a mpfíes z*^riJ^e^pflr jIebuďu bkvict senové iM^ypovRf!
Příprava rekombinantních molekul pro diagnostické
účely
doc. RNDr. Milan Bartoš, Ph.D.
bartosm@vfu.cz
Přírodovědecká fakulta MU, 2014
Obsah přednášky
1) Pojem rekombinantní DNA
2) Historické milníky
3) Proč je klonování genů důležité i v mikrobiologii?
4) Jak se klonování genů provádí
5) Metody detekce klonovaných genů
6) Dot blot a Southern blot
7) Identifikace na úrovni translace
Doporučená literatura
Brown (2010): Gene Cloning & DNA Analysis. Wiley-Blackwell, Sixth edition
GENE CLONING
& DNA ANALYSIS
K procvičování nachystat tabulku genetického kódu
Co je to rekombinantní DNA ?
Rekombinantní DNA je DNA sekvence připravená v laboratoři a obsahující části z
různých zdrojů
Rekombinantní DNA se zpravidla nevyskytuje u
organismů přirozeně
Rekombinantní DNA se využívá v mnoha
aplikacích
Proč vůbec můžou existovat rekombinantní DNA ?
1) Všechny organismy mají společný původ
2) Genetický kód je univerzální napříč živými systémy
3) Transkripční a translační aparáty jsou podobné
Proto můžeme jednotlivé části DNA mezi
sebou zaměňovat
Několik historických milníků I
1865 - J.G. Mendel
> pravidla vysvětlující dědičnost
1900 - DeVries, Correns a Tschermak
> objevili nezávisle a formulovali Mendelovy zákony dědičnosti
1910 - Thomas Hunt Morgan
> geny jsou umístěny na chromozómech -Drosophilla melanogaster
Několik historických milníků II
1922- Morgan a kol.
> technika mapování genů - pozice 2 000 genů na 4 chromozómech Drosophilla melanogaster
1944 - Avery, MacLeod, MacCarty
> genetickým materiálem je DNA
1953-Watson a Crick
> popsali strukturu DNA a vysvětlili její základní biologické funkce
1966 - Nirenberg, Khorana, Ochoa
> popsali genetický kód
Několik historických milníků III
1971-1973
> Vznikají metodiky rekombinantní technologie 1973
> V bakteriálních buňkách byl nakloňován první živočišný gen z DNA žáby Xenopus laevis
1977
> Byl nakloňován gen pro první lidský protein do bakterií - rekombinantní inzulín, na trhu v roce 1982
Několik historických milníků IV
1996
> byl sekvenován kompletní genom Saccharomyces cerevisiae
> byla sekvenována první archaebakterie Metanococcus jannaschi
1997
> byl sekvenován kompletní genom Escherichia coli (4,6x106 bp, 4 000 genů)
2010
> byl vytvořen první syntetický organismus
Vytvoření umělého života
Synteticky a genovým inženýrstvím připraven genom Mycoplasma genitalium
> kolem 600 000 nukleotidů
> 517 genů
> podpisy
(http://www.osel.cz/index.php?obsah=6&clanek=3244)
Základní aplikace rekombinantní DNA
1) Identifikace genů
2) Sledování funkce genů
3) Studium regulace genové exprese
Rekombinantní DNA vzniká
klonováním
1) DNA fragment je vložen do vektoru
2) Vektor s fragmentem (rekombinantní DNA) je transformován do hostitele
3) V hostiteli se rekombinantní DNA namnoží
4) Pokud se hostitel rozmnožuje, množí se i rekombinantní DNA
5) Po celé řadě množení vzniká klon
1) Každá buňka klonu obsahuje jednu nebo více kopií rekombinantní molekuly
2) Gen nesený rekombinantní ^ molekulou je tzv. klonovaný
Základní schéma klonování
|F "WES' WMT To ft^ CtcNlN6 ßgSf THEY SHcUp AT _ LEAST fVT IT To A VCTF? 0*)T
~~~ f«J THINKf-
Co ye potřeba pro klonování genů
> vlastní gen - fragment DNA
> vektor - plasmid, fág, kosmid
> hostitel - příjemce rekombinantní DNA
> inzert = gen začleněný do vektoru
> rekombinantní DNA = vektor s inzertem
Důsledek klonování genů
transformace
Permanentní dědičná změna v genetickém materiálu buňky způsobená přijetím a začleněním cizí genetické informace
> schopnost replikace
> schopnost exprese
Zdroje cizí genetické informace
živočišný rostlinný mikrobiální syntetický
Jak začít klonovat?
Izolovat DNA v nativním stavu
Nakloňovat do vektoru
Proč je to klonování tak důležité?
Umožňuje získat čistý vzorek jednotlivého genu prostého genů
jiných
Jak klonováním získat jediný gen
vektory
°o°
tvorba rekombinantních molekul
DNA fragmenty
každá nese jiný fragment
transformace do bakterií
Jak klonováním získat jediný gen
Vysetí na selektivní médium
0 o o
1 ^ ^
Každá kolonie (klon) obsahuje jen jednu molekulu rekombinantní DNA
A co dál?
