RECETOX, Masaryk University, Brno, CR holoubek@recetox.muni.cz; http://recetox.muni.cz Ivan Holoubek, Vít Matějů (Envisan) CHEMIE ŽIVOTNÍHO PROSTŘEDÍ I Environmentální procesy (13) Environmentální biotické transformace chemických látek Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 2 (13) Environmentální biotické transformace chemických látek Biotické transformace chemických látek. Biodegradace, typy biodegradačních reakcí, aerobní biodegradace a metabolické mechanismy, anaerobní biodegradace, kinetika biodegradace. Bioremediace. Testy biodegradability. Biotransformace, vlivy biotransformací na xenobiotika, fáze biotransformačních procesů. Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 3 Biodegradace Mikrobiální degradace hrají klíčovou roli při odstraňování syntetických chemických látek z vodního a terestrického prostředí Pokud je biodegradace pomalá, dochází k biakumulaci a primární a sekundární toxikaci potravních řetězců nebo může dojít ke snížení kvality pitné vody nebo ovlivnění různých funkcí povrchových vod. Persistence chemických látek z pohledu mikrobiální degradace vede k řadě problémů:  Estetickým – plasty, pěnící detergenty..,  Ekologickým rizikům (tenzidy, PCBs, DDT, aldrin…),  Humánním rizikům (PCDDs/Fs, pesticidy..). Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 4 Biodegradation The process in which material is broken down into innocuous products by living organisms. Websters New Collegiate Dictionary Mineralization The complete conversion of an organic chemical to stable inorganic forms of C, H, N, P, etc. which may entail several successive biological transformations Some Definitions…. Stacy Simonich *from TWF – P&G Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 5 V porovnání s nebiologickými eliminačními procesy jako jsou hydrolýza nebo fotochemická degradace, vede biodegradace v aerobním prostředí k anorganickým koncovým produktům jako jsou CO2 a voda. Tento proces se nazývá ultimativní biodegradace nebo mineralizace – hlavní propad látek v biotickém prostředí. Biodegradace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 6 Primary Biodegradation  1st Step in the Biodegradation Process  Partial Breakdown  Loss of Chemical Identity and in some cases function  If Biodegradation Does Not Continue  Persistent Metabolites Remain (e.g. Nonylphenol ethoxylates)  Only Part of the Mass Returned to Natural Mineral Cycles Ultimate Biodegradation  Complete Breakdown  Loss of Chemical Identity and Function  Extensive Mineralization with No Persistent Metabolites  Mass Completely Returned to Natural Mineral Cycles More Definitions…. Stacy Simonich *from TWF – P&G Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 7 Ready Biodegradable  Exclusively a Legal Term  Passes an OECD Ready Biodegradability Test  By Inference, Is Inherently & Practically Biodegradable Inherently Biodegradable  Can be ultimately biodegraded under some circumstances  Legal Term - Passes an OECD Inherent Biodegradability Test Practically Biodegradable  Is ultimately biodegraded in habitats to which it is discarded  Rate of degradation exceeds or is similar to the rate of loading (No accumulation) And More Definitions…. Stacy Simonich *from TWF – P&G Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 8 Správně je D. PERLMAN Vít Matějů Mikrobiální transformace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 9 MIKROORGANISMY schopné rozkládat polutanty:  Bakterie  Kvasinky  Plísně  Nižší houby Nejčastěji se využívají bakterie. Využití kvasinek pro čištění kontaminovaných lokalit prakticky neexistuje. Nižší houby: snaha o jejich využití nevedla k úspěšným výsledkům, takže se v současné době nevyužívají. Vít Matějů Mikrobiologie Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 10  Eukaryontní organismy – kvasinky, nižší houby  Prokaryontní organismy - bakterie Vít Matějů Mikrobiologie Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 11  PLASMIDY – většinou nesou genetickou informaci pro syntézu enzymů nutných pro degradaci polutantů  Pokud pomnožovací kultivace neprobíhá za selekčního tlaku, hrozí vyředění plasmidů a ztráta biodegradační aktivity. Vít Matějů Mikrobiologie Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 12 Vít Matějů Mikrobiologie Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 13  Využívají se kmeny přirozeně se vyskytující v zájmové lokalitě – autochtonní populace  Nebo kmeny uměle připravené (izolace, selekční tlaky, pomnožení) s požadovanými vlastnostmi – allochtonní populace.  Při využití allochtonních kmenů se postup nazývá bioaugmentace – obohacení vyselektovanými kmeny z jiných míst. Zastupitelný termín pro bioaugmentaci je inokulace.  