Bi8240 GENETIKA ROSTLIN doc. RNDr. Jana Řepková, CSc. repkova@sci.muni.cz Prezentace 08 Biotechnologie ve šlechtění Biotechnologie jsou rozšířením šlechtění Obohacení klasických postupů ve šlechtění Tradiční šlechtění – kombinuje mnoho genů současně Biotechnologie – cílené vkládání genů Biotechnologické metody Základní principy Totipotentní schopnost somatické buňky Regenerace celistvých rostlin i z 1 buňky Sterilní prostředí in vitro, výživa Cíle Regenerace při genetických modifikacích Vegetativní množení materiálu Indukce haploidie Explantátové kultury Primární explanát Kalus DUCHEFA Biochemie BV, 1996 Regenerace rostlin Základní schéma regenerace rostlin v podmínkách in vitro Primární explanát Seman a kol. 1990 Embryoid Novák, 1990 Jednotlivá stadia embryogeneze rostlin Řepková, Relichová: Genetika rostlin, 2001 Metody významné ve šlechtění Regenerace rostlin – genetické modifikace Mikropropagace, klonové množení Konzervace genotypů Indukce haploidů – kultury izolovaných prašníků – mikrospor Mezidruhová hybridizace – embryo kultury – opylení in vitro Somatická hybridizace – fúze protoplastů Schéma mikropropagace Seman a kol. 1990 Cyclamen DUCHEFA Biochemie BV, 1996 Malus Lilium Zakořeňování Lilium DUCHEFA Biochemie BV, 1996 Orchideje DUCHEFA Biochemie BV, 1996 Malus DUCHEFA Biochemie BV, 1996 Kultivace v kontrolovaných podmínkách DUCHEFA Biochemie BV, 1996 Haplodie v podmínkách in vitro 1. Kalusové a suspenzní kultury in vitro 2. Pylové a prašníkové kultury in vitro – (tabák, ječmen, rýže) 3. Mezidruhové křížení a eliminace chromozomů – (rod Hordeum) Schematické znázornění androgeneze Seman a kol. 1990 Tvorba embryoidů v kultuře mikrospór Brassica napus DUCHEFA Biochemie BV, 1996 Tvorba embryoidů v kultuře prašníků Capsicum annuum DUCHEFA Biochemie BV, 1996 Regenerace rostlin v prašníkové kultuře Hordeum vulgare DUCHEFA Biochemie BV, 1996 Genetické modifikace rostlin Jsou definovány jako přímé a cílené zásahy do dědičného materiálu organizmů, čímž rozumíme DNA. Význam Teoretický modelové rostliny, metody transformace Aplikovaný šlechtění, komerční využití zemědělství, zahradnictví, lékařství, farmacie Současnost nové postupy – předmět Aplikovaná genetika a šlechtění Podíl genetických modifikací u různých organizmů Metody transformace u rostlin Podle přenosu DNA do buněk: Nepřímé: – Agrobacterium – semena, listové disky, kořeny, embrya, buňky – vakuová infiltrace Přímé: – elektroporace protoplastů – mikroinjekce DNA – bombardování mikropro- jektily – PEG Rod Agrobacterium Půdní gramnegativní bakterie Čeleď: Rhizobiaceae Druhy: – A. tumefaciens – A. rhizogenes – A. rubi – A. radiobacter Plazmidy Ti, Ri Transgeny Geny chimérické Geny markerové – selektovatelné hpt, npt, bar – signální GUS, GFP (s rostlinnými promotory) Exprese transgenu, počet transgenů Historie transformace rostlin 1983 tabák 1984 mrkev, štírovník 1985 řepka olejka, petúnie 1986 vojtěška, huseníček, rajče, tykev 1987 chřest, bavlník, len, ředkvička, salát, brambor, žito, slunečnice 1988 květák, celer, rýže, sója, 1989 jabloň 1990 chryzantéma, citrus, jetel, papája, jahodník 1991 