Bi9393 Analytická cytometrie Lekce 3 Oddělení cytokinetiky Biofyzikální ústav AVČR, v.v.i Královopolská 135 612 65 Brno e-mail: ksoucek@ibp.cz tel.: 541 517 166 •Karel Souček, Ph.D. •K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Principy průtokové cytometrie a sortrování nsorting nzpracování signálu nanalýza dat nkompenzace signálu •K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie • • • • • • •+++++ • • •----- • • • • Blue tissue paper • • • • • • •+++++ • • •----- • • • • • • • • • • •+++++ • • • •----- • • • • • • • • • • • • • • • •+++++ •+++++ • •----- •+++++ • • • • • • • • • • •++ •+++++ • •----- •+++++ • • • •++ •+++++ • Blue tissue paper • • • • • • • • • •+ •+++++ • •----- •+++++ • • •+ •+++++ • Blue tissue paper • Blue tissue paper • • • • • • • •----- •+++++ •----- •+++++ • • • •+++++ • Blue tissue paper • • • • • • Blue tissue paper • • • •----- •+++++ •----- • •+++++ • • •+++++ • •----- • • • • • • • • •- - •+++++ •----- •- - - - - • • • • •- - •- - - - - • • • • • • • • •- •+++++ •----- • • • • •- •- - - - - •- - - - - Blue tissue paper • • • • • • • •- •+++++ •----- • • • • •- - - - - •- - - - - Blue tissue paper • • • • • • • •- •+++++ •----- • • • • •- - - - - •- - - - - Blue tissue paper • • • • • • • •- •+++++ •----- • • • • •- - - - - •- - - - - •http://www.cyto.purdue.edu/cdroms/cyto10a/seminalcontributions/fulwyler.html n n •SORTING • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •Frequency •Charge •Drop Delay •Amplitude •SORTING •SORTING •Sheath Pressure •Nozzle Size •Frequency • • • • •Amplitude •SORTING • • • • • • •Drop delay •Interrogation point •Breakoff • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •SORTING •Each sort setup includes: • Sheath pressure • Breakoff window values • Side Stream window values • Instrument window > Laser tab values •SORTING - Streams Aria FINAL picturestest_Page_062_Image_0001 Aria FINAL picturestest_Page_142_Image_0002 •Good •Bad •SORTING – Setup Side Streams Aria FINAL picturestest_Page_062_Image_0001 Aria_II_UG_draft5_Page_165_Image_0002 Drop Delay •interrogation point • • • • • •drop delay •breakoff • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Waste • • •BD FACS™ Accudrop technology nAccudrop beads nDiode laser nCamera nOptical filter n Before sorting, you need to make sure that you have an accurate drop delay setting. The Aria has integrated Accudrop technology which provides a simple way to adjust the drop delay. The components used for Accudrop: Diode laser: A low-power red laser which illuminates the lower portion of the stream when the sort block door is closed (there’s a safety interlock). Camera: Provides an image of the side streams visible in this window. (located behind the round window in the sort block) Optical filter: Used for viewing the fluorescence from the droplets containing Accudrop beads. (point out the button on this image that moves the filter into place) Accudrop beads: Beads that are excited by the diode laser and emit within the range of the optical filter. The drop delay is the distance between the laser intercept and the last connected drop, measured in time. The system needs to know when to charge the stream so that the intended droplet is charged before it is detached from the stream. This diagram shows the diode laser and the lower camera window. When setting the drop delay, the waste aspirator drawer is blocking the collection tubes, so all beads will go to waste. Essentially, Accudrop allows us to view the accuracy of our sort in real-time, without having to do a post-sort analysis. •Sorting - Sort Masks • • • • • • • • • • • • • •Cells are randomized distributed over the stream •Sorting - Sort Masks • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • aspirator • • • • • •Trailing •Interrogated •Leading • • • • • • • • • • Mask nA region of the stream monitored for the presence of cells nDetermines how drops will be deflected if a sorting conflict occurs nMeasured