P09
Přehled virologické
diagnostiky
Bi7170c (podzim 2017)
Osnova
●
klasifikace a struktura virů
●
replikace virů; adenoviry, picornaviry, respirační
viry; mykoplasmata
●
virus klíšťové encefalitidy
●
viry spalniček, zarděnek, příušnic
●
viry hepatitid
●
HIV virus
●
herpesviry
●
izolace a kultivace virů, cytopatický efekt
2/125
Viry
●
elementární biosystém, který vykazuje některé
vlastnosti živých systémů (přítomnost genomu,
schopnost adaptace)
●
nejsou schopny zabezpečit své energetické nároky
bez živé buňky a mimo ni nejsou funkčně aktivní
●
intracelulární parazité, postrádají proteosyntetický
aparát
●
2 fáze:
– neživé agregáty makromolekul mimo hostitelskou
buňku (metabolicky inertní)
– uvnitř buňky replikace a exprese genomu
(metabolicky aktivní)
3/125
Viry (2)
●
společné znaky s živými organizmy:
– schopnost rozmnožování (de novo)
– přítomnost genomu
– variabilita (proměnlivost, mutace)
– adaptace (změna spektra hostitelů)
– vývoj (evoluce)
●
odlišné znaky od živých organizmů:
– charakter genetického materiálu (RNA genomy)
– specifický druh parazitizmu (na genetické úrovni)
– nepřítomnost proteosyntetického aparátu
=> nebuněčná forma života 4/125
Viry
●
původ není jasný, zdá se, že nemají společného předka
●
rozdělení:
– DNA viry, RNA viry
– jednovláknové (ss = single stranded),
dvouvláknové (ds = double stranded)
●
+ssRNA – slouží jako mRNA
●
-ssRNA – RNA komplementární k mRNA, před
translací musí být nejdříve přepsána do +ssRNA
– přítomnost reverzní transkriptázy
– obal (obalené, neobalené)
5/125
Baltimorova klasifikace virů
6/125
Struktura virů
●
virion = diskrétní virová částice
– intaktní virová částice = komplex virové NK a proteinů
(popř. i obalu) schopný infikovat buňku
●
kapsid(a) = plášť viru tvořený bílkovinami (chrání a
stabilizují NK); určuje symetrii/tvar
●
kapsomera = morfologická jednotka sdružující
strukturální podjednotky a tvořící kapsidu
●
nukleokapsid(a) = strukturní útvar tvořený virovou NK
a bílkovinným obalem
– přítomná u většiny virů (bez ohledu na obal)
●
proteinové podjednotky se k sobě spojují autoagregací
(energeticky výhodný proces; bez dodání energie)
7/125
Struktura virů (2)
●
vnější obal (envelope) = lipidová dvojvrstva s
transmembránovými glykoproteiny
– glykoproteiny tvoří výběžky (peplomery, spikes) na
povrchu viru
– pro přichycení viru k hostitelské buňce
– tvořena komponenty z hostitelské buňky
(původně část cytoplazmatické nebo jaderné
membrány, endoplazmatického retikula nebo
Golgiho aparátu)
– obalené viry méně mechanicky odolné (citlivější
k vyschnutí, teplu nebo detergentům)
– výhodou je adaptabilita obalu únik před→
imunitním systémem hostitele 8/125
Symetrie kapsid
9/125
●
ikosahedrální (kubická) = dvacetistěn se třemi osami
symetrie (2-, 3-, 5-četnou)
Symetrie kapsid (2)
●
helikální (šroubovicová) = jednotlivé polypeptidy
(protomery) se řadí za sebou a jako šroubovice sledují
vlákno genomu
10/125
Symetrie kapsid (3)
●
komplexní = uspořádání kapsomer neumožňuje
jednoznačné zařazení do předchozích skupin
11/125
Symetrie kapsid (4)
●
symetrie nukleokapsidů pod vnějším obalem
12/125
Adenoviry
●
neobalené dsDNA viry, ikosahedrální symetrie, středně
velké (90 nm)
●
původně izolované z adenoidní vegetace (nosní mandle)
●
přes 50 serotypů patogenních pro člověka
– respirační onemocnění (rýmy, tonsilitidy,
faryngitidy; ojediněle až fatální pneumonie – Ad 14)
– konjunktivitidy (faryngokonjunktivální horečka –
Ad 3, 4, 7; keratokonjunktivitidy – Ad 8, 19)
– gastroenteritidy (Ad 40, 41)
– akutní hemoragická cystitida (nefritida) (Ad 11, 21)
●
pouze symptomatická léčba
13/125
Adenoviry (2)
14/125
Adenoviry (3)
●
přichycení viru
glykoproteiny
●
endocytóza
●
rozrušení endosomu
lytickými enzymy
po snížení pH
●
uvolnění virionu
do cytoplasmy
●
transport k jádru
(mikrotubuly)
15/125
Adenoviry (4)
●
přenos NK do jádra
16/125
Adenoviry (5)
●
DNA v jádře:
– exprese časných genů (regulační proteiny):
●
exprese proteinů nutných k replikaci DNA
●
aktivace dalších virových genů
●
zamezit IS zničit virus/napadenou buňku
(blokování apoptózy, interferonu a exprese a
transportu MHC I)
– replikace DNA (DNA viry často využívají DNA
polymerázu hostitele, ale adenoviry mají vlastní)
