Analýza nukleových kyselin pomocí elektromigračních metod doc. RNDr. Milan Bartoš, Ph.D. Přírodovědecká fakulta MU, 2012 bartosm@vfu.cz Obsah přednášky 1) Elektroforéza – základní informace 2) Typy elektroforéz 3) Stanovení velikosti fragmentů elektroforézou 4) Různé typy barvení gelů 5) Pulsní gelová elektroforéza 6) Denaturační elektroforéza 7) Kapilární elektroforéza Doporučená literatura Brown (2010): Gene Cloning & DNA Analysis. WileyBlackwell, Sixth edition Sambrook and Russell (2001): Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, USA V červnu 2012 vyšlo 4. vydání – autoři Green and Sambrook Elektroforéza nukleových kyselin Princip elektroforézy Pohyb nabitých molekul v elektrickém poli - + Dělení molekul na základě rozdílných pohyblivostí, které závisí na: náboji, velikosti (hmotnosti) a tvaru Dělení podle prostředí Volná elektroforéza (v roztoku) Zónová elektroforéza (na nosiči, gelová) Volná elektroforéza + A + B + C -+ A + B + C A + B A C B + C Zónová elektroforéza + - A+B+C + - C B A Dělení podle uspořádání VertikálníHorizontální +- + - Kapilární Vlastnosti elektroforézy  Z praktických důvodů se elektroforéza neprovádí přímo v roztoku, ale na vhodném nosiči (většinou gel)  Pro přípravu gelu jsou výhodné látky, které samy gelují a mají různou porozitu v závislosti na koncentraci gelu Gely a pohyb částic v nich  agaróza nebo polyakrylamid  síťovitá struktura – koncentrace polymeru  agarózové gely = stovky až 50 kbp  polyakrylamid = 10 až 1 000 bp - + Co musí splňovat gely  Homogenní  Inertní, tj. bez nespecifických interakcí  Mechanicky pevné  Transparentní  Reprodukovatelná a snadná příprava Výhody elektroforézy  Elektroforetické metody nahradily ultracentrifugaci  Aparatury jsou levné, často je lze vyrábět svépomocí  Dělit lze všechny důležité biomakromolekuly  Změnou podmínek lze dělit podle různých hledisek  Rychlost  Lze pracovat s malými množstvími nebo preparativně v mikrogramových množstvích  Rozdělené molekuly lze snadno prokázat a ve funkční formě izolovat z gelu Elektroforéza nukleových kyselin Optimální velikost separovaných molekul  je nepřímo úměrná logaritmu velikosti molekul => nutné porovnání s velikostními standardy  agarózové gely 100 bp až 50 000 bp  polyakrylamidové gely 10 až 1 000 bp Rychlost pohybu makromolekul Vztah mezi velikostí DNA a pohyblivostí při elektroforéze M v log 1  Čím menší molekula, tím dál uběhne Pohyblivost závisí na hustotě gelu Zkuste stanovit Zadání je zde Elektroforézu budeme dělat ve cvičení a tam si i započítáte, teď si zkuste velmi jednoduchou úlohu 257 bp Vizualizace nukleových kyselin  ethidiumbromid  SYBR GREEN  stříbro UV (256,312nm) 590nm Vlastnosti ethidiumbromidu  Váže se jak na DNA, tak i na RNA  Po vytvoření komplexu EtBr-DNA je pozorována ~20 - 30 × vyšší fluorescence  Citlivost 1-5 ng DNA, 5 ng RNA (256 nm)  Polyakrylamid zháší fluorescenci EtBr, není možné detekovat méně jak 10 ng DNA Interkalace ethidiumbromidu Navlékání interkalátorů Barvivo SYBR Green I  vysoká afinita k NA  1000× vyšší fluorescence po vazbě na NA  25 – 100 × citlivější než EtBr  vhodné pro ds DNA, ssDNA a RNA  60 pg dsDNA nebo 1 ng RNA (při 300 nm)  mnohem méně mutagenní než EtBr Srovnání citlivosti SYBR Green I a EtBr SYBR EtBr Barvení stříbrem  Barvení NA stříbrem má mírně vyšší citlivost než barvením EtBr  Lepší citlivost u polyakrylamidových gelů (100 pg DNA) než u agarózových  vhodné pro ds DNA, ssDNA a RNA Využití elektroforézy  separace molekul  studium struktury DNA  studium interakcí mezi NA a proteiny L-forma