in 1/32 drop increments – • •Mask = 0 •Mask = 8 •Mask = 16 •Mask = 32 •4 •4 •8 •8 •16 •16 At the laser intercept particles are defined as wanted or not based on the gates you created in the software. However, while the particle is traveling down the stream another decision is made on whether or not the particle will be sorted based upon the Sort Precision mode. A sort precision mode is made up of a combination of masks. A mask is a region of the stream that will be considered to make a decision if there’s a sorting conflict. Each mask is measured in 1/32 drop increments. The next few slides will discuss each individual mask, then we’ll look at how those three masks are combined into precision modes. Note to instructor: Encourage customers to hold questions about putting the masks together until after you’ve discuss the basic definitions of all three. Conflict Resolution nPrecision modes include three types of masks –Yield –Purity –Phase n •Sorting - Sort Masks •Sort decisions are determined by sort masks •Target particles in a drop with 1/32-drop resolution •Sorting - Yield Mask •The yield mask defines how many drops will be sorted Yield mask of 8/32 indicated in blue; target particle shown in green • •Yield Mask •Sorting - Purity Mask • •Purity mask of 8/32 in blue, 4/32 in each adjacent drop; target particles in green, non-target particles in red • •Purity Mask • •Purity Mask Flow Cytometry Standard data file format. FCS 3.1 http://www.isac-net.org/images/stories/documents/Standards/fcs3.1_normativespecification_20090813.p df Spidlen, J. et al. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology 77, 97-100, (2010). D:\Kaja\Desktop\Výstřižek.PNG Laser Laser Laser Creation of a Voltage Pulse •Time •Time •Time • • • •1 •2 •3 Height, Area, and Width • •Time (µs) •Pulse area(A) •Pulse Width (W) •0 Signal processing • • •time •FSC ~ cell size •FL-1 (530/30nm) ~ green fluo. •FL-2 (585/42nm) ~ red fluo. •Analog/digital •conversion •Height •Width •Area ( ∫ ) •FL- (H, W, A) • • •FL-2 (H) • • • • •dot plot •0 •1000 •1000 •Zesílení signálu (!) •lin nebo log •K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie •baseline • •16, 384 •Time •340 •1985 •7650 •12420 •Analog to Digital Converter •Voltage In PMT Power Supply •Levels 0–1000 Volts • • •Photon In •Signal • Out • • Digital data to memory Analog to Digital Conversion • •Digitize •the pulse •16,384 levels •Sample • the pulse •10 MHz •Analog to Digital Converter •Parameters •Area: Sum of all height values •Height: Maximum digitized value X 16 •Width: Area/Height X 64K • • Data is displayed on 262,144 scale • •282 •3060 •10270 •358 •4004 •9568 •14524 AD převodníky Počet bitů # kanálů rozlišení 8 256 39.1 mV 10 1024 9.77 mV 12 4096 2.44 mV 14 16384 610 mV 16 65536 153 mV 18 262144 38.1 mV 20 1048576 9.54 mV 22 4194304 2.38 mV 24 16777216 596 nV •28 = 256 •210 = 1024 •. •. •. • •Full scale measurement range = 0 to 10 volts •ADC resolution is 12 bits: 212 = 4096 quantization levels •ADC voltage resolution is: (10-0)/4096 = 0.00244 volts = 2.44 mV • •K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Kolik bitů? nPokud konvertujeme analogový signál pomocí 8 bitového ADC – máme 256 kanálů (28=256) odpovídajících rozsahu 0-10 V nRozdíl mezi kanály je 10/256=~40mV • • •0 50 100 150 200 250 • •10V •1V • •100mV • Channels •upraveno podle J.P.Robinson Ideální logaritmický zesilovač • • •0 50 100 150 200 250 • •10 V •1 V • •100 mV • • •0 50 100 150 200 250 • •10 V • •1 mV •Channels • • •Linearní •Log •1 V •100 mV •10 mV •Log amp •upraveno podle J.P.Robinson Logaritmické zesílení & dynamický rozsah •upraveno podle J.P.Robinson •lin •log Kompenzace fluorescenčního signálu n…později n n n n n Analýza dat nZobrazení dat –histogram –dot plot –isometric display –contour plot –chromatic (color) plots –3 D projection nGating Způsoby pro zobrazení dat 4Color TBNK + TruC02 4Color TBNK + TruC02 4Color TBNK + TruC02 4Color TBNK + TruC02 •K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Histogram distribuce četnosti nHistogram zobrazuje četnost částic pro jeden parametr nJednoduchý výstup nNekorelujeme s dalším parametrem nProblém s identifikací populací •K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Dot plot nZobrazuje korelaci dvou libovolných parametrů nJednotlivé tečky představují konkrétní změřené buňky (částice) nHodnoty pro řadu částic mohou ležet ve stejném místě nNemáme informaci o relativní denzitě částic nProblémy s vykreslením v případě velkých objemů dat 4Color TBNK + TruC02 •K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Density & contour plot nDensity plot: nZobrazuje dva parametry jako frekvenci četnosti nbarva a nebo její odstín odpovídá četnosti částic n nContour plot: nspojnice spojuje body (částice) se stejnou hodnotou signálu n nV podstatě simulujeme 3D graf – třetí rozměr je frekvence 4Color TBNK + TruC02 4Color TBNK + TruC02 4Color TBNK + TruC02 •K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Čas jako jeden z parametrů • •K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie 3D zobrazení n2 parametry + četnost n n n n n n3 parametry společně 4Color TBNK + TruC02 •K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie 3 Color Combinations • • • • • •Negatives •Positives •4+4=8 • • • • • • • • • • • • • •FITC • • • • •4+4+4=12 •upraveno podle J.P.Robinson 3 Color Combinations • • • • • • • • •FITC • • • • •4+4+4=12 • •PE-FITC Pattern FITC •TR-FITC Pattern FITC •TR-PE Pattern Phycoerytherin .1 1 10 100 1000 .1 1 10 100 1000 .1 1 10 100 1000 • • CD4 CD38 CD45 CD3 Negative Negative CD20 CD8 CD7 CD2 CD8 CD8 (dim) CD2 Negative CD4 CD5 K CD3 CD3 IgG CD3 CD8 CD3 • CD20 IgG L CD20 CD20 CD45 •upraveno podle J.P.Robinson „Gating“ §Real-time gating vs. softwarový „gating“ §Určení regionů §Strategie „gatingu“ §Analýza kvadrantů §Boolean „gating“ §zpětný „gating“ § Real-Time vs. Software Gating §Real-time (live) gating: • -omezuje akceptovaná data během měření § §Software (analysis) gating: •-vyřazuje určitá data během následné analýzy •upraveno podle J.P.Robinson Určení regionů • §Objektivní nebo subjektivní? •-školení/schopnosti/trénink § §Možné tvary: •-obdelník •-elipsa •-“free-hand“ (polygon) •-kvadrant • §Statistika •- počet •- podíl (%) •- průměr, medián, S.D., CV, …. Region vs. gate • •Region §oblast (plocha) v grafu definovaná uživatelem §mnoho regionů v jednou grafu §ohraničujeme pomocí nich populace našeho zájmu §je možné je barevně odlišit §je definován stejně pro všechny vzorky v analýze § •Gate §je definován jako jeden a nebo více regionů zkombinovaných pomocí logických operátorů (AND, OR, NOT; Booleova logika) § § • 4Color TBNK + TruC02 •K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Region 1 established Gated on Region 1 Using Gates •upraveno podle J.P.Robinson Statistika nAritmerický průměr nGeometrický průměr nMedián n– odhad střední hodnoty n– není ovlivněn extrémními hodnotami nSměrodatná odchylka nKoeficient variance nModus – nejčastější hodnota •K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Statistika pro histogram •K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Analýza kvadrantů •(+ +) •( - +) •(+ -) •(- -) •K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Logický „Gating“ (Booleova logika) •S překrývajícími se oblastmi máme mnoho možností: • • •upraveno podle J.P.Robinson Boolean Gating Not Region 1: •upraveno podle J.P.Robinson Boolean Gating • Not Region 2: •upraveno podle J.P.Robinson Boolean Gating Region 1 or Region 2: •upraveno podle J.P.Robinson Boolean Gating Region 1 and Region 2: •upraveno podle J.P.Robinson Not (Region1 and Region 2): •Boolean Gating •upraveno podle J.P.Robinson • •90 Degree Scatter •0 • 200 • 400 • 600 • 800 •1000 •8 •15 •20 •30 •40 •50 •100 •200 •1000 •Lymphocytes •Monocytes •Neutrophils •Side Scatter Projection •Light Scatter Gating •Scale •upraveno podle J.P.Robinson Back Gating Region 4 established Back-gating using Region 4 Back gate •upraveno podle J.P.Robinson Back Gating 4Color TBNK + TruC02 4Color TBNK + TruC02 •K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie •FITC+ •PE+ • • •FITC+ •APC+ •PE + •APC+ • •3 Parameter Data Display •upraveno podle J.P.Robinson • • • Vícebarevné analýzy generují mnoho dat… •1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 •3 color •4 color •5 color •Log Fluorescence •QUADSTATS •++ •-- •+- •-+ •Log Fluorescence •QUADSTATS •++ •-- •+- •-+ •Log Fluorescence •QUADSTATS •++ •-- •+- •-+ •Log Fluorescence •QUADSTATS •++ •-- •+- •-+ •Log Fluorescence •QUADSTATS •++ •-- •+- •-+ •Log Fluorescence •QUADSTATS •++ •-- •+- •-+ •Log Fluorescence •QUADSTATS •++ •-- •+- •-+ •Log Fluorescence •QUADSTATS •++ •-- •+- •-+ •Log Fluorescence •QUADSTATS •++ •-- •+- •-+ •Log Fluorescence •QUADSTATS •++ •-- •+- •-+ •Log Fluorescence •QUADSTATS •++ •-- •+- •-+ •Log Fluorescence •QUADSTATS •++ •-- •+- •-+ •Log Fluorescence •QUADSTATS •++ •-- •+- •-+ •Log Fluorescence •QUADSTATS •++ •-- •+- •-+ •Log Fluorescence •QUADSTATS •++ •-- •+- •-+ •Log Fluorescence •QUADSTATS •++ •-- •+- •-+ •Log Fluorescence •QUADSTATS •++ •-- •+- •-+ •Log Fluorescence •QUADSTATS •++ •-- •+- •-+ •Log Fluorescence •QUADSTATS •++ •-- •+- •-+ •Log Fluorescence •QUADSTATS •++ •-- •+- •-+ •Log Fluorescence •QUADSTATS •++ •-- •+- •-+ •Log Fluorescence •QUADSTATS •++ •-- •+- •-+ •Log Fluorescence •QUADSTATS •++ •-- •+- •-+ •Log Fluorescence •QUADSTATS •++ •-- •+- •-+ •Log Fluorescence •QUADSTATS •++ •-- •+- •-+ •Log Fluorescence •QUADSTATS •++ •-- •+- •-+ •Log Fluorescence •QUADSTATS •++ •-- •+- •-+ •Log Fluorescence •QUADSTATS •++ •-- •+- •-+ •Log Fluorescence •QUADSTATS •++ •-- •+- •-+ •Log Fluorescence •QUADSTATS •++ •-- •+- •-+ Mad Scientist Cartoon •upraveno podle J.P.Robinson http://www.chromocyte.com/Library/ResizedImages/445/522/Batch_Analysis.png Další způsoby vizualizace vícerozměrných dat nt-SNE, viSNE –t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding –viSNE is a tool for reducing high-parameter data down to two dimensions –visually identify interesting and rare biological subsets –allow to gate single cell events across different samples. nSPADE –Spanning-tree Progression Analysis of Density-normalized Events –way to automatically identify populations in multidimensional flow cytometry data files –clusters cells into populations and then projects them into a tree http://blog.cytobank.org/wp-content/uploads/2011/05/spade-tree.jpg https://www.cytobank.org/img/visualize_sunburst.jpg https://www.cytobank.org/img/visualize_doseresponse.jpg https://www.cytobank.org/img/visualize_heatmaps.jpg https://www.cytobank.org/img/visualize_spade.jpg https://www.cytobank.org/img/visualize_visne.jpg https://www.cytobank.org/img/visualize_dot_histogram.jpg https://www.cytobank.org/img/visualize_citrus.jpg The Flow Cytometry: Critical Assessment of Population Identification Methods (FlowCAP) •The goal of FlowCAP is to advance the development of computational methods for the identification of cell populations of interest in flow cytometry data. FlowCAP will provide the means to objectively test these methods, first by comparison to manual analysis by experts using common datasets, and second by prediction of a clinical/biological outcome. Způsoby pomocí kterých lze upravit výsledky: •1. Odstranění „doublets“ •2. Čas jako parametr pro kontrolu kvality • • •Příklad - pro DNA analýzu je třeba: •- odstranit „debris“ a shluky •- odstranit „doublets“ •- udržovat konstantní průtok • •K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Co je problém při vícebarevné detekci? •K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie •Emission Spectra–Spectral Overlap EmissionSpectra Kompenzace fluorescenčního signálu při vícebarevné detekci n n n n n n nProces při kterém dochází k eliminaci všech fluorescenčních signálů kromě signálu z fluorochromu který má být na příslušném detektoru detekován nNastavení pomocí mixu mikročástic či buněk