PCR v reálném čase doc. RNDr. Milan Bartoš, Ph.D, Bartoš. Milan@atlas. cz Přírodovědecká fakulta MU, 2017 Doporučená literatura Bustin S.A. (2004): A-Z of Quantitative PCR, International University Line, La Jolla, California tli ümtechnoJoft A-Z of Quantitative PCR edited by Stephen A. bustin Obsah přednášky 1) Princip PCR v reálném čase 2) Komponenty specifické pro real-time PCR 3) Nespecifické formáty 4) Specifické formáty 5) Fluorofory a jejich vlastnosti 6) Vlastnosti zhášečů 7) Sondy 8) Příklady využití 9) Emulsní PCR a pyrosekvenování „Real-time PCR"je nejmodernějším výdobytkem polymerázové řetězové reakce Real-time PCR - princip > kombinované provádění DNA amplifikace a detekce cílové nukleové kyseliny současně v jedné zkumavce pomocí světelného signálu z fluoroforů > je možno dynamicky posuzovat průběh syntézy PCR produktu > stanovení množství matrice vložené do reakce (kvantitativní PCR) Výhody real-time PCR > stejná nebo vyšší citlivost bez manipulace se vzorky - snížení rizika kontaminace > není třeba provádět elektroforézu > automatizace procesu pro klinické využití > kvantifikace templátu - množství patogenního mikroorganismu, hladina mRNA > rozmanité typy sond - více lokusů v jedné reakci (multiplex) Formáty real-time PCR > fluorofory s vazbou na dvou řetězcový fragment DNA = SYBR® Green I; > princip 5' —► 3'exonukleázové aktivity DNA polymerázy na značené sondy = TaqMan®; > princip hybridizace lineárních a nebo vlásenkových („hairpin") sond = FRET, Beacons, aj.; > princip fluoreskujících amplikonů = Amplifluor™, Scorpions; Formáty real-time PCR - jiné dělení > Nespecifické metody: založené na nespecifické vazbě fluoroforu do vznikající molekuly dsDNA, fluorofor vázaný do struktury dsDNA svítí více > Specifické metody: založené na specifické vazbě sondy označené fluoroforem Nespecifické metody Využívají DNA interkalátory > Fluorofor se interkaluje, „váže" do vznikajícího řetězce DNA v průběhu PCR > Vazba v malém žlábku molekuly DNA > Quencher-Labeled Primer I > Quencher-Labeled Primer II > LUXTM Primers > AmplifluorTM > SYBR Green I Princip použití SYBR™ Green I i— Co se děje uvnitř termocykleru při real-time PCR? Fluorescence O N> CO 1 Ol -i Ol M Ol W Ol J i i i i i i i i Cílová sekvence je ^ .+—*■ ■+—*■ ■+ přítomna ♦ / / • • / Cílová sekvence není přítomna ^^^^^ • ^^^^^^^^ .^^^^^^^ 2 6 10 14 18 22 26 30 34 38 42 46 50 Počet PCR cyklů Je vazba molekuly SYBR Green do vznikající molekuly DNA reversibilní nebo ireversibilní děj a proč tomu tak je? Podívej se ještě jednou na strukturu Jak detekovat rozdíly v sekvenci DNA pomocí SYBR Green I - modelový příklad - Úsek A o délce 200 bp ohraničený primery CCTCCTGCCTCTACCAATCGCCAGTCAGGAAGGCAGCCTACCCCGCTG ACTCCACCTTTGAGAGACACTCATCCTCAGGCCATGCAGTGGAATTCC ACAACCTTCCACCAAACTCTGCAAGATCCCAGAGTGAGAGGCCTGTAT CTCCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGAACAGTAAACCCTGTTCCGACT ACTGCCTC Úsek Ai s inzercí 5 bp o délce 205 bp ohraničený primery