karafiát, kiwi, meloun, švestka 1992 cukrovka, pšenice 1993 hrách, ječmen Historie transformace rostlin Počet polních pokusů s geneticky modifikovanými plodinami 1986–1997 Celková plocha GM plodin (mil. ha) 1996–2014 Celková plocha GM plodin (mil. ha) 1996–2016 Celková plocha GM plodin (mil. ha) 1996–2006 Rok Hektarů (mil.) Akrů (mil.) 1996 1,7 4,3 1997 11,0 27,5 1998 27,8 69,5 1999 39,9 98,6 2000 44,2 109,2 2001 52,6 130,0 2002 58,7 145,0 2003 67,7 167,2 2004 81,0 200,0 2005 90,0 222,0 2006 102,0 252,0 Celkem 576,6 1425,3 13% nárůst, 12 mil. hektarů (30 milionů akrů) mezi roky 2005 a 2006. Zdroj: Clive James, 2006 Celková plocha GM plodin v 21 zemích r. 2006 (mil. ha) Celková plocha GM plodin v 26 zemích r. 2016 (mil. ha) Celková plocha GM plodin v 28 zemích r. 2014 Celková plocha GM plodin v 26 zemích r. 2016 Nejvíce rozšířené geneticky modifikované plodiny (1997) Nejvíce rozšířené geneticky modifikované plodiny (2001) Celková plocha hlavních GM plodin 1996–2016 (mil. ha) Sója Kukuřice Bavlník Řepka olejná Cíle genetických modifikací GM 1. generace Rezistence k herbicidům. Rezistence vůči virům, bakteriím a hmyzím škůdcům. GM 2. generace Zvýšení nutriční hodnoty. Zlepšení chuti, kvality a trvanlivosti potravin. Modifikace organizmů pro přežití v extrémních podmínkách. Modifikace rostlin pro získání obnovitelných a ekologických zdrojů pro chemickou výrobu. Zvýšení mechanické stability proti škodám při transportu a skladování. GM 3. generace Nové typy rostlin Cíle genetických modifikací Nejčastější znaky u geneticky modifikovaných plodin r. 1997 Celková plocha GM plodin podle znaku 1996–2014 (mil. ha) USA 2010 Kukuřice Smartstax 8 genů Celková plocha GM plodin podle znaku 1996–2016 (mil. ha) Podíl GM čtyř hlavních plodin na celkové produkci r. 2005 Podíl GM čtyř hlavních plodin na celkové produkci r. 2016 Transgeny pro odolnost k herbicidům Strategie 1. Transgen kóduje nadbytek enzymu, který je inaktivován herbicidem. 2. Transgen kóduje odlišnou formu enzymu, která není herbicidem inaktivována. 3. Transgen kóduje enzym, který rozkládá herbicid. Transgen pro odolnost vůči herbicidu glyfozátu (Roundup) Herbicid blokuje aktivitu enzymu 5-enolpyruvátšikimát-3-fosfosyntázy – EPSPS. Transgen kóduje podobný enzym EPSPS, který však není glyfozátem blokován. Kukuřice, bavlník, sója, řepka olejná, rajče. Komerční název těchto plodin Roundup-ready Transgeny pro odolnost k herbicidům Transgeny pro necitlivost k herbicidům typu fosfinotricinu (známější název glufozinát) Herbicid blokuje enzym glutaminsyntetázu zneškodňující amoniak. 2 transgeny (bakteriální původ rod Streptomyces) – gen bar (bialaphos resistance) – gen pat (phosphinothricinacetyltransferase res.) Enzymy kódované těmito geny přeměňují herbicid na netoxickou sloučeninu – přenáší acetylové skupiny na AK Alanin fosfinotricinu. Řepka olejka, kukuřice, rýže, pšenice, bavlník, rajče, brambor, cukrová řepa Komerční název plodin Liberty. Transgeny pro odolnost k herbicidům Transgen pro rezistenci proti herbicidům typu sulfonylmočoviny (např. sulfuron) Inaktivace enzymu acetolaktátsyntázy podílející se na