Enzymy používané při manipulaci s nukleovými kyselinami doc. RNDr. Milan Bartoš, Ph.D. bartosm@vfu.cz Přírodovědecká fakulta MU, 2014 Obsah přednášky 1) Přehled a funkce enzymů 2) Reštrikční endonukleázy - opakování 3) Reštrikční mapy 4) Detekce polymorfismů v genomech 5) DNA fingerprinty 6) Proteinové fingerprinty Doporučená literatura GENE CLONING & DNA ANALYSIS sixth eoriON Brown (2010): Gene Cloning & DNA Analysis. Wiley-Blackwell, Sixth edition katalog firmy New England Biolabs, USA, www.neb.com T.A.BROWN ■I'WIUV-HAOWLIL DNA polymeráza I > syntéza ve směru 5 - 3' > exonukleázové odbourávání ve směru 5 - 3' > exonukleázové odbourávání ve směru 3- 5' Klenowův fragment > syntéza ve směru 5 - 3' > exonukleázové odbourávání ve směru 3 - 5' > tam, kde se neodbourává primer > sekvenování, značení DNA 5' 3' Další enzymy - / Terminální deoxyribonukleotidyltransferáza 5' 3' <4 Zpětná transkriptáza mRNA ssDNA ^ Fosfatázy a kinázy Fosfatázy - Alkalická fosfatáza (telecí střevo) (E.coli infikované bakteriofágem T4) Ligáza T4 DNA ligáza (E. coli infikované bakteriofágem T4) OH + 2 x ATP 3' Ligáza Ligace - spojení dvou fragmentů DNA 5' ATTC ... 3 3'... CTTA 5' . . 3' . . GA ATTC // CTTA AG AG ... 5 samovolné připojení . 3' . 5' spojení ligázou 5'... GAATTC ... 3 + 2 x ATP 3' . . . CTTAAG ... 5 Exonukleáza III (E. coli) > exonukleázové odbourávání ve směru 3- 5' > odbourává 3 - OH konec Exonukleáza Bal 31 > štěpí lineární dsDNA z obou konců > zkracuje DNA fragmenty > konce jsou zarovnané S1 nukleáza (Aspergillus oryzae) > specifická pro ssDNA > odstraňuje jed n o řetěze e na dsDNA Deoxyribonukleázy DNáza I (hovězí pankreas) > nespecifická > vytváří jednořetězcové zlomy > následně DNA odbourává na mono a oligonukleotidy DNáza I Ribonukleázy > nespecifické i specifické > odbourávají RNA > používají se k odstraněné RNA ze vzorků s DNA > extrémně stabilní enzymy Reštrikční endonukleázy Co to jsou reštrikční endonukleázy Enzymy, které štěpí dsDNA ve specifických místech, specifických sekvencích > součást reštrikčné modifikačních systémů bakterií > omezují propagaci bakteriofágů v různých bakteriálních kmenech I FvZ > DNA hostitelské buňky je před účinkem vlastní RE chráněna metylací chromozóm 2 RE > původní význam RE: ochrana před cizorodým genetickým materiálem degradovaná fágová DNA Dělení restríkčních endonukleáz Typ I - rozpoznávají specifickou sekvenci, štěpí v nahodilém místě Typ II - přísně specifické, rozpoznávají a štěpí sekvence s rotační symetrií (palindrom) Typ III - rozpoznávají nesymetrické sekvence a štěpí v jiném místě v definované vzdálenosti Typ IV - štěpí mimo rozpoznávanou sekvenci, která musí být modifikována Restriktázy typu II Rozpoznávají palindromy a štěpí ve stejném místě > vážou se na specifické (4-8 pb) sekvence nukleotidů > katalyzují štěpení obou řetězců molekuly DNA uvnitř vazebného místa nebo v jeho bezprostředním sousedství > štěpení se podrobují všechna cílová místa v dané molekule DNA > molekulová hmotnost: 20 000 až 100 000 > kofaktor: pouze ATP Jak vypadá palindrom? Přilehlá obrácená repetice 5'.....ATGC/GCAT.....3' 3'.....TACG/CGTA.....5' Vlásenka ATGCGCAT A na dvouřetězci to vypadá takto ATGCGCAT TACGCGTA T=A A=T G=C Krizová struktura Jak funguje RE typu // 5' 3'... CT 5' . . ATTC ... 3 3'... CTTA AG ... 