– exprese pozdních genů (strukturní proteiny)
●
sestavení nových virionů, maturace
●
opuštění buňky (lyze buňky) 17/125
Adenoviry (6)
18/125
Čeleď Picornaviridae
●
neobalené +ssRNA viry, malé (30 nm),
ikosahedrální, odolné
●
rod Enterovirus (poliovirus, rhinoviry, coxsackie viry,
echoviry)
●
rod Hepatovirus (virus hepatitidy A)
●
replikace: adsorpce endocytóza translace do→ →
polyproteinu replikace ve viral factories sestavení→ →
prokapsidu maturace (neznámá proteáza) lyze→ →
buňky
●
viral factories (intracelulární kompartmenty různého
původu; zvyšují efektivitu virové replikace a sestavení
virionů; ochrana před obranými mechanismy hostitele)
19/125
Čeleď Picornaviridae (2)
20/125
Viral factories
21/125
Viry chřipky
●
obalené -ssRNA viry, 80 – 120 nm, kulaté, oválné,
někdy i protáhlé, segmentovaný genom (8 segmentů)
●
replikace v jádře (u RNA virů výjimka)
●
hemaglutininy
– membránové proteiny, hlavní povrchový antigen H
– přichycení k povrchu buňky – receptor kys. sialová
– fúze virového obalu a endosomu)
●
neuraminidáza (N) – štěpení kys. sialové
– umožní pronikání viru přes hlen na sliznicích
– uvolnění virionů z buňky a zabránění jejich agregaci
22/125
Viry chřipky (2)
●
https://www.youtube.com/watch?v=YSgkoldBNkI
23/125
Viry chřipky (3)
24/125
Chřipka
●
příznaky: horečka (zimnice a třesavka), silné bolesti
hlavy, artralgie, myalgie, nevolnost až zvracení,
suchý dráždivý kašel
●
nebezpečná u lidí se sníženou imunitou,
těhotných a starších osob
●
některé subtypy vyvolávají u mladých lidí s dobrou
imunitou tzv. cytokinové bouře (neadekvátní
reakce IS) – pandemie španělské chřipky (H1N1,
1918), prasečí (mexické) chřipky (H1N1, 2009)
●
virus chřipky A (nejčastější a nejzávažnější)
●
virus chřipky B (sezónní, možné i střevní příznaky)
●
virus chřipky C (mírný průběh, hlavně děti)
25/125
Chřipka (2)
●
léčba:
– symptomatická (analgetika, antipyretika,
antitusika, expektorancia, nazální dekongescencia)
– specifická terapie – antivirotika
●
antivirotika:
– amantadin, rimantadin (inhibitory M2-proteinu)
– modernější zanamivir (Relenza; inhal.) a
oseltamivir (Tamiflu) (inhibitory neuraminidázy)
●
prevence:
– vakcína 2 subtypů chřipky A a jednoho chřipky B
– v ČR nejvhodnější dobou pro očkování období od
října do prosince 26/125
Chřipka (3)
●
evoluční vývoj:
– antigenní drift:
●
malé změny hemaglutininu a neuraminidázy
způsobené náhodnými mutacemi
●
infekce (epidemie) přichází v době, kdy je virus
dostatečně odlišný a IS ho nerozezná od
předchozí prodělané infekce
– antigenní shift:
●
reasortace segmentů genomu mezi různými
kmeny viru (nejčastěji ptačí, prasečí a lidské
kmeny)
●
rychlé získání odlišných antigenů, vyvolává
pandemie 27/125
Chřipka (4)
●
pandemie:
– jen chřipka A (u ostatních je prakticky nemožné,
aby nastal antigenní shift)
– H1N1, španělšká chřipka (1918), prasečí
(mexická) chřipka (2009)
– H2N2, asijská chřipka (1957)
– H3N2, hongkongská chřipka (1968)
– H5N1, ptačí chřipka (2003, nejvíce od 2005)
●
samotné subtypy H a N neříkají nic o nakažlivosti a
virulenci, záleží na konkrétní struktuře viru
●
viry nebezpečné až po vhodné rekombinaci
různých částí různých virů 28/125
Viry parachřipky
●
obalené -ssRNA viry, větší (150 nm), 4 typy
●
příbuzné virům příušnic a spalniček
●
postihuje zejména malé děti
●
horečnaté infekce HCD (kašel, často katar), může
přejít i na DCD vč. zánětu plic
●
diagnostika: KFR, HIT, ELISA (časté zkřížené
reakce)
29/125
RS virus
●
respirační syncyciální virus (rod Pneumovirus)
●
obalené -ssRNA viry
●
příbuzné virům parachřipek
●
postihuje zejména kojence a malé děti
●
jedna z nejčastějších příčin hospitalizace dětí
●
bronchitidy, bronchiolitidy, zánět plic
●
diagnostika: ELISA, buněčné kultury
●
při replikaci viru vznikají mnohojaderná syncytia
●
metapneumovirus (napadá starší děti; mírnější
příznaky onemocnění)
30/125
Mykoplasmata
●
bakterie, nejmenší a nejjednodušší prokaryota, která
nepotřebují cizí buňku
●
nemají buněčnou stěnu ( nepůsobí→ β-laktamová
ATB), mají trojvrstevnou plazmatickou membránu (tvar
pleomorfní)
●
rody Mycoplasma
a Ureaplasma
31/125
Mycoplasma pneumoniae
●
původcem tzv. atypických pneumonií
●
často jen jako rýma nebo bez příznaků
●