syntéze aminokyselin. Transgen – gen z mutantní linie rostliny Arabidopsis thaliana. Řepka olejka, rýže, len, rajče, cukrová řepa, kukuřice Transgeny pro odolnost k herbicidům Transgeny pro odolnost k hmyzím škůdcům 1. Bacillus thuringiensis Tvorba toxického proteinu δ-endotoxinu, protein Cry. selektivní pro škůdce Lepidoptera, Diptera, Coleoptera Geny cry Transgeny: různé geny pro δ-endotoxiny. I II III II, III – Význam pro úroveň insekticidní aktivity cAMP aktivace proteinkinázy A Lyze buněk Buněčná smrt Doména I musí zůstat nezměněná pro zachování toxicity Vložení genů pro chitinázy a inhibitory proteáz Doména I kukuřice - zavíječ kukuřičný – kukuřice MON810 gen cry1Ab bavlník rajče brambor - mandelinka bramborová Další typy transgenů 2. Rostlinné geny kódující proteiny, které naruší trávení hmyzu Inhibitory proteáz, amyláz Geny pro chitinázy Transgeny pro odolnost k hmyzím škůdcům Transgeny pro odolnost k virům 1. Rezistence zprostředkovaná genem pro plášťový protein tabák – TMV brambor – virus X, Y dýně – ZYMV, WMV2 pšenice – BYDV vojtěška – AMV rýže – RTSV, RSV, RYMV papája – PRSV podzemnice – TSWV Transgeny pro odolnost k virům 2. Rezistence k proteinu pro přenos z buňky do buňky 3. Rezistence podmíněná antimediátorovými transgeny RNA virus Životní cyklus virové RNA v buňce Oddělení plášťové bílkoviny a RNA Translace Virová polymeráza z virové RNA Tvorba negativního řetězce RNA Tvorba pozitivního řetězce RNA Tvorba virových proteinů Skládání nových virových částic Pohyb virových částic do dalších buněk plazmo- dezmaty Transgeny pro odolnost k houbovým a bakteriálním chorobám Geny pro PR proteiny – ječmen a geny pro chitinázy z Trichoderma harzianum = odolnost k Rhizoctonia. Geny pro rasově specifickou rezistenci brambor – gen ze S. bulbocastanum. Odolnost k Phytophthora rajče - gen Pto z odolného genotypu+ promotor 35S = odolnost k Pseudomonas. Geny pro antibakteriální proteiny brambor – gen pro lysozym z bakteriofáza T4. geny pro thioniny z ječmene do tabáku = odolnost k Pseudomonas syringae. Transgeny navozující změny ve složení zásobních látek rostlin Zásobní oleje - řepka olejná, sója Cíl: potravinářské využití: ↑kys. olejová, ↓kyselina eruková a linolenová, γ-linolenová průmyslové využití: ↑ kyselina stearová a laurová Kyselina Počet uhlíků : počet dvojných vazeb laurová 12 : 0 palmitová 16 : 0 stearová 18 : 0 olejová 18 : 1 linolová 18 : 2 linolenová 18 : 3 eikosenová 20 : 1 eruková 22 : 1 Potravinářství 22:1 → 18:1 antisens konstrukt pro thioesterázu 18:0 → 18:1 delta9 desaturáza – řepka až 90 % kys. olejové (z 60 %) – sója až 79 % (z 22 %) Průmysl 18:1 → 18:0 antisens konstrukt pro delta9 stearát desaturázu = 18:1 pouze 1–2 %, 18:0 40 % (margariny) 18:0, 18:1 → 12:0 Lauroyl thioesteráza – mýdla, detergenty, cukrářské tuky Farmaceutický produkt α-linolenová 18:3 δ9,12,15 → γ-linolenová 18:3 δ6,9,12 desaturáza PUFA vícenenasycené mastné kyseliny – ω3 mastné kyseliny v mořských rybách vs. ω3 v rostlinných olejích PUFA (polyunsaturated fatty acids) EPA Kyselina eikosapentoenová 20:5n3 DHA Kyselina dokosahexaenová 22:6n3 DHA a EPAnezbytné