doc. RNDr. Milan Bartoš, Ph.D. bartosm@vfu.cz Přírodovědecká fakulta MU, 2014 Obsah přednášky 1) Způsoby provedení hybridizace 2) Hybridizace v roztoku 3) Příprava značených sond 4) Hybridizace na pevném povrchu 5) Southern ův přenos 6) Fluorescentní in situ hybridizace 7) Příklady využití metod hybridizace v analýze mikroorganismů - RFLP, reverzní hybridizace, spoligotypizace Ď@[o mm: i Mmm Tentokrát se musíte spolehnout na základní literaturu + odkazy na odborné publikace uvedené v přednášce Hybrídizace > reasociace dvou jednořetězcových DNA nebo RNA, pokud mají jejich sekvence úplně nebo částečně komplementární báze i i i i i i i i i i i i I I I I I I I I I I I I I I I I I I ......................... j > nemyslí sejí ale spojování jednořetězců, které byly součástí téže molekuly = renaturace Ľ, m(Bjj(BE na trpnosti NA denaturovat a mnaturovat _5* nebo vysoké ^TTTTtv^ dvojšroubovice DNA denaturace na jednoduché řetězce (po narušení nukleotidových párů) renaturací se obnoví dvojšroubovice DNA (znovu se spojí nukleotidové páry) © Espero Publishing, s.r.o. Co to je denaturace DNA > oddělení komplementárních vláken DNA působením vysoké teploty (90-100°C), extrémních hodnot pH nebo denaturačních činidel (formamid, močovina) > Při denaturaci se zvyšuje absopce světla při vlnové délce 260 nm (tzv. hyperchromní efekt) > Je to důsledek změny v uspořádání bází Co to Jo hyperchromia' efekt > Spojené řetězce snižují absorbanci > Při denaturaci absorbance stoupá o 30-40% > Řetězce drží pevně pohromadě dokud se nedosáhne Tm, pak se duplex rychle rozpadá Temperature. °C http://members.tripod.com/arnold_dion/RecD NA/Fig1-7.gif Co to je renaturěco DNA > opětná tvorba dvou řetězcových struktur z jednořetězcových polynukleotidů za vhodných připojovacích („annealing") podmínek > nastává při pomalém ochlazování (65°C) roztoku teplem denaturované DNA > nenastává při prudkém ochlazení roztoku denaturované DNA > při renaturaci (reasociaci) se mohou tvořit hybridní molekuly DNA/DNA, RNA/RNA i DNA/RNA > rozsah reasociace odpovídá rozsahu komplementarity sekvencí Faktory ovlivňující tvorbu hybridů > teplota > koncentrace solí > stupeň komplementarity > délka fragmentů DNA (a) 3'' r. ONA is denatured by heating (b) G A C T (c) 3" (d) RNA GC AU DNA/RNA hybrid RNA strand DNA strand 5' 3' Renaturation on cooling 5'. Hybridization Nucleic Heid Hybridization Využití hybrlďamcB > test komplementarity sekvencí (ve směsi mnoha molekul DNA budou hybridizovat jen ty, které jsou dostatečně komplementární) > detekce molekul DNA a RNA, které jsou komplementární k jakékoliv izolované nukleové kyselině > vyhledávání sekvencí v genových knihovnách > vyhledávání sekvencí v cytologických preparátech > charakterizace sekvencí > mapování genomu > při polymerázové řetězové reakci 7Vpy hybrídlzací > hybridizace v roztoku > hybridizace na pevném povrchu > hybridizace in situ (FISH) - mapování chromozómů a specifických lokusů > DNA, RNA arrays Hybridizace v roztoku Samotná se téměř nevyužívá, většinou spojená s další detekční technikou > S1 mapování (detekce exonů a intronů hybridu DNA/mRNA) > Denaturační gradientova gelová elektroforéza (DGGE) > Heteroduplexní analýza S1 mapování Význam pro mapování složených genů ^X^SI^clease ^Hi Páry CG drží více pohromadě než páry TA WT 1 Haann«Ml)f>y □« ang'.o -..