CCTCCTGCCTCTACCAATCGCCAGTCAGGAAGGCAGCCTACCCCGCTG ACTCCACCTTTGAGAGACACTACACTCATCCTCAGGCCATGCAGTGGA ATTCCACAACCTTCCACCAAACTCTGCAAGATCCCAGAGTGAGAGGCC TGTATCTCCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGAACAGTAAACCCTGTTCC GACTACTGCCTC Výsledek detekce pomocí SYBR Green I Základní data Výsledek analýzy Tm pomocí SYBR Green I Základní data 30 40 65 78 88 Teplota Vyhodnocení detekce pomocí SYBR Green I- analýza Tm Výhody a nevýhody nespecifických systémů Výhody Nevýhody r Cenové „nenáročná" > Vazba do ssDNA > Není nutná analýza > Problematická analýza sekvence pro návrh sond primer/dimer struktur > Problematická kvantifikace Specifické metody Využívají značené DNA sondy Metody jsou založené na hybridizaci primem a sondy specifické pro hledaný úsek DNA Hlavní typy značených DNA sond > Lineární sondy > Strukturní sondy Komponenty specifických systémů real-time PCR > Fluorofory > Zhášeče > Sondy Vlastnosti fluoroforů 1) Velká část fluoroforů jsou heterocyklické polyaromatické uhlovodíky 2) Jejich konečná fluorescence (emise) závisí na schopnosti molekuly fluoroforů absorbovat a emitovat fotony 3) Emise fluoroforů je silně závislá na teplotě Fluorofor F AM Fluorescein Fluorofor HEX HexachloroFluorescein Fluorofor JOE e-carboxy-^S'-dichloro^',?'-dimethoxyfluorescein N-hydroxysuccinimide ester Způsob vazby na DNA Cl Cl Způsob vazby na DNA - jiný způsob Princip fluorescence 1) Světlo o definované vlnové délce je absorbováno molekulou fluoroforu 2) Molekula fluoroforu přejde do excitovaného stavu s vyšší energii 3) Molekula se vrátí do základního stavu po emisi světelného záření o jiné vlnové délce Zhášeče Heterocyklické polyaromatické uhlovodíky schopné absorbovat nebo disipovat energii z excitovaného fluoroforu Zhášeč přijímá energii z fluoroforu a absorbuje nebo disipuje ji mechanismem 1) Proximálního zhášení - proximal quenching 2) FRET - Fluorescence Resonance Energy Transfer Proximální zhášení Založeno na krátké vzdálenosti mezi fluoroforem a zhášečem, která mezi nimi dovoluje efektivní přenos energie, již zhášeč převádí na teplo a tím „zháší" excitovaný fluorofor. FRET Ponorová molekula (excitovaná externím světelným zdrojem) předává část své energie na akceptorovou molekulu, která vyzáří světlo o jiné vlnové délce. Účinnost tohoto procesu je mimo jiné silně závislá na vzdálenosti molekuly donoru a akceptoru ( účinně 100Ä, cca 30 bp v lineárním formátu sond). Schéma FRET Sondy Krátký oligonukleotid s podobnými vlastnostmi jako PCR primer - váže se na DNA řetězec stejným způsobem jako PCR primer Umožňuje vázat fluorofor a zhášeč v efektivní vzdálenosti od sebe a tím zajistit proces zhášení fluoroforu do doby detekce Fluorofor, sonda, zhášeč - TTC ATG CTT GGA CCG CTG ATT CCT - TTC ATG CTT GGA CCG - - TTC ATG CTT GGA CCG Nejčastěji používané kombinace fluorofor/proximáíní zhášeč Formáty specifických systémů Lineární sondy Strukturní sondy > ResonSense® Probes > Molecular Beacons > > > Angler® Probes HyBeaconsTM Light-up Probes > > ScorpionsTM CycliconsTM > > Hydrolysis (TaqMan®) Probes Lanthanide Probes > > Nanoparticle Probes Conjugated Polymers/Peptide Nucleic Acid Probes > Hybridization Probes (FRET) > EclipseTM > Displacement Hybridization/Complex Probe Při jakémkoli formátu je výsledek pořád stejný Fluorescence O N> CO 1 Ol -i Ol M Ol W Ol J i i i i i i i i Cílová sekvence je ^ .