mohou nastat i mimoplicní komplikace (srdeční,
nervové a jiné)
●
ATB při těžších formách infekce
●
citlivé na tetracykliny, makrolidy (u dětí),
●
ATB bakterii neusmrcují, pouze zastavují její množení
(působení na proteosyntézu)
●
diagnostika: KFR, ELISA (v rámci serologie
respiračních virů)
32/125
Další mykoplasmata
●
Mycoplasma hominis
– běžně nacházený patogen převážně v urogenitálním
systému u žen a sexuálně aktivních mužů
– záněty pochvy, močové trubice, apod., které mohou
vyústit v hluboký pánevní zánět
●
Mycoplasma genitalium
– negonokoková uretritida (muži), cervicitida (ženy),
hluboký pánevní zánět
●
Ureaplasma urealyticum
– záněty pochvy, močové trubice
33/125
Virus klíšťové encefalitidy
●
obalený +ssRNA virus, 50 nm, čeleď Flaviviridae
●
klíšťová encefalitida:
– nejdříve mírné „chřipkovité“ příznaky
– encefalitida, meningitida, meningoencefalitida
– letalita 1 – 5 %
– arbovirus (arthropod-borne virus) – viry
přenášené členovci
– zdrojem lesní savci (hlodavci)
– diagnostika: KFR, HIT, ELISA, PCR, izolace na
sajících myšatech
34/125
Virus klíšťové encefalitidy (2)
35/125
Virus klíšťové encefalitidy (3)
●
symptomy a diagnostika
36/125
Čeleď: Togaviridae
●
obalené +ssRNA viry, ikosahedrální symetrie,
65-70 nm
●
rod Rubivirus – virus rubeoly (zarděnky)
●
rod Alphavirus – arboviry (arthropode born)
– viry koňské encefalitidy (EEE, WEE, VEE)
– viry horeček Chikungunya a O'nyong nyong
37/125
Virus rubeoly (zarděnky)
●
lat. rubeo = zardívám se, angl. rubella
●
čistě lidský virus
●
benigní dětské onemocnění
●
přenos vzduchem, inkubace 16–18 dní, začíná se
vylučovat nosohltanem už před výsevem vyrážky
●
nebezpečné u těhotných (první trimestr vrozené→
vady – malformace srdce, sluchu či jiných orgánů
●
diagnostika: klinické příznaky, ELISA, přímý průkaz
množením na tkáňových kulturách bez CPE (pomnožení
viru prokazováno interferencí, tj. přidáme virus, který by
normálně dělal CPE, např. echovirus 11)
●
léčba: symptomaticky 38/125
Virus rubeoly
●
obalený, +ssRNA, 65-70 nm
39/125
Zarděnky – příznaky
●
makulopapulózní vyrážka, začíná na obličeji, šíří se na
celé tělo
40/125
Čeleď: Paramyxoviridae
●
obalené -ssRNA viry, sférické, 150 nm
●
podčeleď Paramyxovirinae
– Respirovirus – virus parachřipky 1 a 3
– Morbillivirus – virus spalniček
– Rubulavirus – virus příušnic, parachřipky 2, 4a, 4b
●
podčeleď Pneumovirinae
– Pneumovirus – lidský RS virus
– Metapneumovirus – lidský metapneumovirus
41/125
Čeleď: Paramyxoviridae
●
obalené -ssRNA viry, sférické, 150 nm
42/125
Virus spalniček (Morbillivirus)
●
angl. measles nebo rubeolla
●
neexistují bezpříznakové infekce:
– po 10–11 dnech horečka, rýma, kašel, záněty
spojivek charakteristická→ vyrážka, začínající na
tvářích a za ušima (po 3–4 dnech vybledá)
– v ústech tzv. Koplikovy skvrny (šedé makuly)
●
možné komplikace postihující dýchací a nervovou
soustavu
●
vzácně reaktivace v dospělosti: subakutní sklerózující
panencefalitida (SSPE)
●
diagnostika: serologie (ELISA, KFR, HIT)
●
léčba: symptomaticky 43/125
Spalničky – příznaky
●
vyrážka
●
Koplikovy skvrny
(dole)
44/125
Virus příušnic
●
angl. mumps
●
vstup přes respirační trakt (kapénkově) → inkubační
doba 2-3 týdny, generalizovaná infekce
●
otok slinných žláz, možné postižení CNS, slinivky břišní
a varlat (nebezpečné u mužů v pubertě vzácně vede→
ke sterilitě)
●
diagnostika: serologie (HIT, KFR, ELISA), izolace
●
léčba: symptomaticky
45/125
Příušnice – příznaky
46/125
MMR vakcína
●
očkování proti spalničkám, příušnicím a zarděnkám
●
živé oslabené viry
●
indikováno dětem starším 15 měsíců, osobám vnímavým
na alespoň jednu z nákaz, při riziku komplikací
v těhotenství
●
postexpoziční profylaxe po kontaktu se spalničkami
47/125
Viry hepatitid
●
pět hlavních typů virových hepatitid VHA až VHE
●
každý patří do jiné skupiny, většina jsou RNA viry,
kromě VHB je DNA virus s RT
●
VHA a VHE – přenášejí se fekálně-orální cestou
(ruce), nepřecházejí do chronicity
●
VHB, VHC a VHD – přenos krví, popř. sexuálně (u
VHC spíše nevýznamné), mohou přecházet do
chronicity, prekanceróza
●
existují i další viry hepatitid
●
pacient má horečky, trávicí potíže, může být přítomno
zežloutnutí skléry či kůže, změna barvy moče a stolice
atd.