5 Je známo přes 3 500 RE, rozpoznávají asi 160 různých sekvencí Různé typy konců lepkavé (kohezní) úseky přečnívající na 5'- koncích, EcoR I 5'... GA 3' 5' ATTC ... 3' 3' . . . CTTA 5' 3' AG ... 5' lepkavé (kohezní) úseky přečnívající na 3'- koncích, Pvu II 5' . . . CGAT 3' 5' CG ... 3' 3'... GC 5' 3' TAGC ... 5' zarovnané (tupé) konce, Stu I 5 ' . . . AGG 3 ' 3 ' . . . CTT 5' 5' 3' CCT ... 3' GGA ... 5' Podívejte se na animace http://www.dnalc.org/ddnalc/resource s/animations.html http://highered.mcgraw- hill.com/sites/0072437316/student_view0/chap terl 6/animations.html Nebo si vyžádejte staženou prezentaci Existuje i procvičovací pps soubor Pro štěpení je důležitá orientace! 5 ' NGAATTCN 3 ' + EcoR\ 3 NCTTAAGN 5' 5 ' NCTTAAGN 3 ' + ^COR\ -> 3'NGAATTCN 5' 5 NCTTAAGN 3' + Affl -> 3'NGAATTCN 5' 5'NGA ATTCN 3' 3'NCTTA AGN 5' žádné štěpeni 5'NC TTAAGN 3' 3'NGAATT CN 5' Relaxovaná specifičnost Star activity Některé restriktázy za určitých reakčních podmínek štěpí blízce příbuzné sekvence EcoR\ 5'... G AATTC ... 3' 5'... G G ATTC ... 3 5...GGATTT...3 5...AGATTT...3 Důsledky relaxované specifičnosti > nespecifické produkty > často za neoptimálních reakčních podmínek PvuII PvuII PraO-HF 1 hr a'n " 1 hr u-n " 1 hr cAl ' M 1 nerozštěpené fragmenty DNA Názvosloví restrikčních endonukleáz např. Eco I > 1. písmeno: počáteční písmeno rodu produkční bakterie > 2. a 3. písmeno: první dvě písmena druhu produkční bakterie > označení kmene (serotypu produkční bakterie (ne vždy) > římská číslice vyjadřuje pořadové číslo endonukleázy izolované z dané bakterie Počet rozpoznávaných sekvencí pro určitou reštrikční endonukleázu na DNA o známé délce můžeme vypočítat Homing endonucleases Nukleázy, které štěpí dsDNA a rozpoznávají dlouhé nesymetrické sekvence (12-40 nukleotidů) a kódující sekvence intronů a inteinů > Názvosloví jako u restriktáz s prefixem I- nebo Pl- > Štěpí s extrémně nízkou četností > Nejsou příliš specifické, proto je průměrná frekvence štěpení jako by rozpoznávaly 10-12 bp l-Ceul, l-Scel, Pl-Pspl Význam restrikčních endonukleáz > nástroj pro přípravu rekombinantních molekul DNA > prostředek pro studium struktury, organizace, exprese a evoluce genomu > základ pro genové inženýrství > fyzikální mapování DNA > analýza populačních polymorfizmu > změny v uspořádání molekul DNA > příprava molekulárních sond > příprava mutantů > analýza modifikací DNA Mnoho dalších informací k restriktázám najdete na http:rebase.neb.com/rebase/ Rozřezání genomu endonukleázamí Reštrikční fragmenty Fragmenty vzniklé restrikčním štěpením lze rozdělit elektroforézou 1) Elektroforézou můžeme stanovit velikost jednotlivých fragmentů 2) Jednotlivé fragmenty můžeme poskládat a vytvořit tzv. reštrikční mapu Vytvoření reštrikční mapy po parciálním štěpení Využití restriktáz a PCR - detekce polymorfismů v genomech mikroorganism ů > Krátké fragmenty = RFLP - polymorfismus délky restrikčních fragmentů > Dlouhé fragmenty = PFGE - pulsní gelová elektroforéza > Analýza produktů PCR = PCR-REA > Polymorfismus délky amplifikovaných fragmentů = AFLP > Polymorfismy konformace SSCP, DSCP RFLP = polymorfismus délky restrikčních fragmentů Tuto část probereme v rámci přednášky o hybridizaci PFGE Pulsní gelová elektroforéza > určena k dělení velkých fragmentů DNA a chromozómů (nad 50 kbp, stovky kbp, megabáze) Aparatura na PFGE Pěkná animace znázorňující pohyb