+—*■ ■+—*■ ■+ přítomna ♦ / / • • / Cílová sekvence není přítomna ^^^^^ • ^^^^^^^^ .^^^^^^^ 2 6 10 14 18 22 26 30 34 38 42 46 50 Počet PCR cyklů Ta q M a n sonda > monitoruje 5' —► 3' exonukleázový efekt Taq DNA polymerázy na vzniklý duplex mezi sondou a jejím komplementárním řetězcem na PCR produktu > Taq DNA polymeráza uvolňuje a hydrolyzuje sondu hybridizovanou v průběhu syntézy správného řetězce na matrici DNA > fluorofor s excitační energií (R) a fluorofor (Q) pohlcující energii, tzv. „quencher dve" Schéma fungovaní TaqMan sondy TaqMan sonda - animace Kvalitativní detekce 2 úseků DNA v jedné reakci (duplex PCR) pomocí TaqMan sond - modelový příklad - Úsek A o délce 100 bp ohraničený primery a označený sekvenčně specifickou sondou, která nese fluorofor s emisním maximem při 530 nm CCTCCTGCCTCTACCAATCGCCAGTCAGGAAGGCAGCCTACCCCGCTGACTCC ACCTTTGAGAGACACTCATCCTCAGGCCATGCAGTGGAATTCCACAA Úsek B o délce 100 bp ohraničený primery a označený sekvenčně specifickou sondou, která nese fluorofor s emisním maximem při 560 nm TTGTTCACCTCACCATACTGCTCTCAGGCAAGCAATTCTTTGCTGGGGGGAACT AATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTGGTAATTTGGAAGATCCAACATC Kvantitativní detekce pomocí Real Time PCR s využitím Taq Man sond - modelový příklad - Úsek A o délce 100 bp ohraničený primery a označený sekvenčně specifickou sondou, která nese fluorofor s emisním maximem při 530 nm CCTCCTGCCTCTACCAATCGCCAGTCAGGAAGGCAGCCTACCCCGCTGACTCC ACCTTTGAGAGACACTCATCCTCAGGCCATGCAGTGGAAriCCACAA Jaký je počet kopií (koncentrace) úseku A ve vzorku 1? Jaký je počet kopií (koncentrace) úseku A ve vzorku 2? Postup kvantifikace pomocí Reaí Time PCR s využitím TaqMan sondy 1. Stanovení Ct (threshold cycle), Cp (crossing point) 2. Vytvoření kalibrační křivky 3. Kvantifikace neznámého vzorku pomocí vložené kalibrační řady Stanovení Ct threshold cycle •Vzorek > Ct - číselná hodnota udávající PCR cyklus ve kterém je přístrojem detekována první změna fluorescence v amplifikovaném vzorku > Číselnou hodnotu Ct určuje přístroj automaticky §2,5 a) 8 2 i— o -15 8 14 20 26 32 38 44 50 Počet PCR cyklů Vytvoření kalibrační křivky lOexpl 10exp2 10exp3 10exp4 Koncentrace Kvantifikace neznámého vzorku pomocí vložené kalibrační řady 10 14 18 22 26 30 34 38 42 46 50 Počet PCR cyklů Standard 10exp4 Standard 10exp3 Standard 10exp2 Standard 10expl Vzorek 1 Vzorek 2 Vzorek Typ vzorku Ct Koncentrace (kopií/ul) 1 Neznámý 25,64 3,50E+03 2 Neznámý 29,23 2,50E+02 Standard 10exp2 10exp3 Koncentrace 10exp4 Lineární sondy - Hybridization Probes (FRET) - 111111111111111 ............... 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 J_l_l_l_l_l_l_l_l. ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^i ^^^^^^^^^^^^^ 3' B Použití FRET analýzy pro detekci jednonukleotídové mutace (SNP) v úseku DNA - modelový příklad - Standardní alela o délce 200 bp CCTCCTGCCTCTACCAATCGCCAGTCAGGAAGGCAGCCTACCCCGCTGACTCC ACCTTTGAGAGACACTCATCCTCAGGCCATGCAGTGGAATTCCACAACCTTCCA CCAAACTCTGCAAGATCCCAGAGTGAGAGGCCTGTATCTCCCTGCTGGTGGCT CCAGTTCAGGAACAGTAAACCCTGTTCCGACTACTGCCTC Mutantní alela (s mutací v jediném nukleotidu) o délce 200 bp CCTCCTGCCTCTACCAATCGCCAGTCAGGAAGGCAGCCTACCCCGCTGACTCC ACCTTTGAGAGCCACTACACTCATCCTCAGGCCATGCAGTGGAATTCCACAACC TTCCACCAAACTCTGCAAGATCCCAGAGTGAGAGGCCTGTATCTCCCTGCTGGT GGCTCCAGTTCAGGAACAGTAAACCCTGTTCCGACTACTGCCTC Návrh sond pro detekci SNP pomocí FRET GAGAGATCACTCAT-FľTC RED-CCATGCAGTGGA GACTCCACCTTTGAGAGATCACTCAÍOTCCTCAGGCCATGCAGTGGA Princip analýzy SNP pomocí FRET sond Nestandardní alela (dCTP) Tm= 55°C i i i i i i i i i/k i i i .......... 1 1 1 1 i i i i 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ..... Standardní alela (dATP) Tm= 62°C Výsledek detekce SNP pomocí FRET Základní data 2 6 10 14 18 22 26 30 34 38 42 46 50 Počet PCR cyklů Vyhodnocení detekce SNP s použitím FRET pomocí analýzy Tm •Homozygot pro mutantní alelu (dCTP) Homozygot pro nestandardní alelu (dATP) »Heterozygot (dATP/dCTP) 40 44 48 52 56 60 64 68 72 76 80 84 Teplota Light-up sonda Strukturní sondy MolecularBeacons Scorpions Real Time přístroje Vývoj pokračuje - miniaturizace Temperature Input Range 35 - 99°C (min 40°C) Temperature Accuracy ± 0.25°C Temperature Uniformity ± 0.05°C Heating Ramp Rate 4°C/s (fast mode) Cooling Ramp Rate 3°C/s (fast mode) Channels used FAM™, HEX™, ROX™, Cy™ 5 / Cy™5.5 Reaction Vessels 48 Samples Reaction Volume Range 5 - 30 pi Dimensions (mm) W: 150, L: 150, H: 130 Weight 2.1 kg Vývoj pokračuje - multiplexní systémy > RUO verze > CE-IVD verze „Čipy" pro vyšetření 8, 4, 2 nebo 1 pacienta na až 15, 23, 31,47, 63, 95,191 nebo 380 specifických cílových sekvencích Je možné metodou real-time kvantifikovat také RNA? Samozřejmě, použiješ metodu RT-Real-Time PCR (RT-qPCR) Real-time PCR v mikrobiologii > Umožňuje všechny formáty klasické PCR > Stejná nebo vyšší citlivost bez manipulace se vzorky - snížení rizika kontaminace > Je více specifická - 2 primery + sonda > Umožňuje stanovit počet mikroorganismů ve vzorku (kvantifikace) > Není třeba provádět elektroforézu > Automatizace procesu pro klinické využití Využití Real Time PCR ve formátu TaqMan pro kvalitativní detekci M. tuberculosis komplex Naměření a hodnocení dat JNorm. [ 0,25 rluoro. 