NA STOPĚ PACHATELE Díl třetí: 1) Přímý průkaz II – identifikační metody 2) Další grampozitivní pachatelé (enterokoky, G+ tyčinky) Mikrobiologický ústav uvádí •L •Autor prezentace: Ondřej Zahradníček (kontakt: •zahradnicek@fnusa.cz). K praktickému cvičení pro Bi7170c • [USEMAP] Hlavní obsah •Identifikační metody •Enterokoky a G+ tyčinky •Enterokoky – bonus IDENTIFI-KAČNÍ METODY [USEMAP] Přehled podkapitol této části prezentace •Identifikační metody – obecné principy •Identifikační metody – problémy & řešení •Identifikační metody – praktické postupy (detaily uvnitř) •Identifikační metody – jiné než substrátové •Kontrolní otázky •Novinky v identifikačních metodách Identifikační metody – obecné principy Postavení v systému metod •Přímé metody (mikrob – část – produkt): –Mikroskopie – průkaz ve vzorku i identifikace –Kultivace – průkaz ve vzorku i identifikace –Biochemické a jiné identifikační metody – jen identifikace! –Průkaz antigenu – průkaz ve vzorku i id. –Průkaz nukleové kyseliny – zpravidla jen průkaz ve vzorku –Pokus na zvířeti – zpravidla průkaz ve vzorku •Nepřímé metody (protilátky) Mezi bakteriemi (i třeba kvasinkami) jsou rozdíly v metabolismu •Je velký rozdíl, jestli bakterie provádějí fermentaci nebo aerobní respiraci •Je rozdíl, jestli bakterie štěpí spíše bílkoviny a aminokyseliny (například rod Proteus) nebo spíše cukry (například rod Klebsiella) •Často je štěpení určitého substrátu znakem adaptace na určité prostředí (dobře adaptované enterobakterie štěpí laktózu, kterou nacházejí v našem střevě) Obecný princip biochemických testů •Bakterie mají svůj specifický metabolismus •Průmyslová mikrobiologie využívá bakteriálního metabolismu (zejména fermentativního katabolismu) k výrobě různých látek, včetně řady potravin •Klinická (i obecná) mikrobiologie využívá vzájemných rozdílů v metabolismu mezi bakteriemi k jejich vzájemnému rozlišování •Zajímají nás přitom mezidruhové rozdíly. Rozdíly mezi různými kmeny stejného druhu jsou spíše na obtíž Obecný princip II •Bakterii předložíme určitý substrát a zkoumáme, zda ho bakterie pomocí svého enzymu změní v produkt(y). Alespoň jeden produkt se musí lišit od substrátu skupenstvím či barvou. Neliší-li se, užijeme vhodný indikátor (buď je v reakci přítomen od počátku, nebo ho přidáme jako činidlo na závěr testu) •Existuje přitom velké množství způsobů technického provedení tohoto typu testů. •I mezi savci jsou rozdíly. Člověk neumí tvořit vitamin C, někteří savci ano Poznámka •Ne všechny biochemické vlastnosti bakterií studujeme speciálními testy. Některé zjistíme i při kultivaci na diagnostických nebo selektivně-diagnostických půdách. Například Endova půda v sobě vlastně zahrnuje biochemický test: rozlišuje bakterie na ty, které umějí štěpit laktózu, a ty, které to neumějí. • Kult9 [USEMAP] •Foto O. Z. • Identifikační metody – problémy a řešení Problémy •Rozdíly jsou i mezi kmeny stejného druhu, nejen mezi druhy •Málokdy pozorujeme, že 100 % či 0 % kmenů určitého druhu tvoří daný enzym •Častěji je to 90 %, 10 %, 70 %, 30 %… •Jak to třeba může vypadat v praxi: –Janičkella tvoří lenkulázu v 90 % případů –Evičkella tvoří lenkulázu v 10 % případů –Lenkuláza-pozitivní mikrob = ??? •typická Janičkella ??? •atypická Evičkella ??? Problémy – řešení •Sledujeme-li jen jeden znak, je velká pravděpodobnost, že narazíme na atypický kmen a identifikace bude chybná •Je však velmi malá pravděpodobnost, že by se kmen choval atypicky např. v deseti různých testech najednou •Proto čím víc testů, tím větší pravděpodobnost, že se nepleteme •Větší počet testů nám zároveň také umožní vzájemně rozlišit více druhů (rodů) Pravděpodobnost výsledku •Jak jsme si řekli, čím více testů použijeme, tím máme lepší šanci, že se nepleteme •Přesto tato šance nikdy není celých 100 % •Dá se vždy říci například, že náš hypotetický kmen je –na 99,3 % Janičkella elegans –na 0,5 % Evičkella pulcherima –na 0,2 % něco úplně jiného •Je pak na zvážení identifikujícího, zda mu taková míra pravděpodobnosti stačí, nebo provede další rozlišující testy Nejen procento pravděpodobnosti, ale i index typičnosti kmene •Ve skutečnosti je výsledek biochemické identifikace zpravidla charakterizován dvěma čísly, nikoli jen jedním: –% pravděpodobnosti: např. že je 90% pravděpodobnost, že kmen opravdu je