné očkování zrušeno → selektivní očkování
– povinně očkovaní jen ohrožení novorozenci
(např. předchozí výskyt v rodině, rodiče udávají delší
pobyt v zemích se zvýšenou incidencí TBC)
– ve vzácných případech defektu imunity docházelo po
kalmetizaci ke generalizované infekci očkovacím
kmenem
9/57
asd
●
asd
10/57
asd
●
asd
11/57
asd
●
asd
12/57
Lepra (malomocenství)
●
Mycobacterium leprae (Hansenův bacil)
●
extrémně dlouhá generační doba (cca 2 týdny),
inkubační doba několik let
●
růst při nižší teplotě (30 °C) okrajové části těla→
●
často bez příznaků, málo nakažlivá (kromě kožní formy
s vředy)
●
může se vyvinout destruktivní forma (napadá
Schwannovy bb. a makrofágy v PNS, ničí imunitní bb.)
●
neexistuje vakcína, ale ochranný účinek má očkování
proti tuberkulóze
●
léčba: dapson + rifampicin + clofazimin (měsíce až léta)
13/57
Lepra (projevy)
14/57
léze na končetinách
vředy a nekróza na
tváři (facies leontina)
Atypická mykobakteria
●
podmíněně patogenní (tzv. mykobakteriózy)
●
rezistentní na řadu antituberkulotik
●
M. avium komplex (M. avium ssp. avium, M. avium
ssp. paratuberculosis, M. intracellulare)
– lymfadenitidy, plicní procesy podobné TBC
●
M. kansasii, M. xenopi (plicní infekce)
●
M. marinum – kožní léze (fish tank granuloma,
swimming pool granuloma)
●
M. ulcerans – burulský vřed
●
M. smegmatis – nepatogenní, součást mikroflóry
15/57
Přímý průkaz TBC
●
mikroskopie: Ziehl-Neelsenovo barvení
(modifikace dle Kinyouna)
●
kultivace: speciální vaječné půdy (moření louhem
kvůli usmrcení ostatních bakterií)
●
automatická kultivace: kultivace v automatech,
které detekují pozitivitu dříve
●
biochemické rozlišení: pouze specializované laboratoře
●
pokus na zvířeti: morče (na ústupu)
●
PCR diagnostika: nabývá na důležitosti
16/57
Nepřímý průkaz TBC
●
tvorba protilátek je minimální (pozitivní nález je
známkou infekce, negativní nález nemá hodnotu)
●
testování buněčné imunity
●
kožní (tuberkulinový) test dle Mantouxové
– testování po vakcinaci
– pozitivní nález: mírné zarudnutí a zatvrdnutí v okolí
místa vpichu po 3 dnech
●
test uvolňování INFγ (reakce pacientových buněk na
antigen) – test QuantiFERON-TB
17/57
QuantiFERON-TB
●
vyšetření indukovaného uvolňování INFγ
●
při TBC (i latentní) tuberkulózní antigeny aktivují
T-lymfocyty, které tvoří velké množství INFγ
●
odebírá se nesrážlivá (heparinizovaná) krev do tří
zkumavek:
– 1. zkumavka: obsahuje mitogen (MIT)
phytohemagglutinin – zde by mělo dojít ke stimulaci
tvorby INFγ vždy (kromě nedostatku/snížené aktivity
lymfocytů)
– 2. zkumavka: obsahuje antigeny TBC (TB) – ke
stimulaci tvorby INFγ dojde při infekci TBC
– 3. zkumavka: pro odečet pozadí (NIL)
(nespecifický INFγ, heterofilní protilátky) 18/57
QuantiFERON-TB - hodnocení
●
pozitivní: ve zkumavce TB T-lymfocyty reagují na
stimulaci antigenem, ve zkumavce NIL (pozadí)
nedochází k tvorbě interferonu
●
negativní: T-lymfocyty reagují na stimulaci mitogenem
(MIT) ale nereagují na stimulaci antigenem
mykobakterie (TB)
●
neurčitý výsledek: T-lymfocyty nereagují na stimulaci
mitogenem (MIT) nebo ve zkumavce NIL (pozadí)
dochází k tvorbě interferonu
19/57
Actinomyces spp.