1 0,2 0,15 0,1 0,05 0 £| ▼ Threshold ~~P- '0 '5 '10 '15 '20 25 1 30 35 40 íycle 1 1 Adjust Scale,,, Auto-Scale Default Scale Log, Scale Name Type Ct Sample 1 Unknown Sample 2 Unknown 27,55 Sample 3 Unknown PK102 Positive Control 30,68 NK Negative Control Využití Real Time PCR ve formátu TaqMan pro detekci a kvantifikaci cytomegaloviru Naměření dat Kvantifikace a odečtení výsledků Name Type Ct Given Cone (copies/ml) Calc Cone (copies/ml) Sample 1 Unknown Sample 2 Unknown 29,23 2,39E+02 Sample 3 Unknown 32,78 1,88E+01 PK104 Standard 23,97 1,00E+04 1,03E+04 Standard PK102 Standard 30,68 1,00E+04 8.47E+01 PK101 Standard 33,53 1,00E+04 1,10E+01 Příklad stanovení Candida dublíníensís na termocykleru MIC Základní data o É>y ľ. No IrxtrumenK Pcorta ' 20170106 CanDub PK IC IIS k Cycling Green Run Profile S*mplr\ Ir1.-..ri:.: 25 VO 45 Cycle a. Samples O : ■ Cen0ub.PK.lCt9 2 ■ Car.Dufa.PK.lCCl C«nOub.PK.10€7 ■1 ■ C*nDuO.PK.lC€6 ■ C*«Oufa.PK.10í5 C*n0ub.PK_10{4 7 ■ C*r,0^t>.PK.l«3 í ■ :- ■ Ce^D-o.P<.lC€l 10 ■ CanOub.PK.10e0 n ■ CjnDuto.PK.lOM u ■ CjnOufa.PK.lOf-2 13 ■ CanOufaJC.lOtí MB C«rOub_X_10EB 15 U CanOubJCJlOn m CanOubJC.lOefi 17 ■ C»nOub.K.10£5 u ■ CanDub.JC.10C4 1« ■ CanOub.K.lMJ 20 a C*fOubJC.10€2 ai CanOubJCJOtl :: ■ CanOubJClOeO 23» CanDob.K.lOC-1 24 ■ CanOub.IC.lOt-2 .'5 ■ NK.te .' ■ ' ' ■ ■i 21 ■ 29 ■ 30 B_ Normalizovaná data O 1 &y H » :■ CanOub.PK.10C7 •> I 4' CanDub.PK.10« •> 51 CanDub.PK.10E5 •> : «■ CanOub.PK.10C4 • CenDub.PK.10C3 • J ■ ■ CenDgb.PK.10C2 • 9B CanOub.PK.10U •> 10 ■ CanDub.PK.10C0 • -. ■ CanOub.PK 10C-1» i;B CenOub.PK.lOE-2*» C*n0u*JC.l«9 • ! Ml CanDuOjC.lOto • 15 ■ CanDubJC.l«7 • UM CanDubJC.10f6 • :?■ CanDuo.tC.10CS • i* ■ CanDub.lC.i«.« •> -.t m CanDub.IC.lK3 • 20 B O>DueJC.10U • na CanDubJC.lOCl • :: ■ CanDubJC.lOCO • 23 ■ CarDubJC.lCC-1 • CanDubJC.lOC-2« -; ■ NK.Í8 • NK_» • ■ ■ '. ■ v Auto twje Ettludea Lineární rozsah O É . U L ' 20170106 CanĽub PK IC IIS k Absolute Quantification ES Cyriwiq Green I >>!.... Ulli . Menage* 4 CytWng Non-Assay Green 4 Abtoiutr CjuantifccaUon « Non-Assay eye««, Alleac ÜMcnnunaaon Retaiuve Quanfirricabon Standard Curve Characteristic* Equation: f = -3*3 « - 39.13 Efroancy OU (P: 09992 Oven Uťwtjtrt Cq Concentrate Concentraboi X V.. (Copcs/uil (Coem/ul) I M»Ht> PK .10*0 10 • CanOub PK 1CK1 . II.«I o n » 35,.. M 1191 1914 Sample CanOub.FK. 101 1 ~tX~\ 0.1 4 PK. m IX'Si' 1000000 100000000 Concentration (Lopies/uü lOOOOOOOOOO 1O00O00000O00 ft A Target- non-Assay Green Data Source: Cycling Green Standard Cur.«: Calcuťowd Import- Rámova i WeU Cq 4 Sample Unnamed 30 U Sam pla Results Calculated Concerrbaton (Cop*Vul| Samples O «> Cer>0vb.PK_lC« • * CanD_b.PK_lC€6 • CanOub.PK.10C7 4» CanOub.PK.10« 4» C*nOub_PK.10E5 4» CanOub.PK.10M 4» CarvDub.PK.10t3 4» CenOub.PK_10€2 4» CanOub.PK.10€l 4> CanOub.PK.10eO 4» CanOub.PK 10E-14» CanOub_PK.10f.24» CanOubJC.lOtt • CanOubJC.10.8 4» CanDubJC.1017 4» CanDub.IC.10E6 4» CanDuo.IC.10€5 4» Can0ub.IC.10E4 4» CanOubJC.1K3 4> CanDubJC_10t2 • CanOubJC.lOG 4» CanDubJClOEO • CanOubJC.lOi-l 4» CanOub JC.lOt-2 4» NKJE8 ~# NK.» # A dáme si nějaký příklad Stanovte koncentraci cytomegaloviru (v počtu virionů na mililitr) ve 4 vzorcích na základě dat uvedených v následující Tabulce I Tabulka I Vzorek ct Počet virionů/|jl PK104 22,52 1,300 x 104 PK103 27,86 6,373 x 102 PK102 30,95 1,119 x 102 PK101 35,09 1,078 x 