označených/neoznačených příslušnými fluorochromy. • •K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Co je problém při vícebarevné detekci? •K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Kompenzace fluorescenčního signálu při vícebarevné detekci n n n n n n •K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie •“Bright” = good resolution sensitivity •Various fluorochromes-stain index •Choices for 6,- 8,- 10,- and more colors •Fluorochrome selection considerations •FITC Spillover • •650nm •700nm • •PerCP-Cy5.5 •695/40 • • •500nm •600nm •FITC • 530/30 •Wavelength (nm) •550nm • •PE •585/42 •750nm •800nm • FITC Compensation • •650nm •700nm • •PerCP-Cy5.5 •695/40 • • •500nm •600nm •FITC •530/30 •Wavelength (nm) •550nm •PE •585/42 •FITC Compensation • •650nm •700nm • •PerCP-Cy5.5 •695/40 • • •500nm •600nm •FITC •530/30 •Wavelength (nm) •550nm •PE •585/42 Slide 6 FITC adj FITC comp tab with values • •FITC Compensation • • 2Fitc comp 1Fitc no comp 3Fitc biexpo •Dot plot showing uncompensated FITC data •Dot plot showing compensated FITC data • •Biexponential dot plot showing compensated FITC data Kompenzace fluorescenčního signálu n n n n n n •K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie •FITC positive & negative •PE negative beads • •#2 Kompenzace fluorescenčního signálu n n n n n n • •K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie •FITC positive & negative •PE negative beads •NONE! Kompenzace fluorescenčního signálu n Nastavení kompenzací • •parametr - detektor amp. •FL1 - 544 •FL2 - 434 •kompenzace •FL1 - 1.1%FL2 •FL2 - 17.5%FL1 § značené mikročástice – pro běžně konjugované fluorochromy § značené buňky – pro vitální značení •Effects of Changing PMT Values •FITC Voltage Increased by 5 V •FITC Voltage Decreased by 5 V •Correct Compensation •Which marker for compensation? •Small errors in compensation of a dim control (A) can result in large compensation errors with bright reagents (B & C). •Use bright markers to setup proper compensation. •BD Comp Beads •Always positive • •Bright staining • •Save sample (HIV patients) • •Use the same antibody for compensation and the real experiment •BD Comp Beads • •PBMC were stained as shown in a 3-color experiment. Compensation was properly set for all spillovers •Courtesy Mario Roederer •Fluorescence Minus One Tandemové značky http://www.abcam.com/ps/CMS/Images/Tandem-Dyes_image.jpg Tandemové značky - příklad •Tandems are light sensitive •0 hours •2 hours •22.5 hours •PE •(FL2) • •CD8 •CD3 •PE-Cy5 •PE-Cy7 •Time Sample Left in Light Kompenzace - literatura n Mario Roederer - Compensation in Flow Cytometry n Current Protocols in Cytometry (2002) 1.14.1-1.14.20 John Wiley & Sons, Inc. n n M. Loken, D. R. Parks, & L. A. Herzenberg (1977). Two-color immunofluorescence using a fluorescence-activated cell sorter. J. Histochem. Cytochem. 25:899-907. M. Roederer & R. F. Murphy (1986). Cell-by-cell autofluorescence correction for low signal-to-noise systems: application to EGF endocytosis by 3T3 fibroblasts. Cytometry 7:558-565. S. Alberti, D. R. Parks, & L. A. Herzenberg (1987). A single laser method for subtraction of cell autofluorescence in flow cytometry. Cytometry 8:114-119. C. B. Bagwell & E. G. Adams (1993). Fluorescence spectral overlap compensation for any number of flow cytometry parameters. in: Annals of the New York Academy of Sciences, 677:167-184. •K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie No Data Analysis Technique Can Make Good Data Out of Bad Data! Shapiro’s 7th Law of Flow Cytometry Shrnutí nsorting nzpracování signálu nvizualizace dat a „gating“ nkompenzace n n •Na konci dnešní přednášky byste měli: 1. 1.Znát základní principu sortování, 2.popsat způsob zpracování signálu, 3.rozumět lin / log zesílení signálu, 4.rozeznat jednotlivé způsoby vizualizace dat, 5.chápat základní principy „gatingu“, 6.znát princip kompenzace signálu při vícebarevné detekci. • • •K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie