QIAquick Gel Extraction Kit
Extrakce fragmentů DNA (70 bp - 10 kb) z agarózových gelů po enzymatických reakcích
Princip: Pro vazbu DNA se používá centrifugační kolonka s membránou ze silika materiálu
- vazba DNA pfi vysokých koncentracích solí
- educe pfi nízkých koncentracích soli
- odstraněni enzymů, pnmerú. nukleotidů, soli. agarózy, etidiumbromidu a dalších nečistot
Princip
Bloček gelu je rozpuštěn v pufru, který obsahuje indikátor pH pro optimální vazbu na kolonku
íř ŕ
Roztok se aplikuje na kolonku a po centrifugaci (nebo vakuovou přesávkou) dojde k navázání DNA
Nečistoty jsou odstránený promýváním
DNA je eluována elučním puŕrem nebo vodou
1
1 I
1
KM ... ..«-.
\
1
i
i
1
Postup
1.   Na transiiuminátoru při vlnové délce 365 nm vyřizneme sterilním skalpelem bloček agarózy s fragmentem DNA odpovídajícím
1   VeMow pBJuescript {2961 bp)
2.  Inzertu (500 bp) Dodržujeme bezpečnost práce (RUKAVICE, OCHRANNÝ $T(T>!
Skalpel a Spachlfe sterilizujeme namočením do neionizované vody a ná&ledně do etanolu, který zapálime a necháme shořet (POZOR NA ODKAPÁVAJÍCÍ HOŘÍCÍ KAPKY!) DMA v nezpracovávané části gelu chránime pred degradaci působením UV-svetla zakrytím vhodnou podložkou Minimalizujeme objem gelu ořezáním přebytečné agarózy {neměl by být vělSi neř 400 pWOO mg)
Postup
2    Bloček agarózy přeneseme pomoci spachtle do Eppendorf, zkumavky a zvážíme
3, Přidáme 3 objemy pufru QG (napr. k 200 rng = 200 ul přidáme 600 ul QG)
4. Ink u bujeme v termobloku 10 min/S0° C
6,   V pripadé potřeby upravíme pH přidáním 10 ul 3M octanu sodného (roztok musí být žlutý)
6. Roztok pŕepipelujeme na kolonku a zcentrrfugujeme Imin/10000 ipm. V případě, že }e objem vétli než 800 pl krok opakujeme.
7. Odstraníme roztok ze sběrné zkumavky a na kolonku přidáme 750 ul PE, centrifugujeme 1 min/10 000 rpm.
8. Odstraníme roztok ze sběrné zkumavky a centrifugujeme znovu 1 mirť 13000 rpm pro odstraněni zbytků etanolu
9. Kolonku přemislime do sterilní Epp. zkumavky a napipelujeme 30 ul eiučniho pufru EG na střed membrány, necháme stát 1 min a cen! rif ugu jem e 1 mm.
QIAGEN kit návod v čeŠtinč
1. Čistým ostrým skalpelem vyřízněte fragment DNA z aga rezového gelu. Snažte se odstranit přebytečný agarózový gel.
2. Určete hmotnost vyříznutého gelu a přidejte 3 objemy pufru QG (100 mg -100 pJ>.
Např, ke 100 mg gelu přidejte 300 ul pufru QG. Maximální množství gelu by mělo být 400 mg, v případe většího množství gelu použijte víc kolonek.
3. Zahřívejte Eppendorofovu zkumavku s gelem při teplotě 50 °C po dobu 10 minut dokud se gel v pufru nerozpustí. Rozpuštění gelu múze urychlit mícháni zkumavky na v o rte x u každé 2-3 minuty.
Rozpusťte gel úplně, u gelů o koncentraci vyšší než 2% prodlužte dobu zahřívání.
4. Po kompletním rozpuštění gelu zkontrolujte barvu pufru - měla by být podobná jako barva výchozího pufru QG (tzn. žlutá).
Pokud je barva oranžová nebo fialová, přidejte 10 \i\ 3M octanu sodného. Adsorpce DNA na membránu kolonky je efektivní při pH s 7,5. Pufr QG obsahuje pH indikátor, který je při pH £ 7,5 žlutý, při vyšším pH se barva změní na oranžovou nebo fialovou.
5. Přidejte 1 objem (vzhledem ke hmotn. gelu) isopropanolu a zamíchejte. Např. když agaróza vážila 100 mg, přidejte 100 fil isopropanolu. Isopropanol zvyšuje výtěžek fragmentů větších než 4 kb a menších než 500 bp,
U fragmentů s velikostí mezi 500 bp a 4 kb nemá přídavek isopropanolu žádný efekt. V tomto kroku vzorek necentrifugujte.
6. Vložte kolonku QIAquick do 2ml sběrné zkumavky.
7. Napipetujte vzorek do kolonky a zcentrifugujte 1 min / - 12 000 rpm. Dojde k vazbě DNA na membránu kolonky. Maximální objem, který můžete napipetovat je 800 ul. V případě většího objemu po stočení napipetujte zbytek.
8. Vylijte přeteklou kapalinu do odpadu a vloze kotonku zpět do stejné sběrné zkumavky.
9. Do kolonky aplikujte 0,5 ml QG pufru a centrifugujte kolonku se sběrnou zkumavkou 1 min / - 12 000 rpm.
Tento krok odstraní zbytky agarózového gelu.
10. Do kolonky aplikujte 0.75 ml PE pufru a centrifugujte kolonku se sběrnou zkumavkou 1 min / - 12 000 rpm.
11. Vylijte proteklou kapalinu a kolonku se sběrnou zkumavkou centrifugujte ještě jednou po dobu 1 minuty.
Tento krok odstraní zbytky etanolu z PE pufru.
12. QIAquick kolonku vložte do čisté 1,5mi Eppendorfovy zkumavky.
13. Aplikujte 50 ul EB pufru na střed membrány kolonky a centrifugujte kolonku s Eppendorfovcu zkumavkou 1 min / * 12 000 rpm.
Dojde k eluci DNA z membrány. V Eppendorfové zkumavce je čistá plazmidová DNA.