DNA v pulsním poli je na http://www.bio.davidson.edu/cours es/qenomics/method/pulse field.ht ml Jak se provádí PFGE 1) Buňky se naředí na vhodnou koncentraci 2) Buňky se zalijí do agarózy 3) Agarózové bločky se opracují enzymy - lyže. deproteinace 4) Na genomovou DNA v bločcích se aplikují restriktázy Jak se provádí PFGE 5) Bločky s rozštěpenou genomovou DNA se + Příklad aplikace PFGE Diferenciace mykobakterií po štěpení Nott a b c —li-ii-1 > nástroj pro epidemiology a epizootology > stanovení fylogenetické příbuznosti > nezbytná počítačová analýza dat ! porovnej s RFLP ! Jiný příklad aplikace PFGE Diferenciace Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis po štěpení SnaBX, Spel > Pokus odlišit RFLP typy B-C1 Diferenciace Mycobacterium avium subsp. hominissuis po štěpení Xba\, Dra\ > Studium genetické diversity kmenů izolovaných u pacientů s AIDS Jak se vyhodnocují fragmenty získané po PFGE? Analýza změn ve fragmentu 4 000 bp + RE - RE + 500 - 500 Velikosti 4000 2500 60004500 3500 fragmentů 1500 6000 5000 4000 2500 2000 1500 1000 750 Počet změn I L I i ] [ I i ] [ Vliv mutace na RFLP spektrum Mutace Výsledek > bodová +RE > bodová -RE > inzerce > ztráta fragmentu + 2 nové > ztráta 2 fragmentů + 1 větší nový > stejný počet fragmentů, ale jeden se „prodlouží" o délku inzerce > delece > stejný počet fragmentů, ale jeden se „zkrátí" o délku delece Kritéria pro epidemiologii Kategorie Počet genetických změn Počet změn v PFGE Epidemiologie Neodlišitelné Součást ohniska Blízce příbuzné 1 2-3 Pravděpodobně (probably) součást ohniska Asi příbuzné 2 4-6 Možná (possibly) součást ohniska Odlišné >3 > 7 Mimo ohnisko Tenover et al. (1995): Journal of Clinical Microbiology 33 (9), 2233-2239 Stejná pravidla platí pro RFLP Analýza methicilin rezistentních S. aureus pomocí PFGE Pulsed-Field Gel Electrophoresis Příklad PFGE pro MRSA Štěpení restriktázou Sma\ Dar et al. (2006): Molecular epidemiology of clinical and carrier strains of methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in the hospital settings of north India. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials 5:22 Typizace salmonel pomocí PFGE Štěpení restriktázou Bln\ De Lappe et al. (2009): Role of subtyping in detecting Salmonella cross contamination in the laboratory. BMC Microbiology 9:115 Shigella flexneri a Shigella sonnei m m M asr •* t» m jk ♦ 5 S S $ ' 1 É S • •35 ^ —"■^^jw^-w^jp'—» m , ^ M * « « * * t « iiif é SB ?Bř V Í(P MT • ""TRW* «- Štěpení restriktázou S/nl Štěpení restriktázou Xbal Kolektiv (2005): Outbreak of Shigella flexneri and Shigella sonnei enterocolitis in men who have sex with men, Quebec, 1999 to 2001. CCDR 31-08 PCR-REA, PRA, PCR-RFLP 111111111111111111111111111111 111111111111111111111111111 amplifikace I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I .......................... reštrikční štěpení I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I ............. ......... ......... ......... Bodová mutace u PCR-REA 1) Amplifikace specifické DNA sekvence 2) Štěpení restriktázou bodová mutace bez štěpení Příklady aplikací PCR-REA Diferenciace zástupců rodu Mycobacterium 16S-rRNA, mezerník 16S-23S-rRNA Diferenciace některých mykobakterií mezerník 16S-23S rRNA, podle Sansila et al. 1998 Druh Amplikon RE M. tuberculosis komplex 380 - M. avium komplex 380 Haelll, Mspl