●
anaerobní vláknité grampozitivní bakterie (částečně
acidorezistentní špatně se barví Gramovým barvením)→
●
běžně v dutině ústní, nosohltanu, střevě, vagině, …
→ endogenní nákazy
●
aktinomykóza (A. israeli, A. naeslundi)
– cervikofaciální, intrathorakální, abdominální,
kožní, děložní
– abscesy (chronické podkožní
abscesy) a píštěle
●
osteomyelitida (A. israeli)
20/57
Nocardia spp.
●
G+ aerobní tyčky až vlákna, částečně acidorezistentní
●
půdní bakterie (subtropy, tropy) → exogenní nákazy
●
chronické kožní abscesy
●
N. asteroides - plicní infekce (možná diseminace,
mozkové abscesy)
●
N. brasiliensis
(podkožní abscesy)
21/57
Spirochety
●
rody Borrelia, Treponema, Leptospira
●
spirální pohyblivé bakterie (axiální bičíky
v periplazmatickém prostoru)
●
buněčná stěna podobná G- bakteriím, ale nebarví se
podle Grama, velice obtížná kultivace
●
mikroskopie v zástinu, fluorescenční mikroskopie
22/57
Rod Borrelia
●
původci lymské boreliózy
– B. burgdorferi sensu lato
●
B. burgdorferi sensu stricto (USA + Evr.;
postižení kloubů a myokardu)
●
B. afzelii (Evr. + Asie; kožní příznaky)
●
B. garinii (Evr. + Asie; neurologické projevy)
●
původci návratných horeček
– B. recurrentis
– B. duttoni
– B. hermsii
23/57
Lymeská borelióza
●
zoonóza, přenos klíšťaty (v ČR Ixodes ricinus),
rezervoár hlodavci, ptáci
●
incidence v ČR: 40/100 000 obyvatel
●
často spontánní uzdravení
●
protilátky asi u 10 % zdravých osob
●
prodělané onemocnění
chrání jen částečně
●
ATB: beta-laktamy,
tetracykliny
24/57
Stádia lymské boreliózy
●
časné lokalizované
– erythema migrans (3–30 dní)
– nespecifické příznaky
●
časné diseminované
– borreliový lymfocytom (často uši)
– neurologické, kardiální, revmatologické projevy
●
pozdní diseminované
– chronická encelafomyelitida, artritida
– acrodermatitis chronica atrophicans (degenerace
podkoží, ztenčená kůže)
25/57
Rod Treponema
●
Treponema pallidum
– ssp. pallidum – syfilis (pohl. nemoc, přenos sex.)
– ssp. endemicum – endemická syfilis (bejel) – léze
na ústní sliznici
– ssp. carateum – pinta – kožní léze (Lat. Am.)
– ssp. pertenue – framboesie – kožní léze (Afr., JV
Asie, J. Am.)
●
Treponema denticola – nepatogenní, popř.
periodontitida
26/57
Syfilis (lues)
●
T. pallidum ssp. pallidum
●
klasická pohlavní nemoc (přenos sexuálně)
●
časná syfilis
– primární (ulcerace v místě vstupu – na genitálu,
ulcus durum, tvrdý vřed
– sekundární (diseminace, horečka, bolesti hlavy,
artralgie, anorexie, generalizovaná vyrážka +
kondylomata – kožní a slizniční léze)
– časná latentní (během 1. roku po překonání
sekundárního stadia, asymptomatické období, možné
relapsy sekundárního stadia)
27/57
Syfilis (2)
●
pozdní
– pozdní latentní (není
epidemiologické riziko,
možné pozdní příznaky)
– terciální
●
gummata – měkké záněty
(nejčastěji játra, kosti, kůže)
●
neurosyfilis – meningitida, progresivní paralýzy,
demence, tabes dorsalis (poruchy polohocitu,
chůze, čití, ...)
●
kardiovaskulární záněty, aneurysma (aorta)
●
vrozená syfilis (potrat nebo sekundární stadium)
28/57
Diagnostika syfilis – přímý průkaz
●
přímý průkaz se provádí zřídka
●
mikroskopie: nativní preparát (mikroskopie v
zástinu, fluorescenční mikroskopie
●
kultivace a biochemie: nepoužívá se
●
průkaz antigenu imunofluorescenčně
●
pokus na zvířeti: rabbit infectivity test (RIT), očkování
do varlat novozélandského bílého králíka (orchitida za
10 dní) – dnes raritní
●
PCR diagnostika
29/57
Diagnostika syfilis – nepřímý průkaz
●
netreponemové testy:
– RRR (rychlá reaginová reakce) RPR (rabbit-plasma
reagin test) VDRL (venereal disease research
laboratory)
– zjišťuje se přítomnost nespecifických protilátek
proti kardiolipinu
– detekovatelné cca 4 týdny po infekci
●
treponemové testy
●
antigen je z T. pallidum
●
TPHA – T. pallidum pasivní hemaglutinační test
(TPPA – T. p. particle agglutination)
●
ELISA, FTA-ABS, western blotting
30/57
Přehled testů na syfilis
Historický
BWR – Bordet
Wassermann Netreponemové
Screening
RRR/RPR/VDRL
TPHA/TPPA/anti-TP
Treponemové
Konfirmace
ELISA
FTA-ABS
Western blotting
Historický
(superkonfirmace)
TPIT (Treponema
Pallidum Imobilizační
Test) = Nelson
31/57
Leptospira interrogans
●
jemné závity, na koncích ohnuté
●
nákaza kontaktem s močí infikovaného zvířete –
hlodavci, prase, skot, … (koupání v přírodních vodních
zdrojích, konzumace kontaminované vody)
●
vstup kůží (pravděpodobně i neporušenou) nebo
sliznicemi (typicky spojivkou)
●
serovar Grippotryphosa – polní/žňová/blaťácká
horečka
– chřipkovité příznaky, anikterická forma
●
serovar Icterohemorrhagiae – Weilova nemoc
– nejdříve podobné blaťácké horečce, poté ikterus,
krvácivé projevy na kůži a sliznicích, renální selhání
32/57
Úkol 08/1a+b: Barvení dle
Ziehl-Neelsena, mikroskopie
●
barvení dle Ziehl-Neelsena
– barvíme karbolfuchsinem (Gabbet) za horka až do
výstupu par (po odpaření části barviva ho
doplníme a opět zahříváme, opakujeme celkem 3x)
– zahřívání provádíme v dostatečné vzdálenosti, aby v
průběhu neprasklo podložní sklíčko)
– odbarvujeme cca 15 sekund kyselým alkoholem
(směs ethanolu s HCl nebo H2SO4), opláchneme
vodou
– dobarvujeme pozadí malachitovou zelení nebo
metylénovou modří
– barvení lze použít i pro střevní kokcidie
(kryptosporidia a cyklospory) 33/57
Úkol 08/1a+b: Barvení dle
Ziehl-Neelsena, mikroskopie (2)
34/57
Úkol 08/1c: Mikroskopie kmenů
aktinomycet a nokardií (Gram)
35/57
aktinomycety – větvení
ve variabilní úhlu
nokardie – časté větvení
v pravém úhlu
Úkol 08/2: Kultivace mykobakterií,
aktinomycet a nokardií
●
M. tuberculosis:
●
před kultivací moření louhem
●
tekuté půdy: Šulova, Baničova (nárůst na dně
zkumavky – modrý/bílý
●
pevné půdy: Ogawova či LöwensteinJenssenova
(půdy neobsahují agar – tuhost
dodává vaječný bílek)
●
pevné půdy se nalévají do zkumavek a uzavírají
zátkou (vyschnutí půdy při dlouhé kultivaci)
●
odečítání výsledků: za 1 týden (kontrola
kontaminace) 3 (rychle rostoucí mykobakterie),
6 (obvykle pozitivní nálezy) a 9 (pomalu rostoucí