ť*—> l.ofnoduplo* hotorodupiex heieroduplax homoůiote* 1 nl/wl wt/m cnAn l tnaeaalng denAiiinaiit ( (fVr II tl 1- ll »Co Podobně funguje TGGE Analýza heteroduplexů > Molekuly dsDNA vznikají z řetězců, které pocházejí z různých zdrojů > Výsledné struktury nejsou 100% komplementární, z toho plyne označení heteroduplex > Obsahují smyčky a bubliny v oblastech, kde se sekvence DNA liší > Struktury lze pozorovat mikroskopicky -heteroduplexní mapování Podívejte se na heteroduplexní mapování v základní učebnici Analýza heteroduplexů Heteroduplexy se pohybují pomaleji než homoduplexy ttUd Analýza hetemduplexů Homoduplexy a heteroduplexy lze rozlišit i kapilární elektroforézou Ternperature Modulated Heteroduplex Analysis Widtypfi Muiant Heíeroduptexas HomodLfilBxes umu 5n / / XZ^^ 4 5 5 ReíenSon tims (min) HybrMImcB na pevném povrchu > Probíhá na speciální membráně > Vzorek se nanáší přímo na membránu = tečková hybrid izace (dot blot) > Vzorek se rozdělí na gelu a pak se přenese na membránu = Southernův přenos (Southern blot) > Základem hybridizace je obvykle značená sonda o známé nukleotidové sekvenci Blotting = přenos > Southern blotting (Dr. Edwin Southern) = DNA > Northern blotting = RNA > Western blotting = proteiny > southwesternový přenos - proteiny vázající se na DNA (sondou je DNA) > north wester nový přenos - proteiny vázající se na RNA (sondou je RNA) K čemu se využívá Southemův přenos > Identifikace přítomnosti genu v materiálu vůbec > Identifikace genu za účelem jeho klonování > Využívá se tam, kde je dostupné pouze malé množství vstupního materiálu nebo je vysoké pozadí Příprava hyhridlzačních sond Sondy radioaktivně značené > Nick translace > Vyplnění jednořetězcových konců > Nahodilé značení > Zpravidla se využívá radioaktivní fosfor 32P Sondy fluorescenčně značené > Značení biotinem > Značení digoxigeninem > Značení křenovou peroxidázou > Citlivější, bezpečnější, dnes už používané častěji Nick translation Posun jednořetězcového zlomu DNase I \ pApGpCpTpApCpGpApCpGpCpTpApTpT pTpCpGpApTpGpCpTpGpCpGpApTpApA po/S, ■-Jjr- OH P / \ pApG CpTpApCpGpApCpGpCpTpApTpT........ PTpCpGpApTpGpCpTpGpCpGpApTpApA........ Í1. 5' 3' exonuclease \ E. coli DNA 2. 5' 3' polymerase f polymerase I dATP, dCTP-dGTP.oTTP N.ck t f T T p pApGpCpTpApCpGpApCpGpCpT ApTpT PTpCpGpApTpGpCpTpGpCpGpApTpApA ÍPancreabc DNase I www.ncbi.nlm.nih.gov Zopakujme si: Kíonowův fragment > syntéza ve směru 5 - 3' > exonukleázové odbourávání ve směru 3 - 5' > tam, kde se neodbourává primer > sekvenování, značení DNA 5' 3' &mi koncu nukleovych kys< A) 5 0: □ 3 Polynucleotide kinase □ 3' B) t> AATTCC GC f> AATTCC TTAAGC ii 5' AATTCC Selected DNA I Digest