Janičkella elegans a ne něco jiného –Index typičnosti: míra shody s „ideálním kmenem“ Janičkella elegans. Pokud je kmen ideální, je Tin = 1,00; pokud kmen např. netvoří lenkulázu, ačkoli 90 % janičkel ji tvoří, bude Tin nižší než 1,00 Příklady •Kmen má identifikaci 99 %, index typičnosti 0,95. Ideální stav, pravděpodobně „je to ono“. •Kmen má identifikaci 99 %, ale index typičnosti jen 0,63. Může jít o atypický kmen (je dobré zjistit, který test „mluví proti identifikaci“), ale také o chybu diagnostiky •Index typičnosti pro dva taxony vychází shodně 1,00, procento pravděpodobnosti má každý 49,5 % (jedno procento zbývá na „jiné“). To znamená, že je to prakticky určitě jeden z nich, ale bez rozlišujících testů nezjistíme, který to je. [USEMAP] • Identifikační metody – praktické provedení Možnosti praktického provedení •Rychlé testy (vteřiny až minuty) –Katalázový test –Testy s diagnostickými proužky (oxidáza) •Testy s inkubací (hodiny až dny) –Jednoduché zkumavkové testy –Složité zkumavkové testy –Sady jednoduchých zkumavkových testů –Testy v plastové destičce (miniaturizace) –Jiné testy (např. Švejcarova plotna) [USEMAP] •Katalázový test •Testy s diagnostickými proužky (oxidáza a jiné) •Jednoduché zkumavkové testy •Složité zkumavkové testy •Sady zkumavek •Testy v plastové destičce • Katalázový test •Katalázový test: velmi jednoduchý, do substrátu (roztok H2O2) rozmícháme bakterie. Bublinky = pozitivita. Princip: 2 H2O2 à 2 H2O + O2 •Konkrétní příklady použití tohoto testu 14 catalase [USEMAP] •medic.med.uth.tmc.edu/path/oxidase.htm • [USEMAP] Praktická poznámka •Doporučený postup, jak provádět katalázový test, je: na sklíčku vmíchejte trochu hmoty kmene do kapky roztoku peroxidu vodíku •Někteří mikrobiologové kapou peroxid přímo na kolonie. V případě krevního agaru je to riskantní – mikrobiolog musí být zkušený, aby odlišil opravdovou katalázovou reakci bakterií od slabé katalázové reakce červených krvinek •V praktiku to rozhodně nedělejte i z dalšího důvodu: peroxid bakterie usmrcuje, a na misce by nemuselo zbýt dost živých bakterií pro další studenty. • Testy s diagnostickými proužky •Testy s dg. proužky – Reakční ploškou se dotkneme kolonií. V případě pozitivity ploška změní barvu. Nejběžnější jsou tyto: –oxidáza – reakční ploška zmodrá (nebo alespoň ta místa, kde jsme se dotkli kolonií). Pro příklady využití tohoto testu klikněte na „i“. –INAC – reakční ploška po několika minutách zmodrozelená; proužek nutno před použitím navlhčit –PYR – reakční ploška po několika minutách, přikápnutí činidla a další minutě čekání zčervená –betalaktamázový proužek – týká se testování určitého faktoru rezistence na antibiotika (více v J06) [USEMAP] • Provedení testu v praxi Obrázek20 Foto: archiv MÚ 08 oxidase3 [USEMAP] Oxidázový test •medic.med.uth.tmc.edu/path/oxidase.htm • Jednoduché zkumavkové testy •Mohou probíhat v tekuté fázi, nebo v agaru. •V obou případech je ve zkumavce substrát, případně také indikátor. Příklady variant postupu jsou uvedeny na dalších obrazovkách Jednoduché zkumavkové testy – možnosti provedení •1) Substrát je rozpuštěn v tekutině, při testu do něj vmícháme kmen, po inkubaci sledujeme změnu zbarvení (v celém objemu, nebo jako prstenec u hladiny). Příklad: arabinózový test k rozlišení enterokoků (tekutina zůstane zelená = test negativní, Enterococcus faecalis; tekutina zežloutne = test pozitivní, Enterococcus faecium) Jednoduché zkumavkové testy – pokračování •2) Nejprve rozmícháme v tekutině (fyziologickém roztoku) kmen, pak přidáme proužek (podobný např. oxidázovému) napuštěný substrátem. Substrát se začne uvolňovat z reakční plošky Příklad: ONPG test (pozitivní = tekutina zežloutne, negativní = zůstane bezbarvá), VPT test (po přidání dvou různých činidel se v negativním případě nestane nic, v pozitivním se vytvoří červený prstenec u hladiny) • ONPG •ONPG: Příklad jednoduchého zkumavkového testu. Na proužku je přidán substrát. Zežloutnutí tekutiny znamená pozitivitu testu. ONPG •Příklad použití: rozlišení rodů Citrobacter (pozitivní) a Salmonella (negativní) Jednoduché zkumavkové testy – pokračování •3) Je připraven agar obsahující substrát. Barva buď zůstane původní, nebo se změní. Příklad: Citrát dle Simmonse. Pokud zůstane půda zelená, je test negativní, pokud zmodrá, je pozitivní 