48/125
Virus Zařazení Přenos
HAV Picornaviridae
+ssRNA
fekálně-orální
HBV Hepadnaviridae
dsDNA (RT)
sexuální, krví
HCV Flaviviridae
+ssRNA
krví
HDV Deltavirus (Delta
agens – viroid)
-ssRNA
sexuální, krví
HEV Hepeviridae
+ssRNA
fekálně-orální
Viry hepatitid – přehled
49/125
Hepatitis A virus
●
neobalený, +ssRNA, 30 nm
50/125
Hepatitis B virus
●
obalený, částečně dsDNA (RT), 42 nm
51/125
Hepatitis B virus (2)
●
neinfekční částice produkované v nadbytku
52/125
Hepatitis B virus (3)
●
neinfekční částice produkované v nadbytku
53/125
Hepatitis C virus
●
obalený, +ssRNA, 50 nm
54/125
Hepatitis D virus
●
obalený, -ssRNA
22 nm
●
satelitní virus
(vyžaduje koinfekci
s HBV)
55/125
Hepatitis E virus
●
neobalený, +ssRNA, 32-34 nm
56/125
Hepatitidy
●
infekční záněty jater, lidově žloutenky
●
hepatitida jako přenosné virové onemocnění
●
hepatitida jako příznak, který je přítomen nejen při
virové hepatitidě, ale i např. při obstrukci žlučových cest
kameny
●
nevirové hepatitidy:
– metabolická (Wilsonova choroba – abnormální
střádáním mědi v játrech způsobuje poškození→
jaterních buněk, poruchy funkce CNS a hemolytickou
anémii; porfyrie = hromadění prekursorů hemu v
játrech)
– toxická (alkohol, léky)
57/125
Hepatitida příznaky
●
typická ikterická forma (u všech hepatitid je však
častější forma anikterická)
58/125
Prevence hepatitid
●
očkování proti hepatitidě A je dostupné a
doporučené např. i při cestách do jižní Evropy či severní
Afriky
●
očkování proti hepatitidě B nyní součástí normálního
očkovacího kalendáře (hexavakcína)
●
možné současné očkování proti hepatitidě A i B
●
očkování proti hepatitidě C není (několik genotypů,
velké množství subtypů, snadno mutuje)
●
očkování proti hepatitidě D = proti HBV
●
experimentální vakcíny proti HEV (různé fáze klinických
studií, uvedení na trh zřejmě nebude v dohledné době)
59/125
Diagnostika hepatitid A, C, D, E
●
HAV: stanovujeme metodou ELISA anti-HAV IgM s
IgG, nebo IgM a celkové protilátky
●
HCV: stanovujeme IgM a IgG protilátky metodou
ELISA, dále se používá PCR
●
HDV: prokazuje se delta antigen (HDAg), protilátky
(anti-HD) či virová RNA pomocí PCR
●
HEV: průkaz IgM a IgG protilátek metodou ELISA, ve
výzkumu i PCR
60/125
Zvláštnosti diagnostiky HBV
●
nuleokapsida – dvě dřeňové bílkoviny, které mají
povahu antigenů (HBcAg a HBeAg)
●
obal – antigen HBsAg
●
HBsAg je nadprodukován (v krvi kolují i prázdné obaly)
●
do prázdného HBsAg může proniknout delta agens
– původce hepatitidy D
●
delta agens podstatně zhoršuje prognózu virové
hepatitidy
61/125
Hepatitis B virus (2)
●
neinfekční částice produkované v nadbytku
62/125
Diagnostika HBV
●
HBV má tři pro diagnostiku významné antigeny, jen dva
z nich však nalézáme v séru: HBsAg a HBeAg
●
HBsAg se tvoří v nadbytku, takže je ho vždy v séru
hodně, proto se hodí pro screening
●
protilátky naopak můžeme stanovovat proti všem třem
z nich: anti-HBs, anti-HBe i anti-HBc.
●
diagnostiku případně doplní PCR, průkaz jaterních
enzymů aj.
●
z kombinace vyšetření plyne interpretace
63/125
Screening a léčba hepatitid
●
screening hepatitidy B běžný (před operacemi, v
těhotenství apod.)
●
léčba akutních hepatitid je symptomatická a
podpůrná
●
základem terapie klidový dietní režim, použití
hepatoprotektiv
●
VHC –časná léčba interferonem může zabránit
přechodu do chronicity
●
antivirotika: lamivudin (HBV)
64/125
Virus HIV
●
retrovirus (reverzní transkriptáza)
●
HIV 1 – ve střední Africe a v ostatních kontinentech,
kam se rozšířil
●
HIV 2 – pouze v západní Africe, rozvoj onemocnění je
pomalejší než u infekce HIV 1
●
přenos se krví, pohlavní cestou, z matky na dítě
(transplacentárně i mateřským mlékem)
65/125
Průběh infekce virem HIV
●
primoinfekce virem HIV (težký pokles CD4+
lymfocytů, přechodná virémie, příznaky podobné jako
tonsilofaryngitida, infekční mononukleóze či chřipce)
●
bezpříznakové stádium (18 měsíců až 15 let,
perzistující generalizovaná lymfadenopatie)
●
časné symptomatické stádium (celkové příznaky –
horečka nad 38,5° C, noční pocení, únava, úbytek na
váze; časté malé oportunní infekce
●
pozdní symptomatické stádium, AIDS (konečné
stadium HIV infekce, velké oportunní infekce, nádory,
encefalopatie)
66/125
Virion HIV
●
obalený, dvě kopie +ssRNA, 80-100 nm
67/125
Diagnostika HIV
●
protilátky proti obalovým glykoproteinům pomocí
ELISA testů (gp41, gp120)
●
výsledek vyjde jako pozitivní, pošle se vzorek séra do
referenční laboratoře, která výsledek ověří
(konfirmuje) další reakcí ELISA a Western blottem
●
do výsledků konfirmace je výsledek hodnocen jako
„reaktivní“, nikoli jako „pozitivní“
●
přímý průkaz lze provádět pomocí PCR
●
izolace viru je dnes již možná, ale velmi náročná a
běžně se neprovádí
68/125
Herpetické viry
●
obalené, dsDNA, ikosahedrální symetrie, poměrně
velké (HSV-1 150-200 nm)
●
typické dlouhodobé přetrvávání v organismu (fáze
latence) v nervových a lymfatických tkáních
●
reaktivace při stresové situaci popř. oslabení
imunitního systému