mykobakterie) týdnů kultivace
36/57
Úkol 08/2: Kultivace mykobakterií,
aktinomycet a nokardií (2)
37/57
růst na pevné půdě
Úkol 08/2: Kultivace mykobakterií,
aktinomycet a nokardií (3)
38/57
aktinomycety – nepravidelné kolonie
s lalůčky a výběžky
nokardie – nepravidelné
kolonie, suchý vzhled
Úkol 08/3a: Určení citlivosti
mykobakterií na antituberkulotika
●
kombinace tří čtyř antituberkulotik (rychlý vznik
rezistencí, některá působí jen intracelulárně nebo
extracelulárně)
●
nelze používat difúzní diskové testy
●
antituberkulotika přidáváme přímo do (pevné)
kultivační půdy + zařadíme kontrolu růstu
●
mykobakterium roste: rezistentní
●
mykobakterium neroste: citlivé
39/57
Úkol 08/4: PCR v diagnostice TBC
40/57
Úkol 08/5: Diagnostika lepry
●
pásovec devítipásý
●
lepromin
– antigen z usmrcených
bakterií M. leprae
– získávaný z tkání
infikovaných lidí
nebo pásovce
●
leprominový test
– kožní test (obdoba tuberkulinového testu u TBC)
41/57
Úkol 08/6: Nepřímý průkaz TBC
pomocí QUANTIFERON©-TB Gold
●
pokuste se interpretovat výsledky testů u pacientů
(hodnoty uvedeny v IU/ml)
42/57
NIL TB mínus
NIL
MIT mínus
NIL
Konečná
interpretace
testu
Přítomnost
infekce
M. tuberculosis
≤ 8,0 < 0,35 ≥ 0,5 negativní Nepravděpodobná
≥ 0,35 jakákoli
hodnota
pozitivní Pravděpodobná
< 0,35 < 0,5 nejistá Nelze určit
> 8,0 jakákoli
hodnota
jakákoli
hodnota
Nelze určit
Úkol 09/1: Průkaz protilátek proti
B. garinii metodou ELISA
●
Pacient J: klinicky definované erythema migrans
(jasný obraz, ne jen podezření)
●
Pacient K: cítí se ospalý, v létě měl klíště; jiné potíže
nejsou přítomny
●
Pacient L: neurologové nalezli typické klinické
příznaky neuroboreliózy
●
Pacient M: zdravá osoba, ale v létě měl klíště, a cítí
se ohrožen rizikem borreliózy, protože si přečetl o
tomto riziku.
●
Pacient N: je u něj podezření na neuroboreliózu,
avšak není jasné
43/57
Úkol 09/1: Průkaz protilátek proti
B. garinii metodou ELISA (2)
●
průkaz protilátek ve třídách IgM a IgG
●
výsledky reakce ve formě absorbance
●
pozitivní hodnoty jsou vyšší než hodnota
kalibrace (CAL) (K+ a K- jsou kontroly, důlky B1 a C1)
44/57
Úkol 09/2: Průkaz protilátek proti
B. garinii pomocí WB
●
konfirmace pokud je pozitivní reakce ELISA nebo
klinické důvody (J – klinické důvody)
●
pozitivní WB:
– IgM: pozitivita v pruhu p25 a OspC
– IgG: pozitivita v pruhu VlsE
45/57
Úkol 09/3: Dg. borreliózy PCR
●
PCR je přímý průkaz (průkaznější než hledání
protilátek) zvláště u čerstvé infekce, kdy ještě nejsou
vytvořeny protilátky
●
k PCR jsou indikováni pacienti L a N
●
pozitivita: svítící proužek
●
IC nebyla použita, vpravo je ladder
46/57
Výsledky úkolů 09/1-3
ELISA WB PCR
IgM IgG IgM IgG
J (erythema migrans) - - - K
(klíště v létě) - + - +
L (příznaky neurobor.) + + + + +
M (zdravý) - + - +
N (podezření neurobor.) + - - - -
47/57
Závěry k úkolům 09/1-3
●
J: nutno léčit doxycyklinem (i přesto, že je
seronegativní, klinické příznaky jsou dostatečně
pádným důvodem k léčbě)
●
K: zřejmě jen paměťové protilátky, nutná další
diferenciální diagnostika
●