with restriction nuclease to give 5' overhangs (e.g. EcoRI) □ G 3' □ CTTAA 5' 1 Klenow DNA polymerase dATP-v dTTP tt □ GAATT 3' □ CTTAA 5 Restriction nuclease cleavage at internal site to give different sized fragments □ GAATT TTAAGI-= * • Purify D CTTAA Purify Key: T Labeled nucleotide www.ncbi.nlm.nih.gov 4]art * „random primer DNA labeling" = prostřednictvím náhodných hexanukleotidů 3' 3' 5 I Denature and anneal in presence of mixture of random hexanucleotides 3' 3' 5* 3 5 \ Klenow subunit of DNA polymerase + dATR dCTP -+ dGTP. dTTP 3 <} 1 i i 1 1 TM7 5 Ke7 ll t Labeled nucleotide www.ncbi.nlm.nih.gov Lze využít všech tří základních postupů > Nick translace > Vyplnění jednořetězcových konců > Nahodilé značení biotin-dUTP 11111111111 ........... 11111111111 ........... značeni detekce avidinem s fluorescenční značkou <- hybridizace 11111111111 ........... ........... 11111111111 ........... ........... Přímé a neprime znacem sond Přímé značení koncové značení 3'- koncové značení rrr\ TV/7 Pm nepřim^ mí sond Nepřímé značení Reportérova molekula V 4 digoxigenin Značení enzymem v 4 HRP Nepřímé značení- po fy RNA sond i V 4 ..................... Cílová sekvence Příprava sond pro diferenciací kmenů M„ a. paratubereulosIs Celkem 3 sondy detekující části inzerční sekvence \S900-inzerční sekvence specifické pro M. a. paratuberculosis l Psřl-1045bp \S900 Celková sonda - 958bp Sonda 1 -412b Sonda 2 - 303b Základní kroky pH príprave sond > Amplifikace specifických fragmentů PCR > Purifikace amplikonu > Značení sond peroxidázou > Kontrola koncentrace sondy Mmmm sondy (n<š$ m iffipiij dsDNA povaření a ochlazení denaturovaná DNA negativně nabitá komplexy peroxidázy pozitivně nabité peroxidáza se váže k DNA špatně glutaraldehyd peroxidáza se váže k DNA kovalentně Detekce peroxidázou značené sondy matricová DNA značená sonda H202 detekční reagencie 1 o 02" + H20 zesilovač o luminol detekční reagencie 2 NH2 IH2 + světlo o o Postup při Southernově přenosu 1. rozdělení fragmentů DNA daného vzorku gelovou elektroforézou 2. denaturace DNA a přenos jednořetězcových fragmentů DNA na nylonový filtr („blotting") 3. inkubace filtru se značenou jed n o řetězcovou sondou: hybridizace sondy s komplementární sekvencí imobilizovanou filtru 4. odmytí nenavázané sondy 5. detekce navázané sondy - vizualizace hybridů Sómatem fragmenty DNA na elfo gelu filtrační papír r denaturace NaOH membrána přenos DNA z gelu na membránu otisk DNA na membráně inkubace se značenou cDNA vyvolání RTG filmu stoh papírových ručníků (AI neznačen* DNA rozštěpená restnkr.ni nukleázou (C) nitrocelulosová membrána gel odstránení mtrocelulosoveho papíru s pevni navázanou DNA značené DNA různé velikosti slouží jako standardy agarosovy gel FRAGMENTY DNA JSOU ODDĚLENY ElEKTROFOREZOU NA AGAROSOVEM GELU mycí houba alkalický roztok ODDELENÉ FRAGMENTY DNA