CCC-forma Elektroforéza - animace http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/animations.html Pulsní gelová elektroforéza - - + + +  určena k dělení velkých fragmentů DNA a chromozómů (nad 50 kbp, stovky kbp, megabáze) - + Aparatura na PFGE Pěkná animace znázorňující pohyb DNA v pulsním poli je na http://www.bio.davidson.edu/cours es/genomics/method/pulse_field.ht ml Jak se provádí PFGE 1) Buňky se naředí na vhodnou koncentraci 2) Buňky se zalijí do agarózy 3) Agarózové bločky se opracují enzymy – lyze, deproteinace 4) Na genomovou DNA v bločcích se aplikují restriktázy Jak se provádí PFGE 5) Bločky s rozštěpenou genomovou DNA se nanesou na elektroforézu - + Příklad aplikace PFGE Diferenciace mykobakterií po štěpení NotI  nástroj pro epidemiology a epizootology  nezbytná počítačová analýza dat  stanovení fylogenetické příbuznosti ! porovnej s RFLP ! Jiný příklad aplikace PFGE Diferenciace Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis po štěpení SnaBI, SpeI  Pokus odlišit RFLP typy B-C1 Diferenciace Mycobacterium avium subsp. hominissuis po štěpení XbaI, DraI  Studium genetické diversity kmenů izolovaných u pacientů s AIDS Jak se vyhodnocují fragmenty získané po PFGE? Analýza změn ve fragmentu 4 000 bp Velikosti fragmentů Počet změn 0 3 3 2 2 6000 5000 4000 2500 2000 1500 1000 750 + RE - RE 4000 2500 1500 60004500 3500 + 50 - 50 Vliv mutace na RFLP spektrum Mutace Výsledek  bodová +RE  ztráta fragmentu + 2 nové  inzerce  stejný počet fragmentů, ale jeden se „prodlouží“ o délku inzerce  bodová -RE  ztráta 2 fragmentů + 1 větší nový  delece  stejný počet fragmentů, ale jeden se „zkrátí“ o délku delece Kritéria pro epidemiologii Tenover et al. (1995): Journal of Clinical Microbiology 33 (9), 2233-2239 Kategorie Počet genetických změn Počet změn v PFGE Epidemiologie Neodlišitelné 0 0 Součást ohniska Blízce příbuzné 1 2-3 Pravděpodobně (probably) součást ohniska Asi příbuzné 2 4-6 Možná (possibly) součást ohniska Odlišné ≥ 3 ≥ 7 Mimo ohnisko Denaturační gelová elektroforéza  V přítomnosti denaturačního činidla (formamid, močovina) během elektroforézy DNA zvolna denaturuje  Vznikají lokální větvené struktury s jednořetězcovou strukturou  Stejně dlouhé molekuly o různé sekvenci vytvářejí rozdílné struktury a pohybují se různou rychlostí  Lze dosáhnout detekce rozdílů až jediného bp Podobný efekt má gradient teploty Elektroforéza se uplatňuje při sekvenování nukleových kyselin  desítky až stovky párů bazí  denaturující polyakrylamidové gely (močovina)  moderní metody využívají kapilární gelové elektroforézy Existuje taky elektroforéza proteinů  polyakrylamidové gely denaturující a nedenaturující  různé způsoby detekce – Comassie briliant blue, stříbro Více si o elektroforéze proteinů řekneme ke konci semestru Příklady využití elektroforézy Jsou obsahem přednášky pro 5. ročník  Polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP)  Polymorfismus délky amplifikvaných fragmentů (AFLP)  Polymorfismus délky fragmentů DNA vytvořených cleavázou (CFLP)  Polymorfismus konformace jednořetězců (CSCP)  Polymorfismus konformace dvouřetězců (DSCP) A tak to někdy taky chodí … A tak to někdy taky chodí … A tak to někdy taky chodí … A tak to někdy taky chodí … A tak to někdy taky chodí … A tak to někdy taky chodí … A tak to někdy taky chodí … Shrnutí 1) Elektroforéza – základní informace 2) Typy elektroforéz 3) Stanovení velikosti fragmentů elektroforézou 4) Různé typy barvení gelů 5) Pulsní gelová elektroforéza 6) Denaturační elektroforéza 7) Kapilární elektroforéza