Otázkou je, jak dlouho inokulované kmeny přežívají a jak dlouho jsou aktivní. Vít Matějů Mikrobiální degradace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 14 Co mikroorganismy umí ? BIOTRANSFORMACE Obměna molekuly polutantu biologickou cestou, výsledek může být pozitivní i negativní BIODEGRADACE Rozklad organických látek na menší organické či anorganické molekuly (aminokyseliny, monosacharidy, tuky) MINERALIZACE Oxidace organické látky na oxid uhličitý a vodu (za uvolnění energie a tvorby mikrobiální biomasy) Vít Matějů Mikrobiální procesy Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 15 NE PROTO, ŽE MY CHCEME POLUTANT Vít Matějů Základní mikrobiologické mechanismy využití polutantů Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 16 Aerobní - v přítomnosti kyslíku (alifatické uhlovodíky, některé chlorované ethyleny, aromatické uhlovodíky, fenoly), kyslík je finální akceptor elektronů Anaerobní – bez přítomnosti kyslíku (pentachlorfenol, tetrachlorethylen, aromatické uhlovodíky, organické kyseliny, nitroaromatické sloučeniny – TNT, RDX, HRX – finální akceptor elektronů jiný než kyslík Vít Matějů Mikrobiologie – biologický rozklad polutantů Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 17 Biologická rozložitelnost polutantu závisí na:  Struktuře a náboji molekuly  Polaritě  Rozpustnosti ve vodě  Stupni zvětrání  Biologické dostupnosti  Enzymatickém vybavení mikroorganismu  Transportu do buňky (přenosu hmoty) Biologická rozložitelnost polutantů Vít Matějů Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 18 Factors Affecting Biodegradation Inherent Properties of a Chemical  Structure  Physical/Chemical Properties Environmental Conditions  Local Biology  Physical chemical conditions Stacy Simonich *from TWF – P&G Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 19  Půdní matrice  Katabolická schopnost mikrobů  Chemické vlastnosti  Biodostupnost  Přítomnost dalších chemických látek (NAPLs) Faktory řídící biodegradace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 20 Molecular Weight  >500 Daltons - Negative Types of Bonds (Stability or Availability of Enzymes in Nature)  Esters < Amides < Ethers < Sulfonates < Phosphonates Stereochemistry Types and Numbers of Substitutions  Cl, NO2, SO3 - Negative  OH, =O, NH2, SO4 - Neutral or Positive Branching of Alkyl Chains Steric Limitations around Bonds The more crowded the more difficult for enzymes to reach Inherent Properties of a Chemical Stacy Simonich *from TWF – P&G Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 21 Hydrofóbní molekuly:  silná sorpce na pevné částice horninového prostředí a v organickém podílu  rozpouštějí se v nepolárních látkách přítomných v prostředí (ropné uhlovodíky)  transport do buňky je možný pouze pokud jsou rozpuštěné ve vodě Je nezbytná podpora přenosu hmoty. Polarita molekuly Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 22 Mezi nejčastěji používané makroskopické parametry k popisu molekul patří:  stupeň hydrofobicity  rozdělovací koeficient polutantu oktanol-voda  doba zdržení při HPLC Zvyšování rozdělovacího koeficientu oktanol-voda v některých případech vede ke snižování rychlosti biodegradace. Makroskopické parametry molekuly Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 23  Adice halogenového iontu, nitroso skupiny, CN, sulfátu, halogenu či methylu k jednoduchému aromatickému uhlovodíku, mastné kyselině či jiné molekule podstatně zhoršuje biologickou rozložitelnost  adice hydroxylové, karboxylové či amidické skupiny stimuluje biodegradovatelnost Rozložitelnost klesá se stoupající alkylací a halogenací původní látky Chybí enzymy pro rozklad Struktrura molekuly Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 24 1. Influence of point of linkage Rapidly degraded Slowly degraded CH2CH2CH2COOH CHCOOHCH3CH2 NH C O O C H CH3 CH3 Propham NC C O O CH2Cl CH3 CH3 H Propachlor 4-phenylbutyric acid 2-phenylbutyric acid Chemická struktura a degradace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 25 2. Influence of substitution Rapidly degraded Slowly degraded CCH3O H CCl3 OCH3 Methoxychlor CCl H CCl3 Cl DDT O Cl Cl CH2 COOH Cl 2,4,5-trichloroacetic acid (2,4,5-T) O Cl Cl CH2 COOH 2,4-dichloroacetic acid (2,4-D) Chemická struktura a degradace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 26 3. Influence of size Rapidly degraded Slowly degraded Chemická struktura a degradace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 27 Bacterial degradation Fungal degradation Time [Substrate] Degradation of PAHs in a soil Time [Substrate] Degradation of phenanthrene in a soil by bacteria and fungi Chemická struktura a degradace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 28 Environmental Factors Affecting Biodegradation Presence of Potential Degraders Favorable Conditions for Degrader Population Activity and Growth  Temperature & pH  Sufficient Nutrients (N, P, trace elements)  Moisture  Availability of Electron Acceptors (O2, NO3, SO4)  Time (SRT > Generation Time)  Absence of Inhibitors Bioavailability of the Chemical  Solubility  Sorption Concentration Sufficient Opportunity for Acclimation Stacy Simonich *from TWF – P&G Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 29  Pro biologický rozklad polutantů je nezbytné, aby mikroorganismy obsahovaly enzymy, které jsou schopné katalyzovat degradační či biotransformační reakce polutantu.  