13 citrate [USEMAP] •medic.med.uth.tmc.edu • Složité zkumavkové testy •V jedné zkumavce probíhá více reakcí •Např. test MIU. –M = motility – pohyb (zákal se rozlézá polotekutým agarem, nezůstává jen v místě vpichu) –I = indol (pozitivita = červený prstenec) –U = urea (štěpení močoviny indikuje zrůžovění celé půdy) – – – – – •Nebo Hajnova půda MIU 16 motility MIU by samozřejmě šlo dělat i jako tři jednotlivé testy: pohyb… •www.arches.uga.edu 11 indole …indol a ureu 15 urease2 •medic.med.uth.tmc.edu Hajnova půda (Kligler Iron Agar – KIA v Hajnově modifikaci) •Červený vršek – laktóza negativní •Žlutý vršek – laktóza pozitivní •Červený spodek – glukóza negativní •Žlutý spodek – glukóza pozitivní •Černý spodek – bakterie tvoří sirovodík (zakrývá pozitivní glukózu!) •Potrhání půdy či odsunutí nahoru – bakterie tvoří plyny při fermentaci glukózy 06 velký Kligler_r%C3%A9sultats 07a image013 •www2.ac-lyon.fr/ [USEMAP] Příklad vyhodnocení Hajna + MIU Test Hajna MIU Reakce Glc Lac H2S Mot Ind Ure Pseudomonas aeruginosa - - - - - (+) Escherichia coli + + - + + - Proteus mirabilis + - + + - + Salmonella enterica + - + (+) - - Citrobacter freundi + (+) (+) + - - • Sady zkumavek •Složité zkumavkové testy mají své nevýhody. Často při pozitivitě jednoho testu není vidět, zda je pozitivní test jiný. Špatně se automatizují a vyžadují dobře zaškoleného pracovníka •Jednodušší, i když někdy dražší řešení, je sada několika jednoduchých zkumavkových testů •Lze ovšem i zkombinovat testy složité a jednoduché (např. Hajna + MIU + Simmons citrát + ornitin dekarboxyláza – v naší laboratoři) [USEMAP] • Miniaturizace: testy v plastových panelech •Miniaturizace sady jednoduchých zkumavkových testů à testy v důlcích plastových mikrotitračních destiček. Místo každé zkumavky je jeden důlek •Počet testů v sadách kolísá od sedmi (Neisseria Test) až po více než padesát •Liší se v technických detailech. Vždy je však substrát sušený, bakterie se nejprve rozmíchá ve FR nebo suspenzním médiu a pak se kape či lije do důlků Provedení testů od firmy Erba Lachema (u nás nejběžnější) •Výrobce dodává destičky se sušenými substráty, umístěnými na dně důlků v destičce •Pracovník připraví suspenzi bakterie ve FR nebo v suspenzním médiu •Do každého důlku se kápne kapka suspenze či dvě kapky •Zbytek suspenze se často ještě využije jako zkumavkový test s diagnostickým proužkem (ONPG, VPT) •Destička i zkumavka se inkubuje v termostatu NEFERMtest 24 Erba Lachema: do jednoho rámečku lze vložit čtyři trojřádky (čtyři testy, určení čtyř různých kmenů) P1010002upr • Foto: O. Z. • Zahraniční soupravy (princip stejný, drobné rozdíly v.konkrétním praktickém provedení) 03 api50 05 PR020505 04 api-strip Bioch2 http://www.oxoid.com/bluePress/uk/en/images/PR020505.jpg •www.ilexmedical.com/products_engl/api.htm. www.ilexmedical.com/products_engl/api.htm. Foto: O. Z. 02 API systémy •www.ucd.ie/kyr/Images/jpgs/Photo16.htm Vyhodnocení destičkových testů •Z takového testu dostaneme řadu výsledků – většinou ve tvaru „+“ (test pozitivní, substrát štěpen, došlo ke změně) nebo „-“ (test negativní, substrát nebyl štěpen, zbarvení zůstalo původní). •Příklad: + - + + + - - - - - - - - + + + + •Je několik způsobů, jak takovou řadu převést na „čitelný výsledek“ Možné způsoby hodnocení •Porovnání s tabulkou je možné jen u jednoduchých testů a jasných výsledků. •Přepočet na oktalové kódy plus vyhledání výsledku v seznamu kódů. Nejběžněji používáno •Výsledek se zadá do počítače, který „vyplivne“ vyhodnocení. Ne vždy praktické •Počítačové hodnocení se používá hlavně tehdy, pokud už „čtení“ výsledku probíhá automaticky, např. na spektrofotometru. Oktalové kódy – co to je a proč •Matematicky vzato je to vlastně převedení dvojkové soustavy (zápis + + – – + + – – –, respektive 110011000) do osmičkové soustavy (zápis 630) •Z praktických důvodů se zpravidla uvnitř trojice sčítá „opačně“ – normálně by při převodu z dvojkové do osmičkové či desítkové soustavy 1 1 0 měla být šestka a 0 1 1 trojka, v praxi to však z jistých důvodů počítáme většinou naopak Oktalové kódy – II •V praxi se tedy každé trojici výsledků přiřadí číslice od nuly po sedmičku – viz následující obrazovka •Samozřejmě, pokud má test např. 17 reakcí, je na konci místo trojice jen dvojice, v tom případě číslice na konci