69/125
Herpetické viry (2)
●
obalený, lineární dsDNA, 150-200 nm
70/125
Zkratka,
podčeleď
Celé jméno Choroba
HSV-1 + 2
(alfa)
Herpes simplex virus herpes simplex
(prostý opar)
VZV
(alfa)
Varicella zoster virus plané neštovice,
pásový opar
EBV
(gamma)
Virus Epstein-Barrové infekční
mononukleóza
CMV
(beta)
Cytomegalovirus cytomegaloviróza
HHV-6 + 7
(beta)
Lidský herpesvirus
6 + 7
exanthema
subitum
HHV-8
(gamma)
Lidský herpesvirus 8 Kaposiho sarkom
Herpetické viry (2)
71/125
Herpes simplex virus
●
po infekci viry přežívají v nervových gangliích
●
HSV-1: herpes labialis (bolestivé puchýřky v oblasti
úst, může se ale objevit i jinde)
– závažné komplikace (encefalitida, infekce oka)
●
HSV-2: herpes genitalis (bolestivé puchýřky v oblasti
genitálu a anu
●
diagnostika: klinické příznaky, PCR, popř. izolace viru
●
léčba: aciklovir, valaciklovir a famciklovir (nepůsobí na
latentní infekci, infekce nejsou vyléčitelné latence)→
72/125
Herpes labialis, herpes genitalis
●
HSV-1
●
HSV-2
73/125
Varicella zoster virus (VZV)
●
bránou vstupu respirační trakt pomnožení→
v lymfatických uzlinách hematogenní rozsev do kůže→
a sliznic tvorba puchýřků (→ plané neštovice)
●
perzistuje ve spinálních gangliích interkostálních
nervů
●
při oslabení imunity nebo stresu se šíří anterográdně
do senzitivní oblasti příslušného nervu → pásový opar
●
diagnostika: PCR, ELISA, popř. kultivace
●
léčba: aciklovir, valaciklovir a famciklovir
74/125
Plané neštovice
75/125
Pásový opar
76/125
Cytomegalovirus (CMV)
●
název odvozen od zvětšených buněk napadených virem
(virus zabraní apoptóze zprostředkovanou mitochondriemi)
●
vstup respiračním nebo trávicím traktem pomnožení→
a hematogenní rozsev perzistence ve slinných žlázách,→
renálních tubulech, leukocytech
●
u většiny probíhá infekce bezpříznakově, méně často
syndrom infekční mononukleózy (teplota, lymfadenopatie)
●
infekce je závažná u těhotných (infekce plodu) a
imunokompromitovaných (transplantace, AIDS, apod.)
●
diagnostika: serologie, PCR, kultivace
●
léčba: ganciklovir, foskarnet
77/125
Lidský herpesvirus 6 + 7
●
HHV-6A, HHV-6B; HHV-7
●
infekce probíhá u dětí nejčastěji do 1. roku života,
přenos kontaktem zvýšená→ teplota, někdy
doprovázená exantémem (exanthema subitum
neboli roseola infantum)
●
reaktivace bezpříznakové, s výjimkou
imunokompronitovaných jedinců
●
diagnostika: klinické příznaky, serologie, izolace viru
●
léčba: symptomaticky, výjimečně ganciklovir apod.
78/125
Exanthema subitum neboli
roseola infantum
79/125
Virus Epsteinův – Barrové
●
brána vstupu respirační trakt pomnožení v→
B-lymfocytech → příznaky žádné, přes angínu s
lymfadenitidu (infekční mononukleóza), až po
postižení jater
●
souvislost s určitými typy tumorů
●
diagnostika: Paul-Bunnellova reakce – důkaz tzv.
heterofilní protilátek shlukujících beraní krvinky, nebo
průkaz specifických protilátek proti různým virovým
antigenům (hlavně EBNA a VCA)
●
léčba: obvykle symptomatická
80/125
Protilátky anti-VCA a anti-EBNA
●
virový kapsidový antigen (VCA)
– anti-VCA IgM se objevují časně při EBV infekci a
zpravidla mizí během 4 až 6 týdnů
– anti-VCA IgG se objevují v časné fázi EBV infekce,
vrcholí během 2 až 4 týdnů po začátku nemoci,
pomalu klesají, a pak přetrvávají během zbytku
pacientova života
●
EBV nukleární antigen (EBNA)
– protilátky proti EBNA se pomalu objevují 2 až
4 měsíce po začátku příznaků a perzistují po zbytek
pacientova života
81/125
Infekční mononukleóza
82/125
Lidský herpesvirus 8 (HHV 8)
●
obsahuje neobvykle velké množství genů, pocházejících
z hostitelské buňky
●
souvisí s onkogenitou
●
primární infekce může připomínat infekční
mononukleózu, ale bez heterofilních protilátek
●
souvisí s Kaposiho sarkomem (tvorba lézí na těle),
zvláštním typem nádoru u pacientů s AIDS
●
diagnostika je zatím spíše experimentální
83/125
Přímé vs. nepřímé metody
přímé
●
hledáme mikroba, jeho
část či jeho produkt
(produktem může být
například nějaký bakteriální
antigen či jed – toxin)
●
agens je přítomno nyní
nepřímé
●
hledáme protilátky
●
protilátka není součástí ani
produktem mikroba
(produkt makroorganismu,
odezvou na činnost mikroba)
●
agens bylo přítomno někdy
v minulosti
84/125
Přehled metod
●
přímé metody
– mikroskopie – elektronová (morfologie virionů),
optická (buněčné kultury, CPE, inkluze)
– kultivace, izolace – buněčné a tkáňové kultury
– biochemické metody – u virů se nepoužívají
– průkaz antigenu (pomocí protilátky)
– pokus na zvířeti (izolace, průkaz toxicity)
– průkaz nukleové kyseliny
●
nepřímé metody
– základ diagnostiky virů – KFR, HIT, VNT, ELISA
85/125
Mikroskopie
●
elektronová mikroskopie:
– pozorování většiny virů
– nákladná a není vždy dostupná nepoužívá se→
k rutinní diagnostice, ale k výzkumným účelům
●
optická mikroskopie:
– pozorování cytopatických efektů in vitro
– pozrování buněčných inkluzí in vivo (Negriho
tělíska u vztekliny) – spíše v rámci histologie
– možné pozorování velkých virů (> 0,2 μm, např.