kapilární přenos > elektroforetický přenos > vakuový přenos FiuQľescentní in situ hybrídlzace fluorescence in situ hybridization (FISH) Metoda sestává ze tří základních kroků > Fixace vzorku na mikroskopickém sklíčku > Hybridizace značené sondy k homologickým fragmentům na genomové DNA > Enzymatická detekce hybridů sonda-cílová sekvence > Sondy radioaktivně značené > Sondy fluorescenční: rychlejší, silnější signál, simultánní diferenciace různých cílů Ukázky FISH fluorescence in situ hybridization FISH v mikrobiologii > Umožňuje detekci i nerostoucích bakterií > Sonda je druhově specifická a míří zpravidla ke genu pro 16S rRNA > Metoda je vhodná pro fylogenetické, ekologické, diagnostické a environmentálni studie > Kombinuje preciznost molekulární biologie s mikroskopickým pozorováním > Je možno pozorovat výskyt bakterií v kontextu s morfologickou charakteristikou napadené tkáně > Citlivost až jediná bakterie, metodicky mimo PCR Typický FISH protokol 4 základní kroky 1) Fixace a permeabilizace vzorku 2) Hybridizace 3) Promývací kroky -odmytí nenavázané sondy 4) Detekce značených buněk mikroskopicky nebo průtokovou cytometrií i i Charakteristika sond Dlouhé 15 až 30 nukleotidů Fluorofor Barva Excitace Emise Alexa 488 zelená 493 517 Cy3 červená 552 565 Cy5 červená 649 670 DAPI modrá 350 456 m^——————————————————————m Fluorescein zelená 494 523 Rodamin červená 555 580 TAM R A červená 543 575 Texas red červená 590 615 Zodpovězte otázku Jak dlouhá musí být minimálně sonda, aby našla jedinou specifickou sekvenci v bakterii, jejíž genom má velikost 4,0 x 106 bp? 4,0 x 106 = 4X ln(4,0x106) = Xln(4) X = ln(4,0x106)/ln(4) X = 11 Dv6 hlavnf oblasti vyuillitf FISH v mlkmbiologii > Analyza vzorku potravin > Studium biofilmu Qmm fluorescing cete • e :.. • jc=i: :e = Reo fluorescing cells Mixed Positive {£. cob) (K. pneumoniae) (P. aeruginosa) Varianty FISH ACM-FISH ■ e-FISH ■ QD-FISH i armFISH ■ Fiber-FISH ■ Rainbow-FISH CARD-FISH ■ Flow-FISH ■ Raman-FISH catFISH ■ Fusion-Signal ■ ReD-FISH CB-FISH FISH ■ Reverse-FISH CO-FISH ■ Halo-FISH ■ RING-FISH COBRA-FISH ■ Harlequin-FISH ■ RNA-FISH COD-FISH ■ Immuno-FISH ■ RxFISH COMBO-FISH ■ LNA-FISH ■ Split-Signal FISH Comet-FISH ■ M-FISH ■ T-FISH Cryo-FISH ■ ML-FISH ■ 3-D FISH D-FISH ■ PCC-FISH ■ Zoo-FISH DBD-FISH ■ PNA-FISH ■ Q-FISH BioTechniques 45:385-409 (October 2008) Balsi ctenf Bottari B (2006): Application of FISH technology for microbiological analysis: current state and prospects. Appl Microbiol Biotechnol (2006) 73:485-494 http://www.nottingham.ac.Uk/biosciences/divisions/food/r esearch/projects/foodmicrobiology.aspx http://www.rapidmicrobiology.eom/news/1431h22.php Vyhrané aplikace hybrtdlzačních technik v mikrobiologii > Polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP) > Ribotypizace > Metoda reverzní hybridizace > Metoda spoligotypizace > Reštrikční fragmenty rozdělené na gelové elektroforéze > Detekce vybraných polymorfních úseků značenou sondou > Rozdíly ve spektru jsou dány ztrátou nebo získáním restrikčního místa, delecí nebo inzercí > Jsou možné i změny v počtu repetitivních sekvencí nebo translokace > Sondy z náhodně vybraných sekvencí > Sondy ze specifických esenciálních genů nebo genů pro faktory virulence > Sondy z IS, transpozonů a repetitivních sekvencí > Sondy z genů pro rRNA Porovnání BS^Mmfórézy a hybirMlzace i DNA obarvená autoradiogram ethidium bromidem Naznačení anaíýzy RFLP pi Analýza změn ve fragmentu 400 bp + RE - RE + 50 - 50 Velikosti 400 250 600 450 350 fragmentů 150 600 500 400 ■:::::.] ;:::::.] •::::::] :::::::: 250 200 i-1 i-1 :::::::] i i i-1 150 100 ^m 75 ^m Počet změn 0 3 3 2 2 VyuĚĚí RFLP v epidemiologa původců mykobakteriôz > Epidemiologie paratuberkulózy, \S900 > Epidemiologie aviární tuberkulózy > Analýza kmenů MAC v rámci jednoho chovu > Analýza kmenů MAA \S901 u jedince > Analýza smíšených infekcí kmenů MAC InzBräni sekvence u vybranych mykobakterif M. avium subsp. avium serotypy 1-3, M. avium subsp. silvaticum \S901 IS 1245 M. avium subsp. hominissuis serotypy 4-6, 8-11 a 21 IS 1245 FR300bp M. avium subsp. paratuberculosis IS 900 M. intracellulare serotypy 7,12-20, 22-28 > Důsledkem transpozice jsou různé RFLP profily Pro studium epidemiologie MAA je vhodná \S901 Pro MAP potom \S900 RFLP profily na bázi IS901 - MÄÄ Pviň\ - \S901 RFLP profily > 25 vícekopiových profilů > 3 profily o malém počtu kopií > celkem 28 RFLP typů Psfl - \S901 RFLP profily ^-- > 4 vícekopiové profily > 1 profil o malém počtu kopií > celkem 25 RFLP typů Pvull - IS901 RFLP pr 1 ^PNABCDEFG J K L M O P Q 10.0 8.0 7.0 6.0 4.0 3.0 ► ► ► ► ► — ►_►_►_►_>_^ E—t__ ► ► X x ► ► 2.0 ► ► ► ► ► ► X-X- E£-*= =X-\ ► ► PvüH - IS901 RFLP profily - 2 kbPNRSTUVWX ZAAAB 10.0 8.0 7.0 e.o ►— ►— ►■ ► 4.0 3.0 ►— ► ► ► ► 2.0 —► —► ► ► ► — ► = === = = = =1 Vyhrané Pstí - IS901 RFLP pmffUBf PvuW fay profilů Psti 20 40 60 80 100 nil. .. ii. I I II I I 12 U LI A11 A3 I A11 A12 II A7 A1S A14 AS 62 B1 CI D1 C2 CI A1C A1 A2 AS AS A4 AS A1S V obou případech 2 clustery Půw@d Gmlkmsn 137 Izoiátů RFLP typy získané u ptáků, zvířat a Udí kbp M B C D E F G 10.0-► 8.0-► 7.0-► 6.0-► 4.0-► 3.0-► — — — —► > ► 2.0-► — ► — — —► ► H I ►— ►— ► ► ► ► ►— LMOPQTUZAAAB ►— ►— ►— ► —► ► ► ► —► ► Specifické profily u izolátů od lidí Dvorská, L. - Bull, T.J. - Bartoš, M. -Mátlová, L. - Švástová, P. - Weston, T.R. -Parmová, I. - Van Soolingen, D. - Pavlík, I.: A standardised Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) method for typing Mycobacterium avium strains links \S901 with virulence for birds. Journal of Microbiological Methods; 2003, 55, 11-27 AnmWfm klmmMho pffpadu m Serotyp PZA INH RFP ETA STM CIPRINOL KLACID AMIKACIN Mesic Rok 6 6/9 9 9 6/9 9 9 XI. XII. II. III. IV. V. VI. VII. VIII IX. /A (31 ekundárnfch kultur 90 100 C Ulil mih 1 II II 1 II II II I I i i i i I I in n i 1 II II 1 i i in lllll mu 1 II II lllll lllll II I I II i i i i I lllll 1 II I I I II III 1 l i II lllll III I I 1 1 1 1 1 1 l 1 1 1 II 1 II I II III 1 1 l i 1 1 II 1 I 1 1 II III 1 1 l 1 1 1 II 1 1 II III 1 l l 1 1 1 II 1 II I II i i II 1 1 l i 1 1 II II I II i 1 II 1 1 i I 1 1 II II 1 1 II 1 1 1 1 1 