může být jen 0, 1, 2, 3. •Pokud by reakcí bylo 16 (19, 22…) bude na konci nula nebo jednička. Praktický příklad •Zaznamenají se pozitivní a negativní výsledky reakcí •Pod každou trojici se napíše 1 – 2 – 4 •Sečtou se pro každou trojici pouze číslice u „+“, nikoli u „ –“ (ty se přeškrtnou) Test JAN LEN MAG TOM PET KAR FRA HAN Výsl. + – + + + – – – 1 2 4 1 2 4 1 2 Kód 5 3 0 Přepočítávání trojic – – – 1 2 4 0 + – – 1 2 4 1 1 – + – 1 2 4 2 2 + + – 1 2 4 1 + 2 3 – – + 1 2 4 4 4 + – + 1 2 4 1 + 4 5 – + + 1 2 4 2 + 4 6 + + + 1 2 4 1 + 2 + 4 7 1 2 H 3G 4 F 5 E 6 D 7 C 8 B 9 A 10 H 11 G 12 F 13 E 14 D 15 C 16 B 17 A První řádek panelu Druhý řádek panelu + S l l l l l l l l l l l l l l l l – S l l l l l l l l l l l l l l l l ? S l l l l l l l l l l l l l l l l ? + – + + + – – – – – – – – + + + + 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 5 3 0 0 6 3 Konkrétně u ENTEROtestu16 (17 testů) [USEMAP] • • Identifikační metody – jiné než substrátové Jiné identifikační testy •Kromě testů založených přímo na štěpení substrátu, existují i jiné podobné testy, které zkoumají vybavení bakterií určitými enzymy či faktory virulence. Například: –Test schopnosti koagulovat králičí plasmu –Test schopnosti aglutinovat králičí plasmu –Test schopnosti „odpouzdřit“ opouzdřený kmen (hyaluronidázový test) –Testování pohyblivosti, to už jsme měli Plasmakoaguláza a hyaluronidáza (oba testy se užívají u stafylokoků) P1020006a P1020006ax 41 koaguláza •www.hardydiagnostics.com •Foto O. Z. •Foto O. Z. Diagnostické použití antibiotik •Jednou z možností je také testování in vitro citlivosti na určité antibiotikum v případě, že víme, že kmen X je vždy citlivý a kmen Y je vždy rezistentní. I zde ovšem nemusí jít o 100 %, ale např. 95 %. Používají se i taková antibiotika, která neslouží k léčbě, případně se používala dříve, ale v současnosti již se nepoužívají. •Příkladem je třeba optochinový test z minulého praktika •Praktické provedení je stejné jako u testů citlivosti na antibiotika, ale zpravidla se neměří zóna (pouze se konstatuje její existence) Optochinový test negativní a pozitivní 10 opto4a •http://www.mc.maricopa.edu [USEMAP] • Novinky v identifikačních metodách Nové identifikační metody •Jedním z trendů poslední doby je automatizace biochemické identifikace při zapojení expertního systému. V některých případech identifikace přímo navazuje na (automatickou) kultivaci kmene •Problémem při použití těchto metod je, že zpravidla není dostatečně zohledněn klinický původ kmene, a tím vhodná míra přesnosti identifikace, výběr pravděpodobného patogena × náhodně kontaminujícího kmene apod. •Jinou možností jsou nové metody na jiném principu, například hmotová spektrometrie typu MALDI-TOF, viz dále MALDI TOF •Princip: hmotová spektrometrie –již dávno využíváno v chemii, ale klasické způsoby umožňovaly analyzovat látky jen s nízkou molekulovou hmotností –založena na rozdělení nabitých částic podle jejich molekulových hmotností –nyní díky ionizaci laserovými paprsky lze detekovat i velké molekuly, charakteristické pro jednotlivé druhy bakterií či kvasinek –využívá ionizaci laserem za přítomnosti matrice (MALDI, matrix assisted laser desorption/ionization) v kombinaci s detektorem doby letu (TOF, time-of-flight) •Navzdory vysoké ekonomická náročnosti (řádově miliony Kč) jsou postupně jednotlivé laboratoře touto metodou vybavovány MALDI TOF – detaily •rychlost částice (nepřímo úměrnou její hmotnosti) lze vypočítat z doby průletu, změřené detektorem (TOF) •směs matrice (např. kyseliny 4-hydroxy-skořicové) a kmene na nerezové destičce je zasažena nanosekundovým pulsem laseru •matrice absorbuje energii pulsu a molekuly vzorku jsou ionizovány jejím rozkladem •metoda u kmene „nalezne“ specifické bílkoviny a porovná je s databází, dnes již poměrně širokou, ale stále rozšiřovanou P1010041 MALDI-TOF [USEMAP] •Přejít na webové •stránky výrobce P1010040 Práce s MALDI-TOF Příprava kmene pro MALDI-TOF P1010045 40 CatalaseResults1 •http://www.telmeds.org Konec této části [USEMAP] • [USEMAP] Příklady použití katalázového testu •Nejčastější je použití při diagnostice G+ koků. Z lékařsky významných rodů jsou stafylokoky kataláza +, zatímco stafylokoky a enterokoky kataláza – •Nicméně jsou i jiné příklady, například u G+ tyčinek: Listeria je kataláza +, Erysipelothrix (mikroskopicky podobná) kataláza – • [USEMAP] Příklady využití oxidázového testu •Oxidázu lze využít v různých situacích: •Potvrdit určení rodů Neisseria, Moraxella a Pseudomonas (oxidáza pozitivní) •Rozlišit mezi Vibrionaceae (oxidáza +) a Enterobacteriaceae (oxidáza – s výjimkou rodu Plesiomonas) • Kontrolní otázky k této části •Vyhledejte odpovědi a pak v ISu vyplňte •Odpovědník. Znění otázky v Odpovědníku nemusí být zcela identické jako zde. –1. Co znamená zkratka "MIU"? –2. Proč nám ani při rozlišení dvou druhů nemusí stačit jediný test? –3. Jak se používá oxidázový proužek? –4. Jaký je viditelný rozdíl mezi produkty a substrátem v katalázové reakci? –5. Vyjadřuje procento pravděpodobnosti identifikace totéž jako index typičnosti? –6. Když na určité půdě kultivujeme bakterie, získáme informaci, zda fermentují laktózu. Jak se tato půda jmenuje? –7. Kdy není při biochemické identifikační reakci potřeba indikátor –8. Znamená každé využití cukru jeho fermentativní rozštěpení? –9. Je možné, aby jeden druh organismu byl schopen štěpit určitý substrát, a jiný ne? –10. A ještě nějaká překvapení navíc J [USEMAP] • [USEMAP] •Zpět na hlavní obsah ENTEROKOKY A G+ TYČINKY Přehled G+ bakterií 15 Corynebacterium Příběh Tvar V policejní kartotéce vedeni jako P01 Lékařsky významné Koky Stafylokoky (S. aureus, koag. neg. st.) P02 Streptokoky (viridující, hemolytické) 1. Enterokoky (E. faecalis, E. faecium) 2. Lékařsky významné Tyčky Listerie (typicky L. monocytogenes) 3. Korynebakteria 4. Bacily •Listerie a korynebakteria nesporulují, bacily sporulují 25 BASU •http://vietsciences.free.fr •http://web.fccj.org [USEMAP] Obsah •Klinická charakteristika – enterokoky •Klinická charakteristika – G+ tyčinky •Léčba infekcí způsobených enterokoky a G+ tyčinkami •Diagnostika enterokoků a G+ tyčinek (+ obrázky) •Diferenciální diagnostika enterokoků a G+ tyčinek •Zpět na hlavní obsah Klinická charakteristika - enterokoky Příběh první •L. si stěžovala mamince na bolesti při močení a maminka si všimla, že chodí na záchod hodně často. Lékař na středisku jí předepsal Zinnat, ale potíže se nezlepšily. Při další návštěvě ji tedy nechal vymočit do „šampusky“ a moč poslal na mikrobiologii. Přišlo mu ale, že výsledek nelze hodnotit, neboť moč je kontaminovaná. Nakonec se přece jen podařilo moč odebrat asepticky a podle výsledku změnit terapii. Pátráme po pachateli •Vinen je Enterococcus faecalis •Jak napovídá rodové i druhové jméno, je to mikrob normálně se vyskytující ve střevě. Je ale také jedním z nejběžnějších původců močových infekcí •Viníkem je ovšem i lékař – předepsal antibiotika bez kultivace moče; bohužel, enterokoky jsou na všechna cefalosporinová antibiotika primárně rezistentní. Navíc podcenil aseptický odběr moče. •IMC (infekce močových cest) jsou převážně bakteriální. Navíc původci mívají řadu primárních i sekundárních rezistencí. Proto lze vřele doporučit mikrobiologické vyšetření moče, i když v praxi se často zapomene provést. Více o enterokocích •Dnes jich rozeznáváme desítky druhů •Všechny mohou být nalézány –ve stolici (jako normální mikroflóra) –v močovém měchýři (jako patogeny) –v pochvě (asymptomaticky nebo symptomaticky) –občas i jinde (rány, krevní řečiště) •Ze dvou nejběžnějších druhů E. faecalis bývá o něco častěji patogenem, E. faecium je častěji součástí střevní mikroflóry •Nebezpečné jsou vankomycin rezistentní enterokoky (VRE) •Jeden z enterokoků, nalezený v Brně, má název Enterococcus moraviensis [USEMAP] • [USEMAP] • Klinická charakteristika G+ tyčinky Příběh druhý •Evropský komisař zachmuřeně hleděl na kupu stížností. Francouzští zemědělci protestují proti několika státům EU, které brání dovozu delikatesních francouzských sýrů na jejich území. •Německé úřady zákaz dovozu zdůvodňují tím, že těhotná paní H. M. po požití sýra pozorovala zvýšenou teplotu a nakonec její dítě trpělo novorozeneckou meningitidou, pro kterou muselo být komplikovaně léčeno. 