poxviry) – výjimečně, pro praxi se nehodí
86/125
Izolace a kultivace virů
●
zvíře se používá dnes již méně často (sající myšata)
●
kuřecí zárodek (asi 10 dnů staré embryo):
– pod skořápkou papírová blanka (uzavírá
vzduchovou bublinu)
– na papírovou blanku nasedá
chorioalantoidní
membrána, která
ohraničuje allantoidní
dutinu
– v allantois se vznáší
amniová dutina
s vlastním embryem
– žloutkový vak 87/125
Izolace a kultivace virů (2)
●
směry očkování do jednotlivých struktur
88/125
Izolace a kultivace virů (3)
●
směry očkování do jednotlivých struktur
89/125
Izolace a kultivace virů (4)
●
amniová dutina – obklopující zárodek,používá se
často, např. u virů chřipky
●
allantois (odpadní váček) poskytuje větší objem
tekutiny, ale je méně výživný (hodí se pro viry, které
byly předtím pěstovány v amniu a adaptovaly se;
využívá se při výrobě chřipkové vakcíny)
●
žloutkový vak – kultivace chlamydií a rickettsií
(používají se sedmidenní embrya vak je větší)→
●
chorioalantoidní membrána – pěstování zejména
poxvirů a herpesvirů
90/125
Izolace a kultivace virů (5)
●
výsledek není na kuřecích zárodcích vidět
– výjimka chorioalantoidní membrána – poky
(bělavá ložiska)
– využíváme schopnosti většiny virů aglutinovat
erytrocyty Hirstův test→
●
buněčné kultury:
– „nesmrtelné“ zvířecí či lidské buňky – embryonální,
nádorové
– HeLa (nádor cervixu), Vero (opičí ledviny), HEL
(Human Embryonic Lung)
– některé viry způsobují cytopatický efekt (CPE)
91/125
Cytopatický efekt
●
morfologicky patrné důsledky infekce buňky
virem (ne všechny viry způsobí CPE!)
●
následek narušení metabolismu a s ním spojených
životních funkcí buněk
●
projevy:
– změny cytoskeletu:
●
zakulacení buněk
●
odlupování od podkladu
– v důsledku změny obsahu vody a přesunu iontů:
●
vakuolizace cytoplazmy
●
svraštění buněk
92/125
Cytopatický efekt (2)
●
total destruction:
– úplná destrukce buněk monolayeru, zhuštění
buněk (kondenzace chromatinu)
– enteroviry (poliovirus, rhinoviry, coxsackie viry,
echoviry)
●
subtotal destruction:
– částečná destrukce buněk monolayeru (nejsou
zasaženy všechny buňky)
– togaviry, pikornaviry, paramyxoviry
93/125
Cytopatický efekt (3)
94/125
Cytopatický efekt (4)
●
focal degeneration:
– místo generalizované infekce monolayeru virus→
produkuje lokalizovaná ohniska
– infekce probíhá šířením viru z buňky do buňky
(ne difúzí z média)
– buňky zvětšené, zakulacené, refraktilní
– herpesviry, poxviry
95/125
Cytopatický efekt (5)
96/125
Cytopatický efekt (6)
●
swelling and clumping:
– infikované buňky se zvětšují a postupně shlukují
do střapcovitých (hroznovitých) útvarů, nakonec se
odloučí od podkladu
– adenoviry
97/125
Cytopatický efekt (7)
●
foamy degeneration (vaculalization)
– produkce velkých a
početných vakuol
v cytoplazmě
infikovaných buněk
– těžko pozorovatelné
bez barvení
– retroviry, paramyxoviry,
flaviviry
98/125
Cytopatický efekt (8)
●
cell fusion (syncytium formation/polykaryon formation)
– fúze plazmatických membrán čtyř a více buněk
– produkce jedné velké buňky se čtyřmi a více jádry
(lépe pozorovatelné po obarvení)
– paramyxoviry, herpesviry
99/125
Cytopatický efekt (9)
●
inclusion bodies:
– obvykle místa syntézy virových proteinů nebo
replikace virového genomu nebo místa vzniklá po
působení viru
– liší se dle infikujícího viru (různý počet, velikost a
tvar, v jádře/cytoplazmě, eosinofilní/bazofilní)
– pozorovatelné po obarvení (Giemsa: lze vidět fúzi
buněk, vakuolizaci cytoplazmy, inkluze)
100/125
Cytopatický efekt (10)
●
inclusion bodies
101/125
Průkaz viru
●
výsledek izolace viru většinou není vidět (výjimky
CPE, poky)
●
Hirstův test (test hemaglutinace)
– využíváme schopnosti viru shlukovat erytrocyty
– amniová tekutina s pomnoženým virem
aglutinuje krvinky → průkaz přítomnosti viru
– přítomnost specifického viru provedeme přidáním
protilátek proti hledanému viru → v pozitivním
případě inhibujeme aglutinaci = HIT
●
hemadsorpce na buněčných kulturách (chřipka)
– i zdánlivě nezměněné buňky, v nichž se pomnožil