pro lidský metabolismus, pozitivní efekt na kardiovaskulární, nervová a autoimunitní onemocnění – v mořských rybách – syntéza v GM plodinách, enzymy n3-desaturázy a elongázy – Cíl: 18 % EPA a 12 % DHA (jako rybí tuk) Sója 10 % až 20 % EPA, 3 % DHA Řepka olejná 15 % EPA Len, rýže Geny ze sinic (desaturázy), řas, z Phytophthora infestans, mořské houby, promotor se specifickou aktivitou v semenech Zásobní proteiny semen – optimalizace spektra aminokyselin u obilovin a luskovin, obohacení methioninem – zein z kukuřice (28 % methioninu) – glycinin ze sóje – prolamin z rýže (20 % methioninu) – albumin ze slunečnice (16 % met.+ 8 % cystein) kukuřice, sója, řepka Změny ve složení škrobu brambor Škrob (polymer glukózy) se sníženým obsahem amylózy (bez amylózy) – gen pro enzym GBSS (granule-bound starch synthase), syntéza v amyloplastech – Firma BASF - brambory Amflora 98 % amylopektinu – Papírenský průmysl Škrob se zvýšeným obsahem amylózy – enzymy SBE (starch branching enzyme) zajišťují větvení lineárních řetězců amylózy za vzniku amylopektinu Biodegradovatelné plasty Bioreaktory pro produkci speciálních proteinů Protein pavoučích vláken – syntetický gen SO1 (gen MaSpI z pavouka Nephila claviceps a sekvence odpovídající lidskému genu pro elastin. Lékařství – chirurgie, povrchy implantátů pro potlačení imunitní reakce, povrchy pro pěstování umělých orgánů, pro růst chondrocytů. Transgeny u rajčat s prodlouženým dozráváním Transgen flavr savr - antimediátorová RNA blokuje tvorbu enzymu polygalakturonidázy. Podílí se na poslední fázi zrání plodů, způsobuje rozklad pektinů ve středních lamelách buněčných stěn. Transgen zamezující expresi 1 genu biosyntézy etylénu – antimediátorový konstrukt Etylén vyžaduje specifické receptory pro přenos signálu. Gen Etr-1 kóduje mutovaný receptor, necitlivost k etylénu u Arabidopsis, zpožděné zrání plodů u rajčete a petúnie. Modifikace barvy květu Okrasné druhy – transgeny pro nové cesty biosyntézy flavonoidů a antokyanů Karafiát – geny z Viola sp. a petúnie – Petunia x hybrida – změna bílého zbarvení na fialové - delfinidin Moonaqua Transgeny pro pylovou sterilitu Systém Barnáza – Barstar Barnáza – extracelulární RNáza z Bacillus amyloliquefaciens – + promotor specifický pro tapetum Barstar – inhibitor Barnázy (protein) Nové typy plodin Rýže – obohacená o beta-karoten, provitamin A – psy – phytoen syntáza (narcis), promotor pro gluteliny rýže Gtl p – ctr1 – karoten desaturáza (Erwinia), promotor 35S – lcy – lykopen beta-cykláza Řepka olejná – zvýšený obsah vitaminu E – geny VTE3, VTE4 (enzymy metyl transferázy) A. thaliana Kávovník – bezkofeinové boby – gen CaMXMT1 (theobromin sytáza) z Coffea canephora Rýže – zvýšený obsah železa Papája – přizpůsobení půdám s vyšším obsahem hliníku Odolnost vůči stresovým faktorům Odolnost vůči stresovým faktorům 1. Odstranění oxidativního stresu – odstranění kyslíkových radikálů – antioxidanty – superoxiddismutáza (SOD) 2. Navození odolnosti vůči dehydrataci – změny ve složení lipidů cytoplazmatické membrány, – změny ve spektru mastných kyselin, geny pro desaturázy Odolnost vůči stresovým faktorům 3. Osmoprotektanta – fruktany, gen SacB (Bacillus subtilis) pro enzym levansukrázu – transport do vakuol - cpy – Gen badh (rostlinné, E. coli) – enzym betain aldehyd dehydrogenáza – akumulace glycin betainu z betainaldehydu Odolnost vůči stresovým faktorům 4. Geny pro transkripční faktory 5. Regulace cytokininů Tvorba protilátek, rostlinné vakcíny IgAIgG Tvorba protilátek, rostlinné vakcíny Využití Produkty ve fázi klinických testů Produkt Rostlina Lidský somatotropin léčba trpasličího vzrůstu u dětí tabák Turnerova syndromu Albumin lidského séra Náhrada krve při traumatických stavech tabák Dow AgroSciences Lidský interferon α 2b Funkce jako léčivo při virových infekcích, leukemii i proti nádorům okřehek Biolex Therapeutics Inc Pankreatická lipáza cystická fibróza doplněk stravy kukuřice Meristem Therapeutics Protilátka proti zubnímu kazu Planet Biotechnology Inc. tabák (CaroXTM) schváleno pro EU, ještě není na trhu Vakcína psích parvovirů Large Scale Biology Corp. tabák Komerční produkty na trhu Produkt Rostlina Avidin Prodigene kukuřice β-glukuronidáza Prodigene kukuřice Trypsin Prodigene kukuřice Lidský laktoferin Meristem Therapeutics kukuřice, rýže Lidský lysozym Ventria Bioscience rýže Lipáza Meristem Therapeitics kukuřice α-amyláza Syngenta kukuřice, tabák Nutraceutika geneticky upravené potraviny, které mají příznivý vliv na zdraví lidí nebo slouží jako ochrana před nemocemi rostlinné produkty, s pomocí kterých se vytvoří vakcíny či jiné látky k léčbě nemocí GM rýže, která nahrazuje očkování proti choleře GM banány produkující vakcínu proti hepatitidě typu B GM tabák produkující vakcínu proti lidskému papilomaviru a rakovině děložního čípku GM salát – produkce inzulinu, kapsle z celulózy rostl. původu, pomalý rozklad v trávicím traktu působením mikroflóry, uvolňování inzulinu do krve Další typy GMO Produkce farmakologicky využitelných proteinů – hirudin Produkce biodegradovatelných polyesterů – polyhydroxybutyrát (PHB) Fytázy - enzymy degradující kyselinu fytovou, využití fosforu rostlinami Fytoremediace - transgeny pro metalothioneiny Finanční úspory při komerčním využití GMO Rezistence k virům aj. škůdcům: – ↓ aplikace insekticidů a pesticidů - úspora 443 mil. kg – Snížení CO2 o 19 miliard kg (2010) – vyšší výnosy o 7–9%  bavlník 750 tis. ha 60 mil. $/rok  kukuřice 2,8 mil. ha 190 mil. $/rok Rezistence k herbicidům: – nižší aplikace herbicidů až o 40% – vyšší výnosy – šetří životní prostředí – úspora 91 mil. ha pozemků Bezpečnost transgenních rostlin Geny pro rezistenci k antibiotikům Geny pro toxiny, herbicidy Geny kódující alergenní proteiny Legislativní zabezpečení manipulace s geneticky modifikovanými organizmy 1989 Česká komise transgenoze rostlin – Česká komise pro nakládání s GMO 1996 Zákon č. 92 O odrůdách, osivu a sadbě pěstovaných rostlin Zákony ČR – 2000 - Sb. z. č. 153/2000 – Zákon o nakládání s GMO a produkty – 2004 Sb.z.č. 78/2004 – http://www.mvcr.cz – Novela zákona 1. ledna 2017 čj. 78/2004 Sb. a vyhlášky č. 209/2004 Sb. Výukovou pomůcku zpracovalo Servisní středisko pro e-learning na MU http://is.muni.cz/stech/