Fyziologické pochody nesmí být inhibovány přítomnými polutanty  Kontaminované prostředí nesmí působit na mikroorganismy toxicky. Vít Matějů Podmínky pro odbourávání chemických látek Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 30  V prostředí je třeba zajistit dostatek makrobiotických prvků (dusík jako NH4 a fosfor jako orthofosfát) a  Vhodné pH, teplotu, dostatek vlhkosti (v půdě) a přítomnost finálních akceptorů elektronů Vít Matějů Podmínky pro odbourávání chemických látek Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 31 Některé polutanty nelze odbourávat vedle sebe, například: Toluen Vít Matějů Odbourávání chemických látek Chlorbenzen Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 32  pH 4,5 až 8,2  Obsah vlhkosti nejméně 30 % půdní vodní kapacity  Enzymy – oxydasy, monoxygenasy, diooxygenasy, hydrolasy, peroxidasy Vít Matějů Optimální podmínky pro činnost půdních bakterií Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 33  Bakterie nevytvářejí exoenzymy pro rozklad polutantů  Rozklad probíhá v buňce  Molekuly se do buňky dostávají přes buněčnou membránu  Transport do buňky je: - aktivní (přenašeče) - pasivní (např. difúze) Transport do buňky – přenos hmoty Vít Matějů Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 34 Pasivní transport – difuze: Není třeba energie, je to pohyb molekul z prostředí s vyšší koncentrací do prostředí s nižší koncentrací látky Transport do buňky – přenos hmoty Vít Matějů Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 35 Pasivní transport – podporovaná difuze Není třeba ATP, ale musí být přítomna přenosová bílkovina, která zprostředkovává přenos z prostředí s vyšší koncentrací do prostředí s nižší koncentrací Transport do buňky – přenos hmoty Vít Matějů Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 36 Pasivní transport – osmóza Pohyb vody (červené tečky) polopropustnou membránou do místa s vyšší koncentrací rozpuštěných látek (modré tečky) Transport do buňky – přenos hmoty Vít Matějů Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 37 Aktivní transport Pro aktivní transport je třeba energie (např. ve formě ATP) Transport do buňky – přenos hmoty Vít Matějů Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 38 Aktivní transport - endocytosa Při tomto způsobu transportu vnesená látka neprochází buněčnou membránou Transport do buňky – přenos hmoty Vít Matějů Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 39  Rychlost přenosu hmoty do buňky je z hlediska rychlosti biodegradace určujícím krokem, protože je nejpomalejší.  U nepolárních sloučenin bakterie podporuje transport tvorbou povrchově aktivních látek (biosurfaktanty), které konjugují s molekulami polutantu a vytvářejí polární konjugovaný komplex, usnadňující přenos do buňky. Transport do buňky – přenos hmoty Vít Matějů Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 40 Fyzikální nedostupnost polutantu Transport do buňky – přenos hmoty Vít Matějů Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 41 V anaerobním prostředí jsou tyto procesy mnohem pomalejší a většinou nevedou k mineralizaci. V methanogenním prostředí je mineralizace definovaná jako konverze na jednouhlíkaté koncové produkty jako jsou CO2 a CH4. Transformace původních organických látek na jiné organické struktury (produkty) je označována jako primární (bio)degradace. Společenstva heterotrofních mikroorganismů je charakteristická katabolickou všestranností. Biodegradace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 42 Tyto organismy jsou schopny větších změn než vyšší organismy, jsou schopny adaptace a aklimatizace. Pro degradaci jsou většinou vhodnější směsné kultury mikroorganismů. Adaptace je popisována jako změna v mikrobiálních společenstvech – změna rychlosti biodegradace látky jako výsledek předcházející expozice danou látkou. Biodegradace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 43 I. Organic Chemical = Nutrient  Used as a Source of Carbon & Energy by Microbes  Degrader Population Increases in Chemical's Presence II. Organic Chemical - Cometabolized  Nonspecifically and partially metabolized  Not used as Nutrient  Degrader Population Does Not Increase Fundamental basis for biodegradation ORGANIC CHEMICAL BIOMASSCO2, CH4, NO3, etc. Mineralization (Energy) Incorporation Humification Humification (Growth) HUMIC MATERIALS Stacy Simonich *from TWF – P&G Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 44  Mineralizace  Úplná destrukce molekul na základní anorganické komponenty (CO2, H2O..)  Ko-metabolismus  Ko-oxidace molekul  Vznik dead-end metabolitů  Detoxifikace  Tvorba méně/ne-toxických metabolitů  Polymerizace  Vazba molekuly na části stejné molekuly Mechanismy biodegradace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 45 OH OH Catechol TCA cycle CO2 + H2O OH Phenol Succinic acid + CH3COOH Acetic acid COOH CH2 CH2 COOH COOH COOH cis,cis-muconic acid COOH CH C=O CH CH COOH CH2 CH CH2 C=O COOH CH3 C=O COOH CH3 CHO + Pyruvic acid Acetaldehyde CHO OH COOH 2-Hydroxymuconic semialdehyde HCOOH Mineralizace – úplný rozklad molekuly Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 46 “Metabolismus organické sloučeniny (nebo jedné její základní části) mikroorganismem, který není schopen využít sloučeninu jako zdroj energie (nebo živiny)”  Není spojen s růstem a není znám významný nutriční zisk  Získané organické produkty mohou se mohou hromadit  Uhlík není zabudováván do typických buněčných složek (odchází do odpadu) Kometabolismus Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 47 Kometabolismus je transformace organické sloučeniny organismy, které nejsou schopné tuto látku využívat jako zdroj energie. Nespecifické enzymy pro jeden substrát jsou schopné využívat i jiné látky, strukturně podobné (např. monooxygenasy) Vít Matějů Kometabolismus Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 48 Trichlorethylen (aerobně) Trinitrotoluen 1,1,1-trichlorethan MTBE Chloroform PCB Polyaromatické uhlovodíky a mnoho dalších Vít Matějů Kometabolismus Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 49 Kometabolická dehalogenace trichlorethylenu za aerobních podmínek Vít Matějů Kometabolismus Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 50 Existuje široký rozsah sloučenin, u kterých byl detekován kometabolimsus  Cyklohexan (na cyklohexanol)  PCBs  Některé chlorfenoly  3,4-dichloranalin  1,3,5-trinitrobenzen  Alachlor, Ordram, Propachlor  Chlorbenzen (3-chlorkatechol)  Parathion (4-nitrofenol)  DDT (DDE, DDD, DBP)  Propan (propionát, aceton)  Methyl flourid (formaldehyd) Kometabolismus Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 51  Enzym existující v organismu nastartuje degradaci řetězce, ale nepokračuje nebo ji nedokončí na „užitečné“ koncové produkty.  Produkty vznikající při počáteční degradaci později mohou inhibovat enzymy degradující řetězec nebo zastaví celkový růst organismu.  Organismus tak aktuálně potřebuje druhou látku způsobující požadovanou degradaci (druhý substrát působí například jako elektron donor). Proč kometabolismus probíhá ? Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 52 Analogie obohacování… …kde mineralizovatelná přidávaná sloučenina je strukturně podobná (analog) té, jejichž metabolismus zkoušíme podporovat – přídavek bifenylu na podporu metabolismu PCBs. Kometabolismus Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 53 Biphenyl dioxygenase + O2 TCA cycle Cl Cl COOH An aliphatic acid Benzoic acid CH CH C OH COOHCH2 Kometabolismus PCBs Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 54 COOH Biphenyl dioxygenase + O2 An aliphatic acid Benzoic acid TCA cycle Cl Cl CH CH C OH COOHCH2 Biphenyl dioxygenase O2 + COOH Cl CH C C OH COOHCH2 Cl A chlorinated aliphatic acid 4-Chlorobenzoic acid TCA cycle Kometabolismus PCBs Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 55 Nejdůležitější role mikroorganismů v biodegradaci je jejich schopnost detoxikace látek širokou škálou reakcí:  Hydrolýza (adice vody)  Hydroxylace (adice OH)  Dehalogenace (dechlorace – odstranění atomu Cl)  Demethylace (dealkylace) (odstranění Me skupiny)  Methylace  Nitro redukce  Deaminace  Štěpení etherů  Konverze nitrilu na amid  Konjugace Detoxikační reakce Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 56 Tyto reakce jsou katalyzovány enzymy, obvykle v buňce a přes řadu enzymatických kroků může být toxická látka rozložen a poté:  Meziprodukty (detoxifikované) mohou být vyloučeny.  Rozklad může pokračovat normální metabolickou cestou za ultimativního vyloučení C jako organického odpadu nebo jako CO2. Detoxikační reakce Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 57 OH Cl Cl Cl Cl Cl Pentachlor- fenol OCH3 Cl Cl Cl Cl Cl Pentachlor- anisol Detoxikační reakce Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 58 Typy biodegradačních reakcí: Dealkylace – biologické odstraňování methylu nebo dalších alkylů z dusíkového atomu Dealkoxylace – biologické odstraňování methoxy skupiuny z dusíkového atomu Dekarboxylace – biologické nebo abiotické odstraňování jednoho nebo dvou kyslíkových atomů z karboxylové skupiny Dehalogenace – biologická náhrada atomů chloru vodíkovým atomem (degradace chlorovaných insekticidů) Štěpení etherů – biologické štěpení etherů na vazbě mezi kyslíkem a uhlíkem Hydrolýza – biologické či chemické štěpení molekul adicí vody za vzniku alkoholů nebo karboxylových kyselin Hydroxylace – biologické zavádění hydroxylových skupin na alifatické nebo aromatické sloučeniny Biodegradace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 59 Typy biodegradačních reakcí: Methylace – biologická adice methylové skupiny na alkohol nebo fenol za vzniku methyl etheru Oxidace – biologická nebo chemická oxidace alkoholu za vzniku aldehydu, které mohou být oxidovány na karboxylové kyseliny – vznik epoxidů je hlavním krokem mnoha oxidačních procesů b – oxidace – biologické odstraňování dvou atomů uhlíku z alkánového řetězce vedoucí ke struktuře aromatického kruhu w – oxidace – počáteční atak alifatického řetězce na koncové methylové skupině, která je oxidována na mastné kyseliny Redukce – biologická redukce nitroskupiny na amino skupinu Štěpení kruhů – biologické štěpení aromatických kruhů Biodegradace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 60 Typy biodegradačních reakcí Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 61 Typy biodegradačních reakcí Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 62 Biodegradation - Hydrolysis Hydrolysis through enzymatically mediated nucleophilic attacks – uneven electron density due to heteroatoms – oxic or anoxic environment: Stacy Simonich Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 63 Biodegradation - Oxidation Oxidation using an electrophilic form of oxygen – even electron density – oxic environment: Stacy Simonich Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 64 Typy biodegradačních reakcí Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 65 Biodegradation - Reduction Reduction by a nucleophilic form of hydride or reduced metals like cobalt: Stacy Simonich Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 66 Biodegradation - Additions Additions using electrophilic carboxyl, nucleophilic hydroxyl, or free radical H-abstraction and addition of fumarate (even electron density – anoxic): Stacy Simonich Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 67 Biodegradace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 68 Biodegradace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 69 Biodegradace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 70 Biodegradace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 71 “Proces vzniku toxických produktů z neškodných prekurzorů.” Příklady: • Dehalogenace (TCE na vinyl chlorid nebo chloral hydrát) • Halogenace (Fenol na pentachlorfenol) • Tvorba nitrosaminu (Dimethylamin na N-nitrosodimethylamin) • Epoxidace (Aldrin na dieldrin) • Fosforothionát-fosfát konverse (Parthion na paraoxon, (S náhrada kyslíkem) ) • Oxidace thioetherů (-C-S-C- oxidace) • Hydrolýza esterů (Herbicidy na bázi esterů aktivace vodou) Ale také aktivace… Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 72 Aktivace benzo[a]pyrenu (B[a]P) O OH OH O OH OH Benzo[a]pyren Benzo[a]pyren- 7,8-epoxid Benzo[a]pyren- 7,8-diol Benzo[a]pyren- 7,8-diol-9,10-epoxid Vznik DNA aduktů Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 73 Cl Cl NH C O CH2 CH3 N-(3,4-dichlorophenyl)-propionamide Propanil CO2 + H2O + Biomass Cl Cl NH2 C O CH2 CH3HO 3,4-dichloro- aniline Cl Cl N N Cl Cl 3,3’,4,4’-tetrachloro- azobenzene Cl N H Cl Cl N N Cl Cl 4-(3,4-dichloroanilino)-3,3’,4’-trichloroazobenzene Polymerace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 74 Cl Cl Chloroaliphatic and chlorobenzoate degraders CO2 + H2O + Cl- COOH Cl CH C C OH COOHCH2 Cl A chlorinated aliphatic acid 4-Chlorobenzoic acid +PCB cometabolisers COOH Cl COOHClDesulfomonile tiedjei DCB-1 H2 + CO2 CH3COOH Strain BZ-2 CH4 Methanospirillum sp Mikrobiální konsorcia a biodegradace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 75 Látka je považována za „substrát “ a limituje bakteriální růst. Většina kinetických modelů kombinuje přenos hmoty (ze substrátu na biomasu) s jevem nasycení a jsou analogické nelineární kinetice Michaelis-Menten pro biotransformace. Biodegradace v sedimentech a půdách se často vyjadřuje biologickým poločasem života. Kinetika biodegradace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 76 Pokud je biologický poločas života látky nezávislý na její koncentraci, je degradační rychlostní rovnice rovnicí prvního řádu: dC / dt = - k * C = - (ln 2 / t1/2) * C Kde: C – koncentrace látky v mokrém sedimentu nebo půdě [mg.l-1] t1/2 – biologický poločas života [d] k – rychlostní konstanta biodegradace [d-1] pro mokrý sediment nebo půdu Kinetika biodegradace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 77 Pokud se půda (či sediment) skládají pouze z pórové vody a částic, celková koncentrace v mokré půdě může být vyjádřena: C = R * CS + Q * Cpw Kde: C – celková koncentrace v půdě [mg.l-1] R – hustota tuhé fáze [kg.l-1 soil] Q - objem frakce vodní fáze [l.l-1 soil] CS – koncentrace látky v tuhé fázi [mg.kg-1] Cpw – koncentrace látky v pórové vodě [mg.l-1] Kinetika biodegradace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 78 Biodegradace v systému tuhá fáze-voda závisí na sorpci degradovaných látek:  rozdělení látky mezi tuhou fázi a vodní fázi je řízeno termodynamickou rovnováhou,  biodegradace ve vodní fázi je relativně rychlejší, ale celková eliminace ze systému tuhá fáze-voda je řízena pomalou desorpcí. Kinetika biodegradace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 79 Ad 1) Koncentrace látky v pórové vodě Cpw může být nízká, protože rozdělovací koeficient KP (= CS / Cpw ) je vysoký. Eliminační rychlost biodegradace je relativně nízká, koncentrace v pórové vodě je úměrná celkové koncentraci v mokré půdě: Cpw = [1 / ( Q + R * Kp )] * C Kinetika biodegradace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 80 Ad 2) Za předpokladu, že látka je dostupná pro biodegradaci pouze ve fázi pórové vody, celková rychlostní konstanta biodegradace ve vlhké půdě (k) může být snadno odvozen z hodnot kpw – rychlostní konstanty prvního řádu pro biodegradaci ve fázi pórové vody a půdních charakteristik jako jsou R a Q. Rychlost rozkladu látky na objem mokré půdy (V * k * Q ) je rovna rychlosti rozkladu v pórové vodě (Q * V * kpw * Cpw): k = kpw / [1 + (r * KP)] r = R / Q kde: r - poměr suché hmoty k vodní [kg.l-1] Kinetika biodegradace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 81 Kinetika biodegradace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 82 Aerobní biodegradace a metabolické mechanismy Řada chemických látek může sloužit jako zdroj živin pro bakterie, jež jsou využity pro jejich růst a energetické požadavky. Důležitými reakcemi jsou oxidační procesy:  Aromatická oxidace – enzymy katalyzovaná oxidace s molekulárním kyslíkem – kruh je štěpen mezi nebo (na přilehlých vazbách) mezi uhlíky nesoucími OH skupiny. Aromatickou oxidací začíná vznik katecholu z benzenu nebo benzoátů, fenolů a dalších sloučenin.  w – oxidace – oxidace alifatických řetězců na koncové methylové skupině vedoucí přes primární alkoholy a odpovídající aldehydy ke karboxylovým kyselinám – zavedení kyslíku pomocí oxygenáz Biodegradace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 83 Aerobní biodegradace a metabolické mechanismy/II b – oxidace – postupná oxidace – po dvouuhlíkatých částích – mastných kyselin katalyzovaná enzymy; nejprve vzniká thioester karboxylové skupiny pomoci koenzymu A – odstraněním dvou H vznikají a,bnenasycené deriváty. Hydratací vzniká b-hydroxy- a dehydrogenací b-ketoderivát. Koenzym A (CoA) se aduje mezi a- a b-uhlíky, acetylCoA je odštěpen a vzniká CoA mastné kyseliny o dva uhlíky kratší. Tato reakce probíhá ve všech živých organismech a nepotřebuje molekulární kyslík. Reakce je stíněna methylem v a-poloze. Biodegradace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 84 Anaerobní Aerobní Mikrobiologie – finální akceptory elektronů Vít Matějů Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 85 CO2 + H2O + biomasa Aerobní metabolismus Vít Matějů Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 86 Hlavní principy aerobní degradace uhlovodíků Proces spojený s růstem Aerobní metabolismus Vít Matějů Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 87 Stechiometrie aerobního rozkladu uhlovodíků Oxidační reakce: C6H6 + 12 H2O → 6 CO2 + 30 H+ + 30 eRedukční reakce: 7,5 O2 + 30 H+ + 30 e- → 15 H2O 1 g C6H6 potřebuje na úplnou oxidaci 3 g O2 Vít Matějů Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 88 1. Metabolické procesy pro zlepšení kontaktu mezi bakteriální buňkou a organickým polutantem. Molekuly polutantu musí být dopraveny do buňky, protože bakterie nemají exoenzymy pro degradaci polutantů. Například syntéza biologických surfaktantů: Aerobní metabolismus Vít Matějů Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 89 2. Počáteční atak organického polutantu začíná oxidačním procesem, aktivací kyslíku a inkorporací kyslíku do molekuly polutantu. Všechny reakce jsou katalyzovány enzymy oxygenasami a peroxidasami. Aerobní metabolismus Vít Matějů Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 90 3. Periferní degradační cesta převádí organický polutant krok za krokem na meziprodukty centrálního metabolismu, například na trikarboxylové kyseliny. 4. Biosyntéza buněčné hmoty z prekurzorů vzniklých v centrálním metabolismu, např. acetylCoA, sukcinát, pyruvát. Cukry se syntetizují glukoneogenezí (syntéza glukosy v buňce de novo). Aerobní metabolismus Vít Matějů Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 91 Aerobní degradace n-alkánů Vít Matějů Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 92 Monooxygenasa do substrátu inkorporuje 1 atom kyslíku, druhý se redukuje na H2O Aerobní metabolismus Vít Matějů Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 93 Dioxygenasa inkorporuje do molekuly substrátu 2 molekuly kyslíku Aerobní metabolismus Vít Matějů Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 94 Prvním krokem je dioxygenasou katalyzovaný přenos dvou atomů kyslíku do molekuly naftalenu následovaný štěpením aromatického kruhu. U polyaromatických uhlovodíků s více aromatickými jádry to však funguje trochu jinak. Důvodem jsou termodynamické vlastnosti molekuly. Aerobní metabolismus Vít Matějů Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 95 dioly Aerobní degradace PAHs Vít Matějů Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 96 katechol Aerobní degradace monoaromatických uhlovodíků Vít Matějů Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 97 Aerobní degradace monoaromatických uhlovodíků Vít Matějů Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 98 Ortho a meta štěpení katecholu za aerobních podmínek je nejčastější finální metabolická cesta degradace aromatických uhlovodíků 1. Fenol monooxygenasa 2. katechol-1,2-dioxygenasa 3. Laktonizační enzym 4. Isomereasa mukonolaktonu 5. Oxoadipát enollakton hydrolasa 6. Oxoadipát sukcinylCoA transferasa 7. Katechol 2,3-dioxygenasa 8. Hydrolasa semialdehydu kyseliny mukonové 9. Hydrolasa oxopentoové kyseliny 10. Aldolasa 4-hydroxy-2oxovalerové kyseliny Aerobní rozklad Vít Matějů Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 99 Polutanty, které lze biologicky odbourávat za aerobních podmínek:  n-alkany  Alkeny  MTBE  Organické kyseliny  Aldehydy  Alkoholy alifatické  Fenoly  Katechol (dvojsytné fenoly)  Trichloethen  Dichloethyleny  Vinylchlorid  Monoaromatické uhlovodíky (benzen, toluen, ethylbenzen a xyleny)  Substituované alkany  Neutrální tuky  Kresol  Polyaromatické uhlovodíky do 4 až 5 kondenzovaných aromatických jader  Topný olej  Letecký petrolej  Chlorbenzeny  Aniliny  Substituované aniliny  a další . . . . . . Aerobní metabolismus Vít Matějů Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 100 Finální akceptor elektronů je jiný než kyslík: dusičnan, sulfát, Fe3+, vodík, oxid uhličitý, Mn4+… Anaerobní procesy jsou výrazně pomalejší než aerobní. Vzniká většinou mnohem větší množství vedlejších produktů (některé mohou být toxické) než při aerobním procesu Anaerobní metabolismus Vít Matějů Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 101 Probíhá v anoxických sedimentech, půdách nebo podzemních vodách. Přímá biodegradace látek za methanogenních podmínek. Stupeň mineralizace je počítán z měřeného množství produkovaného CO2 a CH4 podle rovnice: CCHYOY + [C – H/4 – Y/2]H2O  [C/2 + H/8 – Y/4]CH4 + [C/2 – H/8 + Y/4]CO2 Ve srovnání s aerobním mechanismem je omezen počet katabolických cest. Anaerobní biodegradace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 102 Tento mechanismus se využívá v biologických čistírnách odpadních vod (čištění, anaerobní stabilizace kalu..). Produkty vznikající primární degradaci v anaerobních reaktorech jsou většinou stabilní – aplikací kalu v zemědělství mohou kontaminovat půdu. Typický příklad: Reduktivní dehalogenace – jako produkty vznikají látky méně hydrofóbní. Reduktivní dehalogenace na aromatickém kruhu vyžaduje striktně anaerobní podmínky. Anaerobní biodegradace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 103 Biodegradace – reduktivní dehalogenace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 104 Využívají se specifické mikrobiální enzymatické systémy. Vyšší halogenované aromatické molekuly jsou méně persistentní než jejich níže halogenované kongenery – v půdách a sedimentech to může být ovlivněno změněnou biodostupností. U aerobní biodegradace je to opačné – více halogen atomů zamezuje přístupu kyslíku. Biodegradace je tedy obecně závislá na chemické struktuře a environmentálních podmínkách. Důvody pro environmnetální persistenci látek  Chemická struktura  Environmentální podmínky  Biodostupnost Anaerobní biodegradace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 105 --2 Finální akceptory elektronů Vít Matějů Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 106 Finální akceptory elektronů Vít Matějů Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 107 Prakticky se využívá při dehalogenaci substituovaných uhlovodíků a chlorovaných organických sloučenin. Nejznámnější je reduktivní dechlorace perchlorethylenu, který má uhlík v maximálním oxidačním stupni, takže ho oxidačně nelze rozkládat. Anaerobní metabolismus Vít Matějů Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 108 Anaerobní procesy se hojně využívají jako předúprava při ošetřování kontaminace polyhalogenovanými sloučeninami, například DDT, polychlorované dioxiny, PCB, chlorované pesticidy, polybromovaná zhášedla či TNT, RDX, HRX apod. DDT Anaerobní metabolismus Vít Matějů Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 109 Anaerobní metabolismus Vít Matějů Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 110 Reduktivní dehalogenací dojde ke změně molekuly, která je potom snáze biologicky odbouratelná. Samotné biologické čištění polyhalogenovaných sloučenin se proto provádí v sekvencích: anaerobní fáze – aerobní fáze Anaerobní rozklad n-alkanů a dalších alifatických uhlovodíků je možný, ale je tak pomalý, že nenašel praktického využití. Podmínky, za kterých může probíhat, se dosahují jen obtížně. Náklady na anaerobní čištění materiálů kontaminovaných ropnými uhlovodíky by byly velmi vysoké a trvaly by neúnosně dlouho. Anaerobní metabolismus Vít Matějů Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 111 Srovnání Vít Matějů Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 112 Přechod mezi aerobním a anaerobním metabolismem tvoří anoxické podmínky (koncentrace rozpuštěného kyslíku v podzemní vodě 0,1 mg.L-1až 0,5 mg.L-1). Při nízkých koncentracích kyslíku v prostředí vzniká tzv. anoxický stres, který způsobuje m.j. zvyšování specifické spotřeby kyslíku na odbourání jednotkového množství organického substrátu (až 10násobně). Tím se výrazně zvyšují náklady na eliminaci organických látek například při čištění odpadních vod ale i při sanacích. Anoxický stres Vít Matějů Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 113 Zdroje informací http://umbbd.msi.umn.edu/ University of Manitoba Biocatalysis/Biodegradation Database UM – BBD 1) 203 metabolických cest 2) 1405 reakcí 3) 1301 látek 4) 920 enzymů 5) 510 mikroorganismů 6) 246 biotransformačních pravidel 7) 50 organických funkčních skupin 8) 76 reakcí nafthalen 1,2-diooxigenasy 9) 109 reakcí toluendiooxigenasy 21.8.2011 Vít Matějů Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 114 Biodostupnost polutantů Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 115 Na stárnutí polutantů a snižování dostupnosti se podílí:  Sorpce na pevné částice půdy (jíl)  Sorpce na organické látky v půdě (huminové látky)  Difúze do mikropórů a makropórů  Odpar těkavých složek  Úbytek dobře odbouratelných složek znečištění Větrání (stárnutí) polutantu Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 116 Větrání (stárnutí) polutantu Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 117 1) v systémech s jedním polutantem: dochází při zvyšování kontaktního času mezi polutantem a půdou