08 Baby%20with%20Listeria 13 těhotná listeria •http://womansday.ninemsn.com.au •http://www.leighday.co.uk Kdo za to tentokrát může? nBakterie Listeria monocytogenes je grampozitivní tyčinka, která se vyznačuje schopností růst při nízkých teplotách a vysokých koncentracích NaCl, což je oboje splněno např. ve skladech sýrů. Lidé se ale nakazí i požitím dalších potravin (saláty, uzeniny, lahůdkové výrobky, nedostatečně omytá zelenina) Listerie – pokračování •Málokdy vyvolává viditelné infekce dospělých. U těhotných ale hrozí kongenitální infekce plodu přes placentu s následkem potratu nebo (ve třetím trimestru) infekce plodu, nebo také perinatální infekce při porodu (nákaza kontaminovaným poševním sekretem). U novorozenců je typická meningitida či sepse •Infekce není příliš častá, má však vysokou smrtnost (letalitu, tj. procento úmrtí ze všech nakažených) •Někdy se stává záminkou pro omezení dovozu – vždy by se mělo zvážit konkrétní riziko v individuálním případu 09 Listeria 10 listeria •http://microbewiki.kenyon.edu •http://www.territoire-belfort.gouv.fr Příběh třetí •Pan B. je diabetik, chronický pacient, nyní léčen pro bércové vředy. Bohužel, infekce střídá infekci. Před půlrokem byla usvědčena Escherichia coli, před dvěma měsíci zase Enterococcus faecium, blízký příbuzný enterokoka Enterococcus faecalis. Lékaři jsou zvědaví, co se z bércového vředu pana B. vykultivuje tentokrát. 19 bércák •www.zilniklinika.cz A už to vědí: viníkem je nyní •Corynebacterium jejkeium, relativně nejobávanější ze skupiny tzv. nedifterických (= nezáškrtových) korynebakterií. Původně se mu říkalo „korynebakterium skupiny JK“. •Korynebakteria jsou grampozitivní tyčinky, někdy pleomorfní (různotvaré), často uspořádané do palisád (vizte dále) •Do stejného rodu patří i původce záškrtu, dnes díky očkování u nás vzácný – C. diphtheriae. •Název je odvozen od kyjovitého tvaru (koryné = kyj), ovšem tato morfologie je typická spíše pro C. diphthteriae než pro nedifterická korynebakteria Záškrt •Diphtheria - Donna M. Santer, M.D., Michael P. D'Alessandro, M.D. Available on: http://www.virtualpediatrichospital.org/providers/ElectricAirway/PathImages/DiptheriaPseudo.shtml (visited 2012-10-02) Diphtheria Co ještě vědět o nedifterických korynebakteriích •Jsou normální součástí běžné flóry na kůži, spolu se stafylokoky a kvasinkami •V mikroskopii se vyznačují palisádovým uspořádáním – název dle raně středověkého kůlového opevnění St_Fagans_Celtic_village_palisade •File:St Fagans Celtic village palisade.jpg, From Wikipedia, the free encyclopedia, available at http://en.wikipedia.org/wiki/File:St_Fagans_Celtic_village_palisade.jpg, visited 2012-10-02 Co jsou to „koryneformní tyčinky“ •„Koryneformní tyčinky“ (případně „diftheroidy“) jsou různé tyčinky s podobnou morfologií (i když jejich rozměry se mohou poměrně lišit). •Všechny jsou občasnými původci různých typů lidských infekcí. •Arcanobacterium haemolyticum je vzácným původcem faryngitid •Další rody: Dermatophilus, Rhodococcus*, Turicella atd. •Podobná je i Erysipelothrix rhusiopathiae – původce zoonózy zvané erysipeloid (u zvířat červenka) •Rhodococcus jostii byl nalezen na mrtvém těle moravského markraběte a nekorunovaného římského císaře Jodoka (Jošta) zemřevšího 1411. Tělo je pohřbeno v kostele sv. Tomáše v Brně Příběh čtvrtý •Sestřička Blaženka se zděsila: přišly výsledky stěrů z nemocničních lůžek, které před týdnem odebírali pracovníci nemocniční epidemiologie. A skoro v polovině stěrů se našly nějaké bakterie, dokonce BACILY! No ano, tady to je – Bacillus sp. Sestřička Blaženka, chudinka ubohá, se celou noc trápila a špatně spala. Ráno zavolala na mikrobiologii a ptala se, cože je to za bakterii… Full%20Fowler%20Hospital%20Bed%20Kamora •Cordoba Healthcare, available at: http://cordobahealthcares.com/hospital_furniture.html, visited 2012-10-02 20 Bacillus%20cereus Mlýnský kámen spadl z dobrého srdíčka sestry Blaženky •když se dozvěděla, že většina příslušníků rodu Bacillus jsou neškodné mikroby, vyskytující se ve vnějším prostředí. Pokud se vyskytnou v kultivaci klinického vzorku, jde pravděpodobně o kontaminaci. Bacily tedy nejsou ve stěrech z lůžka závažným nálezem. Problém by byl jen tehdy, pokud by byly prokázány ve stěru z plochy, která má být sterilní (např. operační pole po dezinfekci) •www.waterscan.co.yu Jsou však i bacily stojící za zmínku •Bacillus anthracis je původcem veterinárního onemocnění – uhláku (sněť slezinná). Byla to jedna z prvních nákaz, proti nimž byla zkoušena (již Pasteurem) vakcinace. Jeho spory jsou zneužitelné pro účely biologické války či bioterorismu (o úniku spor z tajné továrny