L: skutečně jde o neuroboreliózu, léčba ceftriaxonem
●
M: pacient je v pořádku (kdysi možná prodělal
bezpříznakovou borreliózu, 10 % populace má
pozitivní IgG)
●
N: pozitivní IgM v ELISA nepotvrdil WB ani PCR,
zřejmě zkřížená reakce, nutno pátrat po jiných
neuroinfekcích
48/57
Úkol 09/4a+b+c:
Přímý průkaz syfilis
●
rabbit infectivity test (RIT), očkování do varlat
novozélandského bílého králíka (orchitida za 10 dní)
●
zástinová mikroskopie (pozorujeme světlo které se
ohnulo či odrazilo na preparátu)
●
přímá imunofluorescence
(detekce antigenů pomocí
značených protilátek)
49/57
Úkol 09/5+6:
Nepřímý průkaz syfilis
●
úkolu 09/5: screening pacientů vybereme ty, které
je třeba konfirmovat
●
úkolu 09/6: potvrzení dg., konečný závěr
●
vyšetřované osoby:
●
A = těhotná žena (běžný screening, není
zvýšené riziko syfilis)
●
B = pacient s dva dny trvající lézí, která
vypadá jako ulcus durum
●
C = pacient se suspektní lues latens
●
D = dárce krve (pouhý screening)
●
E = dítě s pravděpodobnou vrozenou syfilis
50/57
Úkol 09/5: RRR a TPHA
●
RRR: pozitivní je důlek se zákalem
●
TPHA
51/57
pozitivní kontrola
negativní kontrola
pacienti 1, 2 a 3
technické důlky negativní kontrola
každého pacienta
vlastní reakce
Úkol 09/5: RRR a TPHA
●
screeningové reakce se dělají při každém
testování na syfilis (vč. těhotných)
●
screeningové reakce se zpravidla provádějí jen
kvalitativně či semikvantitativně
●
indikace ke konfirmaci:
– jakýkoli pozitivní či alespoň hraniční výsledek
reakce RRR a/nebo TPHA
– přítomnost suspektních lézí na těle, nebo
anamnéza rizikového sexuálního styku (zde i
v případě negativity obou reakcí)
52/57
Úkol 09/5: RRR a TPHA (výsledky)
RRR TPHA závěr
A (těhotná) + - konfirmace
B (léze) - - konfirmace
C (susp. lues) - +++ konfirmace
D (dárce krve) - - bez konfirmace
E (dítě, vroz. lues) + +++ konfirmace
53/57
Úkol 09/6: Konfirmace syfilis
●
výsledky reakce FTA-ABS:
54/57
konfirmace se
neprovádí
CBA D E
●
hodnocení reakce ELISA:
– cut off hodnota: (C1 + D1)/2
– IgM: hodnoty vyšší než 0,494 jsou pozitivní
– IgG: hodnoty vyšší než 0,366 jsou pozitivní
●
hodnocení Western blottu: za pozitivní v IgG i v IgM
považujte všechny pásky, na kterých umístění a
uspořádání proužků zhruba odpovídá pozitivní kontrole
Úkol 09/5+6:
Nepřímý průkaz syfilis (výsledky)
FTA ELISA WB závěr
ABS IgM IgG IgM IgG
A (těhotná) - - - - nejde
o lues (falešně
poz., možná po očkování)
B (léze) - - - - PCR
nutné, u čerstvé
infekce možná
seronegativita
C (susp. lues) + - + - + lues latens
D (dárce) dárce je v pořádku
E (dítě, vroz.
lues)
+ + + + +
kongenitální syfilis,
vyšetřit krev matky
55/57
Úkol 09/7: Přímý průkaz
Leptospira spp.
56/57
Po tomto cvičení byste měli umět:
●
vysvětlit co je to acidorezistence a jak se projevuje
●
popsat zástupce acidorezistentních bakterií a spirochet,
vč. diagnostických postupů, které vedou k úspěšné
identifikaci
●
zhodnotit význam přímých a nepřímých metod v
diagnostice acidorezistentních bakterií a spirochet, vč.
vhodnosti jejich použití pro konkrétní případy
57/57