Ligázová řetězová reakce
ØLigace oligonukleotidových sond, pokud dojde k jejich vazbě na cílovou sekvenci DNA
ØVyžaduje 4 oligonukleotidy (LCR-primery)
ØDva oligonukleotidy specificky hybridizují k jednomu a dva k protilehlému řetězci
Ligace termostabilní DNA-ligázou (z Thermus aquaticus)

Zopakujme si, co je to ligace
MCAN00610_0000[1]
T4 DNA ligáza (E. coli infikované bakteriofágem T4)
5´
3´
OH
P
3´
5´
OH
P
5´
3´
3´
5´
+ 2 x ATP

Mechanismus ligace
5´... GA
3´... CTTA
ATTC ... 3´
AG ... 5´
samovolné připojení
spojení ligázou
+ 2 x ATP
5´... GAATTC ... 3´
3´... CTTAAG ... 5´
5´... GA ATTC ... 3´
3´... CTTA AG ... 5´
OH
OH
P
P

LCR probíhá v cyklech



Průběh ligázové řetězové reakce
ligace
denaturace
hybridizace

Průběh ligázové řetězové reakce
ligace
denaturace
hybridizace

Důsledky obdobné jako u PCR
Počet produktů LCR vzrůstá geometricky
Z každé molekuly vznikají v každém cyklu dvě nové

Formáty ligázové řetězové reakce
ØVětšinou kvalitativní
ØLze aplikovat i kvantitativně
Ø
ØStandardní detekce na gelu
ØSonda může být značena např. biotinem,+ fluoresceční značkou nebo digoxigeninem nebo alkalickou
fosfatázou
ØDetekce po zachycení na streptavidin fluorescenčně, barevnou reakcí nebo enzymaticky
Ø

Příklady využití LCR
ØDetekce kmenů Lactococcus lactis exprimujících nisinA a nisinZ (bakteriociny, E234) - hledání
strukturních variant genu, rok 2006
Ø
ØJiž v roce 1993 použita k vysoce specifické detekci Chlamydia trachomatis (Dille et al. (1993): J
Clin Microbiol. 31(3):729-31)
ØBorrelia burgdorferi (1991), Neisseria gonorrhoeae (1992), Mycobacterium tuberculosis (1993),
ØLidský papillomavirus (1990), HSV (1991, HIV (DNA, 1991)

Více o aplikacích LCR
Wiedmann et al. (1994): Ligase chain reaction (LCR)-overview and applications. Genome Res. 3:
S51-S64