l l 1 1 III 1 1 II l l l 1 1 i 1 1 i 1 1 III 1 1 II 1 II 1 II 1 1 II lili III l 1 1 II11 1 II 1 l lili lil l 1 1 1 II1 1 1 I 1 1 III III 1 1 l 1 1 1 III 1 1 i 1 1 II 1 1 1 1 1 1 III 11 II 1 1 1 Mil 1 1 l l 1 1 1 II 1 11 1 1 1 II 111 II 1 1 l l 1 1 1 II 1 II 1 II 1 1 II ii 1 l III II 1 1 II 1 1 III II 1 i III 1 B2 A3 X1 A1 B4 D2 X2 D3 D4 D7 X3 C4 A4 A5 D5 C1 D8 A2 C2 C3 Pracovní hypotézy 1) Opakovaná infekce z vnějšího zdroje 2) Dočasné utlumení infekce a její reaktivace 3) Selekce rezistentních kmenů antituberkulotiky Studium přenosu MAA mezi růmfmi farmami Farma C 1 x D Ke studiu epidemiologie M. a. paratuberculosis se používá IS900 BstEU - \S900 RFLP profily > 33 vícekopiových profilů > 3 profily s nízkým počtem kopií > celkem 35 vícekopiových profilů Ps/I - \S900 RFLP profily s-- > 24 vícekopiových profilů > 1 profil s nízkým počtem kopií > celkem 25 RFLP typů BstEll - IS900 RFLP profily III Pst! ■ ľ Paratuberkulózě u divokých pfožvýksvců v ČR (1995-2000) • B-C1 Pavlik et al.. Veterinary Microbioloev. 2000. 231-251 Paratuherkulóža u fammně chovaných Jelenů ©(§č(§fce tří kmenů růmf©h RFLP typů u Jedné krávy V letech1995 až 2001 V roce 2002 C1 C9 C23 Porovninf vy^Mf^h RH :LP pmMlii Colony number Kbp 2 4 5 7 8 10 12 13 14 16 18 1.6 -> C23 C9C9C9 C9C9C1 C5C9 C1C9C1 C23 C9 C1 C5 Pro studium epidemiologie M. tuberculosis se používá \S6110 log bp T-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 St d M Abc M. bovis M.caprae Proč to celé neosekvenujete a hotovo! Není tato metoda dnes poněkud Sekvenování je příliš citlivá metoda a nesnadno odhaluje klonalitu RIbotypizac Varianta RFLP využívající sond připravených z genů pro 16S rRNA nebo 23S rRNA > Sekvence genu pro 16S rRNA se používají k fylogenetickým studiím > Počet kopií genu pro 16S rRNA je malý, do 6 ks > Výsledná spektra jsou jednoduchá > Popsáno u Listeria (80 spekter), Salmonella (97), Escherichia (65) a Staphylococcus (252) Kde se v buňce nachází 16S rRNA? A kde se nachází 23S rRNA? serotype ribotype pattern ribotype 0) O o Qc < CO .52 c 0 c 1 O CO O ■g O 12 10 9,11 8 7 5 4 2 III I I I I II I I II 1, 3, 6 | II II CO O CNJ cvi H/ndlll/9 H/ndlll/8 H/ndlll/7 H/nd Ml/6 H/nd Ml/5 Him ni/4 H/nd IN/3 MM HI/2 Him HI/1 Q) O o < (D Q) -5 0 S Q) 1 •S a o CO -Q O serotype 5 3,4,6,12 2,7 1,8,9,10,11 CM O) 00 h-CO IO *t CO CM CO m CM (o (d ■ ribotype patem MIM III I 1 1 11 I II 1 II II 1 1 Iff 1 • • II II 1 • II II 1 t II II • • II 11 1 • II 1 • • MM • « 1« 1 • • mmm i 1 • ft 1 • t j? «i n t t CO o CM* CM ribotype Cŕol/4 Cfol/3 CfcM2 cfdiň Úkol Analýzou výše uvedených spekter ribotypů stanovte počet genů pro 16S rRNA u Actinobacillus pleuropneumoniae, jestl iže ani HincňW ani Cfo\ neštěpí uvnitř genu. Ze spekter po štěpení Cfo\ vyplývá, že je zde 6 kopií genu pro 16S rRNA. Spektra po štěpení HincňW nejsou čistá. A ještě Jeden, komplikovanější úkol Analyzujte následující spektrum a odhadněte, co se mohlo stát 1) Porovnejte vzorek č. 1 a 2 2) Najděte další podobné události 3) Co je méně pravděpodobné? M12345678 9 1011 12 23.1i 9.4 6.6 4.4 Ifgrrrr Řešení? Toto jsou možná vysvětlení, zájemci mohou i vypočítat délky změněných úseků M12345678 9 1011 12 1) U vzorku č. 2 došlo k deleci 2311 (nebo u vzorku č. 1 k inzerci) úseku DNA 9.4 6.6 4.4 2a) Podobné mohlo nastat illllll- • mezi vzorky 3-8 (3-1, apod.) zzz zzzzzzz -2 události! 