M. fortuitum 435-480 - M. aurum 490-530 - M. flavescens 460-500 - Využití mezerníku k diferenciaci MAC M. avium M. intracellulars 380bp Hae 155, 115, 65, 40bp 180, 155, 40bp Msp I no digestion 220,105, 50bp Příklad pro 16S rRNA > Dvoukrokový identifikační protokol > Thierry etal. 1990 > PCR produkt o délce 1 300bp > Štěpení Rsa\ a Cfo\ Dvorská et al., Vet. Med. Czech, 2002, 46, 309-328 Výsledky diferenciace pro 16S rRNA Rsa\ Cfo\ Rsa\, Cfo\ M. tuberculosis M. bovis M. intracellulare M. gordonae M. ulcerans Corynebacterium Rhodococcus Gordonia Nocardia M. avium M. ulcerans M. intracellular M. terrae M. bovis M. bovis caprae M. fortuitum complex M. kansasii M. chelonae serotypes Velikosti fragmentů po štěpení Rsa\ Druh Velikost fragmentů M. xenopi 780 355 113 M. ulcerans 600 467 167 M. terrae 391 355 167 167 113 M. parafortuitum 373 355 171 167 113 M. flavescens 421 355 171 167 113 M. fortuitum 421 355 171 167 113 MAC 556 355 167 113 MTBC 617 355 171 167 113 Velikosti fragmentů po štěpení Cfo\ Druh Velikost fragmentů M. terrae 410 337 314 252 M. parafortuitum 408 343 314 252 M. flavescens 408 337 253 225 M. fortuitum 408 253 225 190 145 M. avium 408 337 312 253 M. paratuberculosis 408 337 312 253 M. intracellulare 408 312 253 187 139 M. scrofulaceum 408 309 253 187 150 Na elektroforetickém snímku jsou velikosti restrikčních fragmentů amplikonu ze 16S rRNA po štěpení restriktázou Rsa\ Určete přibližně, z jakého druhu bakterie pocházela DNA L = velikostní standard Délky fragmentů v L = 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900,1000,1200 a 1500 bp Řešení 1,2 = není jasné 3, 6, 7, 8,12 = M. tuberculosis 4 = M. xenopi nedoštěpený 5,10,13,14 = nelze stanovit 9 = M. terrae, M. parafortuitum 11 = M. terrae, M. parafortuitum, nedoštěpený 15 = M. flavescens, M. fortuitum Řešení - jiný zápis 1,2 = není jasné 3 = M. tuberculosis 4 = M. xenopi nedoštěpený 5 = nelze stanovit 6, 7, 8 = M. tuberculosis 9 = M. terme, M. parafortuitum 10 = nelze stanovit 11 = M. terme, M. parafortuitum, nedoštěpený 12 = M. tuberculosis 13,14 = nelze stanovit 15 = M. flave seen s, M. fortuitum Detekce genů rezistence Gen Metoda K čemu katG PCR-REA, RFLP INH resistence u MTBC pncA, oxyR PCR-REA sekvenování PCR-RFLP rezistence k pyrazinamidu tuberculosis x bovis ahpC sekvenování MDR-M7B PCR-REA - závěry Výhody > Jednoduchá, levná a rychlá metoda > Univerzální, vhodná pro široké spektrum organismů Nevýhody > Nutné mít sadu standardních druhů, poddruhů a kmenů > Bodové mutace během PCR > Nízká rozlišovací schopnost elektroforézy Kdo chce vědět víc Dvorská L, Bartoš M., Martin G., Erler W., Pavlík, I. (2001): Strategies for differentiation, identification and typing of medica important species of mycobacteria by molecular methods. Protein fingerprinting > Dvourozměrná proteinová elektroforéza > Nejnověji hmotnostní spektrofotometrie Elektroforéza proteinů - 2D-SDS Izoelektrická fokusace nízké pH vysoké pH - proteiny + proteiny SDS PAGE Příklad 2D elektroforézy E. coli FtsH deficientní kmen produkující a-glukozidázu ■ □ T 2 70 50 40 -30 - 20 - 10 - GlUCPI Dr.jK üio£L _ oiucri HI0I GlUCPI " .ft 0WCP» GlUCPI OmpT GlUCPI ^ ^> N 1 GlUCPI * hVM Cl GlUCPI IbpA 4.5 —r 5 5.5 pH 6 • GlUCPI GlUCPI Jürgen, B. et al.: (2010): Quality control of inclusion bodies in Escherichia coli. Microbial Cell Factories 2010, 9:41 Protein mass fingerprinting Analytická metoda pro identifikaci proteinů vyvinutá v roce 1993 > Protein je nejprve štěpen na menší peptidy > Jejich hmotnost je změřena hmotnostním spektrofotometrem (MALDI-TOF, ESI-TOF) > Následuje porovnání výsledných hmotností s databází hmotností referenčních peptidů Protein mass fingerprinting Proboha jak? Srovnávací vzorek referenčních peptidů lze připravit rovněž in silico ! In sllico příprava referenčních peptidů ATG CAA TAG TTC AAG AAA GAT AGT TAA Translace in silico Met-Leu-Cys-Thr-Asp-GIn-His-lle I Specifické štěpení ^ známou proteázou Met-Leu-Cys-Thr Asp-GIn-His-lle Výpočet molekulové Porovnání se hmotnosti ^ vzorkem Princip MALDI-TOF matrix-assisted laser desorption ionization time-of- flight > varianta hmotnostní spektrofotometr i e > peptidy jsou ionizovány a stanoví se poměr hmoty k náboji na základě doby letu (time-of-flight) k detektoru > vypočte se M a ta je specifická pro každou aminokyselinu Schéma zařízení I Target plate spotted with proteins of interest ? Pulsating light Detection Reflection Sample plate / \ / Výhody a nevýhody 1) Není zapotřebí sekvenovat proteiny 2) Stačí jen znalost molekulové hmotnosti 1) Nelze analyzovat multimerní proteiny 2) Vzorky se izolují z SDS-PAGE Příprava vzorku pro spektrometrií 1) SDS-PAGE 2) Chemická modifikace - odbourání disulfidických můstků, karboxymetylace cysteinů 3) Štěpení proteázami 4) Extrakce peptidů acetonitrilem a vakuové vysušení 5) Rozpuštění ve vodě 6) Purifikace a úprava pro spektrofotometrii Výsledek MALDI-TOF Abs. Int.* 1000 15 10 6 1226.59 35-44 1342.64 570-581 1467.83 "361-372 1371.58 384-396 1149.63 66-75 1311.74 362-372 1055.59 161-168 L y ^1 1262.63 187-198 ■ ■ ■ i.i_ 1639.92 "438-452 1623.77 348-360 Mi 1657.74 1*18-130 1898.98 "170-184 1742.89 170-183 1853.89 1509-524 - 1 ■■ 1910.93 "123-138 2045.12 397-413 2545.19 469490 2593.25 139-160 2487.17 525-545 2402.05 45f* Ji JLi 2674.31 139-161 1500 2000 ~r oj 1250 1750 2250 2500 2750 m/z Protein View | Match Errors | MSMS Fragments | MSMS Analysis | Protein: HUMALBGC NIC': g178343 - human. Intensitji coverage: 62.5 Z (79242 cnts) Sequence coverage MS: I 52.3 % Sequence coverage MS/MS: I 0.0 % pi: 6.0 Peak threshold: MW(kDa): 0.0 0.0 10 20 30 40 50 60 70 80 MKWVTFISLL FLFSSAYSRG VFRRDAHKSE VAHRFKDLGE EHFKALVLIA FAQ YLQQC'P F EDHVKLVNEV TEFÄKTCVAD 90 100 110 120 130 140 150 160 ESAENCDKSL HTLFGDKLCT VATLRETYGE MADCCAKQEP ERNECFLQHK DDHPNLPRLV RPEVDVMCTA FHDNEETFLK 170 180 190 200 210 220 230 240 KYLYEIARRH PYFYAPELLF FAKRYKAAFT ECCQAADKAA CLLPKLDELR DEGKASSAKQ RLKCASLQKF GERAFKAWAV 250 260 27 0 280 290 300 310 320 ARLSQRFPKA EFAEVSKLVT DLTKVHTECC HGDLLECADD RADLAKYICE NQDSISSKLK ECCEKPLLEK SHC1AEVEHD 330 340 350 360 37 0 380 390 400 EMPADLPSLA ADFVESKDVC KHYAEAKDVF LGMFLYEYAR RHP DYS VVLL LRLAKTYETT LEKCCAAADP HECYAKVFDE 410 420 430 440 450 460 47 0 480 FKPLVEEPQH LIKQNCELFE QLGEYKFQHA LLVRYTKKVP QVSTPTLVEV SRHLGKVGSK CCKHPEAKRM PCAEDYLSVV 490 500 510 520 530 540 550 560 LNQLCVLHEK TPVSDRVTKC CTESLVHRRP CFSÄLEVDET YVPKEFNAET FTFHADICTL SEKERQIKKQ TALVELVKHK 57 0 580 590 600 610 PKATKEQLKA VMDDFAAFVE KCCKADDKET CFAEEPTMRI RERK Shrnutí 1) Přehled a funkce enzymů 2) Reštrikční endonukleázy - opakování 3) Reštrikční mapy 4) Detekce polymorfismů v genomech 5) DNA fingerprinty 6) Proteinové fingerprinty