v SSSR v roce 1979 viz: http://cs.wikipedia.org/wiki/Sverdlovsk%C3%BD_incident) •Bacillus cereus je původcem alimentárních intoxikací z obilných produktů. •Geobacillus (dříve Bacillus) stearothermophillus a Bacillus subtilis se vzhledem ke své schopnosti přežívat při velmi vysokých teplotách používají jako indikátory účinnosti sterilizátorů 21 bacillus 22 Genre%20Bacillus aa [USEMAP] •www.cropsoil.uga.edu •http://membres.lycos.fr Bacillus a jeho spory •Spory Bacillus sp. jen někdy vyklenují (bubří) tyčinku (vegetativní buňku, která je obklopuje); mohou být terminální, subterminální či centrální • Enterokoky a G+ tyčinky: léčba Léčba infekcí způsobených enterokoky a G+ tyčinkami •Na enterokoky ani na listerie neplatí cefalosporiny. U E. faecalis je výhodný ampicilin, u E. faecium je primární rezistence. Dále se používá ko-trimoxazol, doxycyklin, jako rezerva vankomycin. V poslední době se zejména u hematoonkologických pacientů objevují epidemiologicky závažné vankomycin rezistentní kmeny – VRE. Zde zabírá pouze nové antibiotikum – linezolid Referenční zóny pro nejběžnější antibiotika Antibiotikum Zkr. „C“ je-li ≥ než (mm) „I“ je-li mezi (mm) „R“ je-li < než (mm) Ampicilin (aminopenicilin) AMP ≥ 10 8–9 < 8 Nitrofurantoin (nitrofuran) F ≥ 15 < 15 Vankomycin (glykopeptid) VA ≥ 12 < 12 Tetracyklin* TE ≥ 19 15–18 < 15 Quinu-/dalfopristin** QD ≥ 22 20–22 < 20 Gentamicin (aminoglykosid)*** CN ≥ 8 < 8 •*platí i pro doxycyklin **směs dvou streptograminů ***jen do kombinace s betalaktamy •Enterokoky testujeme na MH, G+ tyčinky na MH s krvinkami. [USEMAP] • Diagnostika enterokoků a G+ tyčinek (+ obrázky) Popis pachatelů (diagnostika) – 1 01 Enterococcus Enterokok Listerie Koryneform. Bacillus G+ koky v krátkých řetízcích G+ tyčinky řetězící se za sebou nebo jako palisády G+ tyčinky skládající se vedle sebe (palisády) G+ robustní tyčinky, sporulující (nemusí být viditelné) šedavé, velké asi jako Str. agalactiae, většinou bez hemolýzy, ale i s virid. či h. podobné entero- kokům, hemolýza je či není velmi drobné kolonie podobné mouce plsťovité kolonie, někdy i výrazná hemolýza Enterokoky – vzhled kolonií 03 ECFM VRE normální morfo •http://microbiology.mtsinai.on.ca Popis pachatelů (diagnostika) – 2 Enterokoky •Biochemické testy: kataláza negativní, možné je biochemické rozlišení, důležité štěpení arabinózy (E. faecalis neštěpí, půda je zelená, E. faecium štěpí, žloutne) •Antigenní analýza se zpravidla nepoužívá. V dobách, kdy patřily mezi streptokoky, je Lancefieldová zařadila do antigenní skupiny D (ovšem některé streptokoky ze skupiny D zůstaly v původním rodu) •Citlivost lze testovat na běžném MH agaru. Existují i půdy na skríning VRE (viz dále) 06 ECFS •http://www.morgenwelt.de Popis pachatelů (diagnostika) – 3 G+ tyčinky •Biochemické testy: kataláza u všech tří pozitivní, ale např. u rodu Arcanobacterium (blízkého korynebakteriím) je negativní! Biochemicky lze rozlišovat koryneformní tyčinky navzájem (API Coryne, Remel) •Růst při nízkých teplotách, vysokých koncentracích NaCl a hemolytické interakce se používají v diagnostice listerií •Průkaz antigenu – například průkaz difterického toxinu Elekovým testem Fotografie z databáze zločinců 1 Enterokoky Ent mikro Ent že Ent SB •Mikroskopie •Žluč-eskulin •Slanetz-Bartley •Foto: archiv ústavu oba levé obrázky fotografoval Prof. MVDr. Boris Skalka, DrSc. Fotografie z databáze zločinců 2 Tyčinky I limo1 •Listeria – KA, Gram diftmik •Corynebacterium Gram diftmik1 12 LIMO mikr •1, 2, 3 archiv ústavu •4 http://medinfo.ufl.edu •1 •2 •3 •4 •1 •2 Fotografie z databáze zločinců 3 Tyčinky II – korynebakteria, tvary diftmik2 diftmik2a •archiv ústavu, foto O. Z. Fotografie z databáze zločinců 4 Tyčinky III arhe •Bacillus subtilis basu6 •Arcanobacterium haemolyticum •Bacillus cereus Bace [USEMAP] •vše: archiv ústavu • Diferenciální diagnostika enterokoků a G+ tyčinek Diferenciální diagnostika: enterokoky •Gramovo barvení rozliší grampozitivní koky, grampozitivní tyčinky a ostatní bakterie. •Stafylokoky odliší pozitivní kataláza a růst na NaCl •Streptokoky odliší nepřítomnost růstu na Slanetz-Bartleyho či ŽE půdě, popř. PYR testem (kromě S. pyogenes negativní) •Vzájemné rozlišení je možné arabinózovým testem nebo složitějším (ENCOCCUS) testem Rozlišení enterokoků •Provedení