23-™ Ski/? 2.0 2b) Další možnost 4-7 2c) A ještě jedna možnost 5-6 3) Dvě události versus jedna jsou méně pravděpodobné Odhadněte evoluci ribotypů Což třeba takhle * Cfol/4 (serotyp 5) t Cfol/3 (serotyp 3,4,6 a12) í io w cn w od Vi % S i© o) o -* 1* «3 O N> TJ [=1 — O" - I — — "O 8 o O O O O ^ % > » » o o. o o o ^ 5 nJ w ^ 12 Cfol/2 (serotyp 2,7) t Cfol/1 (serotyp 1,8,9,10 a 11) A podobně pro spektrum Ha Analyzujte následující spektrum a odhadněte, co se mohlo stát M 12 34 5 67 89 10 11 12 1) Porovnejte vzorek č. 4 a 8 2) Porovnejte vzorek č. 4 a 5 3) Co se stalo u č. 2? 23.1 ■ 9.4 H 6.6 I 4.4 — 1541 Řešení? Toto jsou možná vysvětlení, zájemci mohou vypočítat délky změněných úseků 1) U vzorku č. 4 došlo k deleci (nebo u vzorku č. 8 k inzerci) úseku DNA 2a) U vzorku č. 5 se ztratilo jedno reštrikční místo oproti č. 4 (nebo opačně) 2b) Přibyl/ubyl počet kopií 3) ??? M 12 34 5 67 89 10 11 12 23.1 ■ 9.4 ■ 6.6 8 4.4 — 32!::li,íiii 2.3 2.0 ® 1541 Metods reverzní hybridlma > „Sonda" je nanesena na pevný povrch > Cílová sekvence je v tekuté fázi, zpravidla ve formě amplikonu po PCR + cílové DNA sekvence -> sondy ABC > Izolace DNA ze vzorku > Amplifikace cílové sekvence (PCR) > Detekce značeného produktu na matrici Izolace DNA PCR Detekce Výsledky za (30 minut) (2 hodiny) (10 minut) 3 hodiny tekění systémy pro myk©bmkteťm «- Conjugate Control (CC) --Amplification Control (AC) ---M. awum M. intracellular M. kansasii M. malmoense M. tuberculosis complex http://www.hain-lifescience.de Mm my pro mykob^Meri 1 Cotvuaeie Conlrei 2 Uimnal Control 3 Genut Control * • t j T I I IC II 12 13 II IB 14 17. Specific probes 11 Species may possibly be further o>Henf Muted with iMr CerieType Mycobacterium AS 21 For further differentiation „-.<■■ lha GeneType 31 For further diHertntutwn use the Genotype MTBC http://www.hain-lifescience.de Dmtmkcmsystémy pro Mykobakterie Iii CC uc: oc: ě / 1 CC IC«njug«te Comroll t UC IUruv«n*l Contioll I OC IGenus Conlrnll --10 Sptcilic profrrt / 0 V http://www.hain-lifescience.de tupcd MY komptex ............ .......—......... ............... ............ ...... ........... ................ • a •••■•*■■■ ■••■■■•>■ J* Conjugate Control Universal Control MTBC Specific gene probes (or the differentiation of the Mycobacterium tuberculosis complex http://www.hain-lifescience.de ., ,_________„ lili Itllttl, I iftftttttflf] lil! »IUI Hl líniu l m III llllllll I I I II I III lllllllll I III CM III UHNITI" I ľ III"' I ♦ 1 « III lllllllll ir ni iíf Itlitiitltitt IBitJI! I HI ill fill HU P Delší systémy > M u Iti rezistentní kmeny Staphylococcus aureus > Detekce Helicobacter pylori + rezistence > Detekce Chlamydia trachomatis > Detekce Bordetella pertussis a R parapertussis > Clostridium dificille - diferennciace mezi nepatogenními, virulentními a hypervirulentními kmeny > Detekce desítek grampozitivních a gramnegativních druhů > Geny pro Shiga toxin > Vankomycin rezistentní enterokoky > Detekce periodontopatogenních bakterií http://www.hain-lifescience.de zace Mezerníky dlouhé 35-41 bp PCR primery 43 specifických oligonukleotidových sond vázaných na membránu Membrána pro s 1) Membrána se 43 specifickými sondami 2) Hybridizuje se s produktem PCR 3) Vyhodnotí se výsledky M. tuberculosis H37Rv M.africanur i IIIIIIIIIIIIIIIIII iiiiii llllllllllll I'll L J L j L . IIIIIII lili M. tuberculosis Beijing genotype n ri n ...... M. bovis BQG M. bovis M. bovis subsp. caprae II II I I M. bovis subsp. caprae M. tuberculosis seal genotype r' i i M. microti type vole M. microti type llama ■i i-i i-i i-i ri ......... i i"i 11 i lllll lllll 1111 l"l l"l l"l l"l ........ iiii l-l I-I l-l I-I ........ iiiiii llllll l"l l"l l"l l"l l"l l"l l"l l"l l"l l"l I" I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 1111 lllllllllllllllll lllllllllll lllllllllll 1I1IIIIIII 1111 r i i-i i i i iiiiiililiiiiiii l"l l"l l"l l"l I- ......... I l-l l-l l-l l-l l-l ........... iii i-i i-i i-1 i-1 i-1 i"i I I I I 1 I I 11 I I I I I I I ii ProMy zästupcu komplexu M. tuberculosa M. tuberculosis H37Rv M.africanum M. tuberculosis Manila genotype M. tuberculosis Beijing genotype M. bovis BCG M. bovis M. bovis M. bovis subsp. caprae M. bovis subsp. caprae M. bovis subsp. caprae M. tuberculosis seal genotype M. microti type vole M. microti type llama M. canetti IIIIII I I III! ■ Ill II I II II ný záznam spolígofypizac u í* u (t u " «► <■< tt > >t Jr k •••a »•• • • ** »mm«*• ••••••• ••••• •• • • •• •••••••••• •••••• ClJJiftti HTHja H\i ...... C|} ■■■••t •••••••• ••• • •••••• í* • •••••••••••••• • • f ••• • ••t • :»::::: i * 0 Pavlik et al., Vet. Med. Czech, 2002, 47,181-194 90 5930 Proř% izoláiů M. bovis e fet 1965-2002 1965 1966 1974 1989 1991 19921994 199E 1997 1999 2002 li min iiumí ľTTTTTTTTTTTTl □ □ □ □ □ t III.....t" ItMlIIIIHMMIIIIill □ h nm mi.....Hiimiii mím □ h i in i im it iitntMiiniiiiin Typový kmen n n n i r □ H Ulil tlil.....ľlllllllH I □ MMHHfM tttlMtHI □ □ □ □ Nejbeznejsi typ Jedinečný typ M. bovis caprae Spoligotypy izolátů M. boms u zwamů = Chomutov = (jelen-1991) i Praha = (deer-1999) 1 (velbloud-2002) ii 11 Praha-východ ||(dobytek-1991) s7 M. bovis caprae ZDAR n. S (dobytek-1995) Znojmo |(dobytek-1994) Pavlík et al., Vet. Med. Czech, 2002,181-194. Zlín (kapybara 1989 Levica (dobytek-1992) W^hodnoťt Proveďte analýzu spoligotypů podle předložené učební pomůcky 1) Způsoby provedení hybridizace 2) Hybridizace v roztoku 3) Příprava značených sond 4) Hybridizace na pevném povrchu 5) Southern ův přenos 6) Fluorescentní in situ hybridizace 7) Příklady využití metod hybridizace v analýze mikroorganismů - RFLP, reverzní hybridizace, spoligotypizace