Nejduležitější je identifikovat specifický klon mezi
spoustou dalších
řrpD
řrpE
pyrF dnaL
trpC
cysB
řrpA
^řrpB
opp
tonB
aroT
gen určený ke klonován
řrpD
řrpE
řrpC
dnaL
řrpA
řrpB
pyň=
cysB
tonB
aroT
Jak selektovat nebo identifikovat jen jediný klon?
Jak identifikovat ten správný klon
Přímá selekce
> Provést klonování tak, aby vznikly jen klony nesoucí požadovaný gen
Nepřímá selekce z genové knihovny
> Nejprve vytvořit kolekci všech možných genů (genovou knihovnu)
> Analyzovat genovou knihovnu a vybrat ten správný gen
Porovnání přímé a nepřímé selekce
Přímá selekce
O O O
*
X
Nepřímá selekce
Knihovna klonů
Klon s hledaným genem
Přímá selekce - geny rezistence
Gen pro rezistenci ke kanamycinu z plasmidu
kanR
EcoR I
\
Plasmid pBR322, E. coli
O O O
X
X
Médium s kanamycinem
Přímá selekce - jiné geny
Gen řrpA pro tryptofan syntázu z E. coli
Plasmid pBR322
Minimální médium
Omezení a využití auxotrofie
Omezení
> Musí existovat mutantní kmeny pro hledané geny
> Musí být dostupné médium pro přežití wt kmenů
Využití
> Pro geny kódující enzymy biosyntetických drah
> Metoda není omezena na E. coli nebo bakterie
> Auxotrofní kvasinky nebo vláknité houby
> Auxotrofní kmeny E. coli využitelné i pro geny jiných organismů
Identifikace nepřímá
Genová knihovna
> Kolekce klonů o dostatečném počtu entit, která obsahuje teoreticky všechny geny daného organismu
Kolik klonu je třeba?
In (1-p)
N =--------------------
In (1-a/b)
N = počet potřebných klonů, p = pravděpodobnost, že je přítomen kterýkoliv z genů, a = průměrná velikost klonovaných fragmentů, b = celková velikost genomu
Vypočítejte
Počty klonů potřebných pro následující organismy
Počet klonů
E. coli
S. cerevisiae Drosophila Člověk
Velikost genomu, bp
4,6 x 106
1,8 x 107
1,2 x 108
3.0 x 109
Fragmenty 17kbp
21 500 564 000
Fragmenty 35 kbp
10 000 274 000
Vypočítejte
Počty klonů potřebných pro následující organismy
Počet klonů
E. coli
S. cerevisiae Drosophila Člověk
Velikost genomu, bp
4,6 x 106
1,8 x 107
1,2 x 108
3.0 x 109
Fragmenty 17kbp
820
3 225
21 500 564 000
Fragmenty 35 kbp
410
1 500
10 000 274 000
Příprava genové knihovny
Příprava knihovny cDNA
Je to knihovna transkriptů mRNA
> Celková mRNA je přepsána zpětnou transkriptázou do cDNA
mRNA X zpětná transkriptáza
jednořetězcová DNA
_▼   DNA polymeráza
cDNA
> Vzniklé cDNAjsou klonovány stejně jako genomová dsDNA
Klonovat jen do kosmidů?
Další typy vektorů
> Plasmidy
> Bakteriofágy
> Kosmidy
> Umělé chromozómy
Jak získat cDNA z m RNA - /
cDNA
Jak získat cDNA z m RNA - //
hexanukleotidy
Purifikaci genu zajistí i PCR
trpE
trp® trpc
py*	dnaL
mm	
opp	
cysB frpA
arOT   gen určený ke klonováni
írpA        (rPA několik miliard
specifického produktu
írpA_ frpA
írPA írpA
/ gen získaný PC R je třeba klonovat
> Pokud chceme sledovat jeho projev v buňce
> Pokud chceme prozkoumat mechanismy regulace exprese genu
Techniky klonování PCR ^  produktů jsou dnes běžné
Klonování produktů PCR - /
1) reštrikční štěpení
t
Klonování produktů PCR - //
2) připojení restrikčních míst a reštrikční štěpení
GCNNNGAATTCTACGTCCATC				
	ATGCAGGTAG	GCTAGTGTCA		
			CG ATC AC AGTCTTAAG NNNCG	
I
amplifikace
reštrikční štěpení
Klonování produktů PCR -
3) TA-klonování
Klonování produktů PCR - IV
3) TOPO-klonování
		A AGGG I
[Ä		[ľ TCCC 1
Proč tedy klonování?
PCR má alespoň dvě omezení
> Musíme znát sekvenci genu, nelze tedy efektivně získat geny neznámé
> Řada genů je delších než je procesivita Taq
> do 5 kbp relativně snadno
> do 40 kbp použitím specifických postupů
polymeráz
r
Jak dlouhé DNA fragmenty lze amplifikovat?