arabinózového testu: kolonie se smísily s arabinózou a indikátorem a nechají inkubovat • • • •ENCOCCUS test má jen osm reakcí. Jinak se s ním pracuje podobně jako s jinými obdobnými testy •p Zelená negativní E. faecalis Žlutá pozitivní E. faecium Diferenciální diagnostika: Bacillus •Gramovo barvení odliší grampozitivní tyčinky od ostatních •Bacily se navíc projeví už v Gramově barvení coby velmi rozměrné (robustní) tyčinky. Často, ale ne vždy, můžeme také pozorovat tvorbu endospor (prázdná místa v tyčince) •Kultivačně jsou také charakteristické (velké, plsťovité kolonie) •Druhové určení je možné biochemickými testy, testy citlivosti na antibiotika apod. •U G+ tyčinek ale není jednoznačný algoritmus! Diferenciální diagnostika: listerie a koryneformní tyčinky •Gramovo barvení odliší grampozitivní tyčinky od ostatních •Pokud tyčinky nesporulují a nejsou robustní, mělo by jít o listerie nebo některou z koryneformních tyčinek (pozor, samotná nepřítomnost endospory není důkaz!) Další rozlišení je možné biochemicky, růstem při různých teplotách, testy hemolytických interakcí (synergismů, antagonismů) apod. •U G+ tyčinek ale není jednoznačný algoritmus! Žluč-eskulinový agar 11 bileazideagar •http://www.geocities.com Růst listerií při 4 °C •Ze všech námi studovaných G+ tyčinek jen Listeria je schopna růst při nízkých teplotách. To jí umožňuje šíření v sýrárnách •Z jiných bakterií (ne G+ tyčinek), roste při chladničkových teplotách několik dalších druhů (Yersinia, některé druhy pseudomonád apod.) 26 Chromogenní půda na listerie Chromogenní půda na listerie •Existují různé chromogenní půdy k diagnostice listerií. Ta, která je na obrázku, se jmenuje ALOA a vyznačuje se modrým zbarvením všech kolonií listerií, přičemž patogenní druhy navíc mají kolem sebe halo (odlišně zbarvené okolí kolonie). •HALO • •www.oxoid.com Elekův test •Jde o detekci toxinu. Používáme papírek se specific. antitoxinem, který je položen na povrch agaru, poté se očkují testované kmeny. Pozitivní výsledek = precipitační linie. Elekův test Konec 24 Banthracissporeandvegatativeform-gramstain [USEMAP] •http://www.cdphe.state.co.us •Bacillus anthracis • [USEMAP] •Zpět na hlavní obsah Bonus: VRE (vankomycin rezistentní enterokoky) 06 ECFS [USEMAP] •http://www.morgenwelt.de/typo3temp/5ce14d39b5.jpg • Enterokoky – charakteristika citlivosti •Enterokoky jsou primárně rezistentní na řadu antibiotik (mimo jiné všechny cefalosporiny, ale také makrolidy, linkosamidy, horší je i účinnost G-penicilinu) •Enterococcus faecium (méně patogenní, ale více resistentní než E. faecalis) je navíc primárně rezistentní na ampicilin •K léčbě lze použít např. ko-trimoxazol, tetracykliny, chinolony, glykopeptidy (vankomycin, teikoplanin); aminoglykosidy pouze v kombinaci [USEMAP] • VRE – kdy jsou závažné, a proč •Rezistence na vankomycin jsou závažné u klinicky významných izolátů druhů Enterococcus faecalis a Enterococcus faecium •Pokud je zachyceno pouhé nosičství VRE, není to důvod k léčbě (enterokok je normální flórou střeva), avšak je to důvod k obezřetnosti a izolaci pacienta •Z tohoto důvodu se u pacientů ARO často provádí screening střevního nosičství VRE •Za závažnou se nepovažuje rezistence na vankomycin u kmenů E. gallinarum či E. casseliflavus, izolace se nepovažuje za nutnou (druhy s menší patogenitou) •Významnou hrozbou je přenos rezistence na stafylokoky, viz dále. I to je důvod, proč VRE hlídat a kontrolovat [USEMAP] • [USEMAP] VRE v Brně •Na MÚ LF MU a FN USA Brno byly donedávna zaznamenány pouze ojedinělé případy VRE, ale v posledních letech jich výrazně přibylo •Naproti tomu na OKM FN Brno-Bohunice byly nálezy VRE už dříve podstatně častější •Pravděpodobným důvodem je spektrum pacientů. VRE jsou časté u pacientů s nádorovým bujením leukocytárních buněk, a tito pacienti se v rámci JMK soustřeďují právě v bohunické nemocnici • Příklad systému bdělosti pro VRE 28 fig1vree [USEMAP] •http://www.phac-aspc.gc.ca/publicat/ccdr-rmtc/97vol23/23s8/vrei_e.html • Lékem volby je linezolid (ZYVOXID), případně dalfopristin/quinupristin (SYNERCID) 27 0211_VRE_faecium_sensitive_to_Synercid [USEMAP] •www.aic.cuhk.edu.hk/web8/enterococcus_faecium.htm • Možné mechanismy přenosu VRE 29 přenosy VRE [USEMAP] •www.cdc.gov/ncidod/eid/vol3no3/mcdonald.htm • •Zpět na hlavní obsah