101 Vzorek 1 34,86 Vzorek 1 35,13 Vzorek 1 35,44 Vzorek 2 38,02 Vzorek 2 Vzorek 2 38,51 Vzorek 3 24,76 Vzorek 3 24,81 Vzorek 3 24,36 Tabulka I Vzorek ct Počet virionů/|jl PK104 22,52 1,300 x 104 PK103 27,86 6,373 x 102 PK102 30,95 1,119 x 102 PK101 35,09 1,078 x 101 Vzorek 1 34,86 Vzorek 1 35,13 Vzorek 1 35,44 Vzorek 2 38,02 Vzorek 2 Vzorek 2 38,51 Vzorek 3 24,76 Vzorek 3 24,81 Vzorek 3 24,36 1) Z hodnot pro standardy vytvořte kalibrační křivku (počet virionů/Ct) 2) Podle hodnoty Ct odečtěte z kalibrační křivky počty virionů/pl 3) Vypočítejte průměr ze dvou měření pro jednotlivé vzorky 4) Přepočítejte počet virionů/ml Řešení pro Tabulku I Vzorek ct Počet virionů/|jl PK104 22,52 1,300 x 104 PK103 27,86 6,373x102 PK102 30,95 1,119 x102 PK101 35,09 1,078x101 Vzorek 1 34,99 1,230x101 Vzorek 1 35,13 1,058x101 Vzorek 1 35,44 8,888 x 10° Vzorek 2 38,02 2,068x10° Vzorek 2 - 0,00 Vzorek 2 38,51 1,568 x 10° Vzorek 3 24,76 3,676x103 Vzorek 3 24,81 3,574 x 103 Vzorek 3 24,36 4,586 x 103 Průměr 1,212x10° 3,945 x 103 Počet virionů/ml 1 212 3 945 000 Stanovte koncentraci viru Epstein-Barrové (v počtu virionů na mililitr) ve 3 vzorcích na základě dat uvedených v následující Tabulce > pozor na zápis výsledku z přístroje! > vzorky byly před zahájením izolace DNA 4x „zahuštěny", počítejte s tím při přepočtu Tabulka II Vzorek PK104 PK103 PK102 PK101 Vzorek 1 Vzorek 1 Vzorek 1 Vzorek 2 Vzorek 2 Vzorek 2 Vzorek 3 Vzorek 3 Vzorek 3 ct 33,69 26,63 26,78 27,00 Počet virionů/|jl 1.041E+04 8.779E+02 1.149E+02 Řešení pro Tabulku II Vzorek ct Počet virionů/|jl PK104 21,59 1.041E+04 PK103 25,53 8.779E+02 PK102 28,77 1.149E+02 PK101 32,74 9.522E+00 Vzorek 1 30,53 3,826E+01 Vzorek 1 31,89 1,624E+01 Vzorek 1 31,30 2,353E+01 Vzorek 2 33,11 7,559E+00 Vzorek 2 33,34 6,561 E+00 Vzorek 2 33,69 5,262E+00 Vzorek 3 26,63 4,422E+02 Vzorek 3 26,78 4,004E+02 Vzorek 3 27,00 3,493E+02 Průměr 2,601 E+01 6 461E+00 Počet virionů/ml 6 502,3 1 615 Minulost nebo žhavá současnost? - emulsní PCR 454 Life Sciences > Amplifikace probíhá v emulsi (voda-olej) > Jednotlivé matrice navázány samostatně na povrch jednotlivých kapek Emulsní PCR > Amplikon je výsledkem jedinečné PCR > Méně nespecifických produktů Konvenční PCR Emulsní PCR Využití emulsní PCR > Mapování genomů > Vyhledávání genových polymorfismů > Analýza mikrobiálních společenstev > bakterie v biofilmech > mikroorganismy v potravinářských vzorcích > nekultivovatelné bakterie Používá se ve spojení s pyrosekvenováním Pyrosekvenování > Metoda popsaná Mostafa Ronaghi et al. v roce 1990 > Určena pro krátké úseky DNA, SNP a úseky methylované > 4 enzymy > velmi přesná > reakce se záhy „zahltí" Pyrosekvenování - záznam Intenzita signálu odpovídá počtu začleněných nukleotidů Shrnutí 1) Princip PCR v reálném čase 2) Komponenty specifické pro real-time PCR 3) Nespecifické formáty 4) Specifické formáty 5) Fluorofory a jejich vlastnosti 6) Vlastnosti zhášečů 7) Sondy 8) Příklady využití 9) Emulsní PCR a pyrosekvenování