virus, adsorbují na svůj povrch erytrocyty
102/125
Průkaz viru chřipky
●
diagnostika má epidemiologický význam (důkaz, že
epidemii působí opravdu chřipka)
●
přímý průkaz (výplach z nosohltanu nebo výtěr do
speciálního transportního média)
– průkazem virového antigenu
– izolace v amniové dutině (virus se pak prokazuje
Hirstovým testem)
– izolace na buňkách opičích ledvin
– průkaz virové RNA pomocí PCR
●
nepřímý průkaz:
– klasické serologické metody – párová séra, KFR, HIT
– ELISA – IgM, IgA 103/125
Úkol 1: Stanovení hemaglutinační
jednotky viru chřipky v amniové
tekutině (Hirstův test)
●
do 8 důlků v destičce napipetujte po 25 µl
fyziologického roztoku
●
1. důlek slouží jako kontrola erytrocytů
●
do 2. důlku přidejte 25 µl amniové tekutiny,
promíchejte a 25 µl přeneste do třetího důlku
●
pokračujte v geometrickém ředění do 1:128,
přebývajících 25 µl z posledního důlku odpipetujte do
dezinfekčního roztoku
●
do všech důlků přidejte 25 µl suspenze kuřecích
erytrocytů
●
reakci odečtěte po 90 minutách při lab. teplotě 104/125
Úkol 1: Vyhodnocení
●
vyhodnoťte virové shlukování erytrocytů
●
zakreslete výsledky a zapište jaké ředění odpovídá
jedné hemaglutinační jednotce (1 HU)
105/125
Úkol 2: Izolace virů na kuřecím
zárodku
●
ovoskop = prosvětlovač vajec
106/125
Úkol 2: Izolace virů na kuřecím
zárodku (2)
●
očkování do amnia
107/125
Úkol 2: Izolace virů na kuřecím
zárodku (3)
●
vejce položte naležato, prosviťte v ovoskopu a naznačte
tužkou okraj vzduchové bubliny (širší konec)
●
odřízněte skořápku nad vzduchovou bublinou
●
na papírovou blanku kápněte alkohol
●
vejce opět prosviťte v ovoskopu a vyznačte pozici
zárodku, resp. jeho oka
●
jehlou se snažte trefit do oka kuřecího zárodku –
buď přímo v ovoskopu, nebo případně mimo něj
●
aplikujte inkoust (atrament)
●
zvětšete si otvor ve vejci pomocí pinzety, poté vejce
vyklopte do Petriho misky a sledujte výsledek
108/125
Úkol 3: Hodnocení buněčných
kultur
●
buněčná kultura bez a s CPE
http://cmir.mgh.harvard.edu/cellbio/
cellculture.php?menuID_=122
www.herpesdiagnosis.com/diagnose.html
109/125
Úkol 4: Diagnostika parotitidy
reakcí ELISA
●
vyhodnoťte reakci ELISA ve třídách protilátek IgG a
IgM, interpretujte
110/125
Úkol 5: Stanovení KFR protilátek
proti nejčastějším původcům
respiračních nákaz
●
vyhodnoťte KFR
●
na destičce je vyšetřena dvojice sér jediného
pacienta s atypickou pneumonií
●
POZ = sedimentace erytrocytů
●
NEG = hemolýza
●
za signifikantní považujte čtyřnásobný vzestup
titru
111/125
Úkol 5: Stanovení KFR protilátek
proti nejčastějším původcům
respiračních nákaz (2)
●
Řádek 1 – Chřipka A I 1 : 4
●
Řádek 2 – Chřipka A II 1 : 4
●
Řádek 3 – Chřipka B I – žádný titr
●
Řádek 4 – Chřipka B II – žádný titr
●
Řádek 5 – Parachřipka I – žádný titr
●
Řádek 6 – Parachřipka II – žádný titr
●
Řádek 7 – RS virus I 1 : 4
●
Řádek 8 – RS virus II 1 : 8
●
Řádek 9 – Adenovirus I – žádný titr
●
Řádek 10 – Adenovirus II – žádný titr
●
Řádek 11 – Mycoplasma pneumoniae I 1 : 8
●
Řádek 12 – Mycoplasma pneumoniae II 1 : 128 112/125
Úkol 5: Stanovení KFR protilátek
proti nejčastějším původcům
respiračních nákaz (3)
●
závěry:
– Mycoplasma pneumoniae je pravděpodobným
původcem onemocnění
– doporučena ATB léčba (např. doxycyklinem)
– pacient se již za života setkal s chřipkou A a RS
virem (respirační synciciální virus, pneumovirus)
– pacient se nikdy nesetkal s ostatními testovanými
viry
113/125
Úkol 6: Zjištění titru protilátek
proti viru klíšťové encefalitidy
pomocí HIT
●
vyhodnoťte HIT
●
na destičce jsou vyšetřena párová séra čtyř pacientů
●
POZ = sedimentace erytrocytů
●
NEG = hemaglutinace
●
za signifikantní považujte čtyřnásobný vzestup titru
●
ředění v prvním sloupci je 1:5
●
zkontrolujte kontrolu antigenu a erytrocytů v dolních
rozích destičky
114/125
Úkol 6: Zjištění titru protilátek
proti viru klíšťové encefalitidy
pomocí HIT
●
závěry:
– jeden pacient se s klíšťovou encefalitidou vůbec
nesetkal
– dva ji prodělali (třeba i bez příznaků/možné
očkovaní