Domácí úkol
Nalezněte příklady bakteriálních genů dlouhých
a) do 5 kbp
b) do 40 kbp
c) delších než 40 kbp
Zkuste totéž pro kvasinky
Kdo najde nejdelší mikrobiální gen?
Nezapomeňte, že složené geny mají introny!
Ještě dvě otázky
Lze obejít to, že neznáme přesnou sekvenci nového genu?
Můžeme se pokusit využít známou sekvenci téhož genu u příbuzného organismu
Lze obejít délku gen
999
Metody identifikace klonů
Identifikace na bázi nukleových kyselin
> Hybridizace kolonií a plak- dot blot hybridizace
> Southern blotting
Identifikace na úrovni translace
> Využití protilátek
Hybridizace kolonií
nylonová membrána
otisk kolonií na membránu ^
lyže, denaturace, fixace
z
z
o ° °
bakteriální kolonie (genomová banka)
otisk chromozómové DNA
denaturovaná značená cDNA
M
identifikace kolonie
expozice
inkubace přes noc, hybridizace
Jak připravit sondu
Sondy radioaktivně značené
> Nick translace
> Vyplnění jednořetězcových konců
> Nahodilé značení
> Zpravidla se využívá radioaktivní fosfor 32P
Sondy fluorescenčně značené
> Značení biotinem
> Značení digoxigeninem
> Značení křenovou peroxidázou
> Citlivější, bezpečnější, dnes už používané častěji
Zopakujte si metody radioaktivního i neradioaktivního značení z přednášky o hybridizaci
Některé aspekty práce s genomovou knihovnou
> Selekce nejlepší sondy
> Příprava sondy s využitím produktu translace
> Identifikace příbuzných genů
Selekce nejlepší sondy I
Některé sondy hybridizují lépe, některé méně
Knihovna klonů
sonda A ->
sonda B
1) Nespecifická hybridizace?
2) Více kopií genu?
Selekce nej lepší sondy II
Knihovna klonů
Silná
zřetelná
hybridizace
Příprava sondy s využitím produktu translace
> Pokud známe sekvenci aminokyselin můžeme využít tabulku genetického kódu a stanovit kodóny
AUG = Met GUU = Val
> Jenže genetický kód je degenerovaný!
Které kodóny můžeme ze sekvence
aminokyselin stanovit naprosto
přesně?
Metionin = AUG Tryptofan = UGG
Všechny ostatní aminokyseliny jsou kódovány alespoň dvěma kodóny
U kodónových rodin můžeme spolehlivě určit 2 ze Z nukleotidů v kodónu
Návrh sondy pro cytochrom c
.. .-Asn-Val-Leu-Trp-Asp-Glu-Asn-Asn-Met-Ser-Glu-Tyr-...
Pomocí tabulky genetického kódu stanovte sekvenci nukleotidů v potenciální sondě
TGG-GA(T/C)-GA(A/G)-AA(T/C)-AA(T/C)-ATG
Identifikace klonu s genem pro
cytochrom c
Syntetické oligonukleotidy Knihovna klonů
Identifikace příbuzných genů
Vyhledávání sondou mezidruhovou
Knihovna klonů z DNA Neurospora crassa
sonda z genu pro cytochrom c kvasinek
klon, který pravděpodobně nese gen pro cytochrom c
Identifikace příbuzných genů
Vyhledávání sondou vnitrodruhovou
Knihovna klonů z DNA Escherichia coli
nesoucí geny genové rodiny
Southern blotting
fragmenty DNA na elfo gelu
filtrační papír
r
denaturace NaOH
membrána
přenos DNA z gelu na membránu
otisk DNA na membráně
inkubace se značenou cDNA
vyvolání RTG filmu
Příkladem využití Southern blotu byly RFLP profily získané sondami \S6110, \S901 a \S900 u mykobakteri
Identifikace produktů translace
Podmínkou je, aby byl protein buňkami
exprimován
> Používají se protilátky polyklonální nebo monoklonální
> Testují se přímo kolonie
> Metoda se velmi podobá DOT BLOT hybridizaci
Imunoscreening kolonií
nylonová membrána
otisk kolonií na
membránu ^ _t\
lyže buněk chloroformem
°°o o °o°
otisk proteinů
bakteriální kolonie (genomová banka)
specifická protilátka
M
značený protein A
identifikace kolonie
expozice
inkubace přes noc, hybridizace
Ještě pár poznámek
1) Monoklonální protilátky produkují hybridomy http://en.wikipedia.org/wiki/Hybridoma_technology
2) Protein A je bakteriální protein, který se specificky váže k protilátkám
3) Moderní přístupy využívají systému primární-sekundární protilátka, detekce pak může být fluorescenčně
Více např. přednášky ze 3. ročníku - Western blot
Shrnutí
1) Pojem rekombinantní DNA
2) Historické milníky
3) Proč je klonování genů důležité i v mikrobiologii?
4) Jak se klonování genů provádí
5) Metody detekce klonovaných genů
6) Dot blot a Southern blot
7) Identifikace na úrovni translace