– jeden je pravděpodobně ve fázi akutního
onemocnění (16× vzestup titru)
115/125
Úkol 11: Diagnostika HAV
●
úkol 11a stanovujeme anti-HAV IgM
●
úkol 11b stanovujeme celkové protilátky anti-HAV
(IgM + IgG + ostatní)
●
výpočet cut off:
– průměr „c. o.“ důlků C1 a D1 = cut off
– hodnoty 110 % cut off a více = pozitivní
– hodnoty 90 % cut off a méně = negativní
– hodnoty 90–110 % cut off = hraniční
●
stanovení IgM + celkových protilátek je alternativou ke
stanovení IgM a IgG
116/125
Úkol 12: Diagnostika HBV
●
úkol 12a + b: stanovení HBsAg a HBeAg
●
úkol 12c + d: stanovení anti-HBs a anti-HBe
●
výpočet cut off: průměr C1 a D1
– hodnoty 110 % cut off a více = pozitivní
– hodnoty 90 % cut off a méně = negativní
– hodnoty 90–110 % cut off = hraniční
●
HBsAg (přítomnost viru v organismu v jakémkoli období
infekce
●
HBeAg (vylučována pouze během replikace viru)
●
anti-HBs (po prodělané infekci nebo očkovaní)
●
anti-HBe (po prodělané infekci) 117/125
Úkol 13: Diagnostika HCV
●
úkol 13a: PCR, elektroforéza
●
úkol 13b: průkaz anti-HCV metodou ELISA
●
výpočet cut off: průměr negativních kontrol (důlku B1,
C1 a D1) + 0,050
– hodnoty 110 % cut off a více = pozitivní
– hodnoty 90 % cut off a méně = negativní
– hodnoty 90–110 % cut off = hraniční)
118/125
Dodatečné indicie k úkolu č. 14
●
Pacient C – ikterický stav trvá několik týdnů, přetím
potíže neměl
●
Pacient D – ikterický stav již přetrvává několik let, ale
neřešil to
●
Pacient E – ultrazvuk ukazuje přítomnost útvarů
v oblasti žlučníku. Urobilinogen negativní, stolice
acholická
●
Pacient G – z anamnézy: před deseti dny byl v kontaktu
s kamarádem, u kterého se později potvrdila virová
hepatitida A
●
Pacient H – u pacienta snížená sérová hladina
ceruloplasminu a zvýšené vylučování mědi močí.
Přítomna též anémie a neurologické projevy 119/125
a-HAV
IgM
a-HAV
TOTAL
HBsAg HBeAg a-HBs a-HBe HCV
PCR
a-HCV
A + + – – – – – –
B – – – – – – + +
C – – + + – – – –
D – + + – – +/– – –
E – + – – – – – –
F – – – – + + – –
G – – – – – – – –
H – – – – – – – –
Úkol č. 14 – souhrn výsledků
120/125
Úkol č. 14 – závěr k pacientům
●
A: akutní hepatitida A
●
B: akutní hepatitida C
●
C: akutní hepatitida B
●
D: chronická (neaktivní) hepatitida B; v dětství prodělal
VHA (nebo je očkován)
●
E: současný ikterus zřejmě způsobily kameny; také on
kdysi asi prodělal VHA
●
F: původ současné žloutenky nejasný, nutno vyšetřovat
dále; prodělal VHB, vyléčen
●
G: příliš čerstvá hepatitida A, ještě nemá vytvořeny
protilátky
●
H: Wilsonova choroba (nejde o infekci) 121/125
Úkol 15: Vyšetření protilátek antiHIV
metodou ELISA
●
výpočet cut off:
– průměr „c. o.“ důlků C1 a D1 = cut off
– hodnoty 110 % cut off a více = pozitivní
– hodnoty 90 % cut off a méně = negativní
– hodnoty 90–110 % cut off = hraniční
●
pozitivní či hraniční séra je třeba konfirmovat (zaslat do
NRL v Praze k ověření)
●
v ČR registrujeme více než 2500 HIV pacientů
122/125
Úkol 16: Diagnostika virů čeledi
Herpesviridae
●
vyplněno za vás
●
tvorba tzv. poků – viditelných struktur na
chorioalantoidní membráně
123/125
Úkol 17: Praktická diagnostika
infekční mononukleózy
●
zhodnoťte výsledky daných pacientů proti EB-virovým
antigenům a vyplňte následující tabulky s výsledky
●
VCA – virový kapsidový antigen – u čerstvých infekcí
jsou typické protilátky IgM a nízkoavidní IgG
●
EBNA – Epstein-Barr (virový) nukleární antigen –
nejsou přítomny u čerstvých infekcí, většinou jsou
přítomny u latence a reaktivace
●
interpretujte podle tabulky v protokolu
124/125
Po tomto cvičení byste měli umět
●
klasifikovat viry na základě jejich NK a obalů, stručně
popsat replikaci virů
●
popsat agens způsobující atypické pneumonie, včetně
diagnostických možností
●
popsat viry spalniček, příušnic a zarděnek
●
popsat viry hepatitid, virus HIV a herpetické viry včetně
možných zdrojů nákazy
●
popsat metody očkování do jednotlivých částí kuřecího
zárodku
●
rozeznat buněčné kultury s přítomností CPE
●
správně posoudit výsledky různých laboratorních
vyšetření 125/125