ke snižování biologické dostupnosti a odbouratelnosti 2) v systémech s více polutanty přítomnost dalších látek zpomaluje stárnutí a zvyšuje biologickou dostupnost polutantu 3) Sorbované molekuly jsou nejčastěji důvodem „reboundingu“ Větrání (stárnutí) polutantu Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 118 Rebounding Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 119 Rebounding Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 120 Vlastnosti bakterií podporující přenos hmoty:  tvorba biologických povrchově aktivních látek a jejich exkrece do prostředí  vznik struktur na povrchu buňky, které podporují emulgaci hydrofobních molekul polutantu  systém příjmu s vysokou afinitou k polutantu  zvýšená adhese buněk k pevnému nebo kapalnému substrátu Podpora přenosu hmoty Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 121 Biofilm Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 122 Podle biologické rozložitelnosti lze polutanty seřadit podle snižující se biologické rozložitelností: jednoduché alifatické uhlovodíky, paliva > monoaromatické uhlovodíky > alkoholy, estery > nitrobenzeny, ethery > chlorované uhlovodíky > polycyklické aromatické uhlovodíky > pesticidy. n-Alkany:  Nejsnáze molekuly C10 až C16  C1 až C4 jsou plynné, rozkládají je jen vysoce specializované bakterie  C5 až C9 jsou pro většinu mikroorganismů toxické Biodegradovatelnost polutantů Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 123 Zpřístupnění molekul polutantů pro buňky:  Přídavkem neionogenní povrchově aktivní látky (NPAL)  Částečná chemická oxidace PHENANTHRENE ANTHRACENE PYRENE DIESEL Podpora přenosu hmoty Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 124  Ohřev horninového prostředí (odporové ohřívání, vhánění páry…..)  Uvolnění sorpčních vazeb molekul polutantů ultrazvukem  Podpora tvorby biosurfaktantů Podpora přenosu hmoty Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 125 Podpora přenosu hmoty – tvorba biosurfaktantů Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 126 Biosurfaktanty Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 127  Všechny bakterie, které jsou schopné využívat nepolární substráty, mají schopnost biosurfaktant vytvářet a uvolňovat do prostředí  Bez biosurfaktantu by nebyly schopné dopravit substrát do buňky Molekula polutantu polární Molekula polutantu nepolární Micela neionogenní povrchově aktivní látky Biosurfaktanty Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 128 Biosurfaktanty Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 129  Přenos hmoty do buňky  Dostupnost molekul polutantu pro mikroorganismy (sorpce, rozpustnost)  Enzymatický aparát mikroorganismů  Tvorba toxických metabolitů  Inhibiční podmínky v prostředí (toxicita polutantů, pH, teplota, nedostatek vlhkosti, nedostatek finálních akceptorů elektronů, limitace makro a mikrobiotickými prvky …..)  Neschopnost odbourávat některé polutanty vedle sebe (např. toluen a chlorbenzen) Faktory omezující biodegradace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 130 Vymytí povrchově aktivní látkou Podpora vymytím Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 131 Nenasycená zóna Saturovaná zóna Rozdělení zbytkového znečištění Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 132 Galaktosa a glukosa pro E. coli Souhrn omezujících faktorů Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 133 Dead-end produkty pyrenu - houby Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 134 HOUBY Cytochrom P-450 peroxidasa BAKTERIE Diooxygenasa Odbourávání PAHs Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 135 1. PROBLÉM  Stanovení PAHs po extrakci nepolárními rozpouštědly  Biotransformační produkty jsou polární – nestanoví se, nastává pokles koncentrace PAHs - je to vyřešení problému ??? Skutečnost  Biotransformační produkty a dead-end produkty jsou ve vodě mnohem rozpustnější a tedy mobilnější, jsou však často i toxičtější než původní PAHs, takže zemina se sníženou koncentrací PAHs po biodegradaci je z hlediska životního prostředí mnohem škodlivější, má podstatně vyšší ekotoxicitu a genotoxicitu Důsledky tvorby dead-end produktů Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 136 2. PROBLÉM  Heterocyklické sloučeniny podléhají rovněž biotransformaci – vznikají toxičtější produkty  Pentachlorfenol tvoří v technické směsi jen 30 až 35 %, jsou tedy přítomny další kongenery – ale ty se nesledují (analyticky)  Vedlejší produkt z chlorace fenolu – polychlorované dioxiny!!!! Důsledky tvorby dead-end produktů Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 137  Často se stává, že rozklad polutantu není totální (nenastává mineralizace) Lineární alkylsulfonáty Biotransformace místo biodegradace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 138 Biotransformace místo biodegradace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 139  Nedochází k rozkladu až na H2O, CO2, k tvorbě biomasy a energie.  Dochází jen k biotransformaci molekul polutantu na nové sloučeniny, které jsou buď dead-end produkty, nebo nemohou být dále rozkládány vzhledem k podmínkám v prostředí  Tyto meziprodukty mohou mít mnohem nepříznivější vlastnosti pro životní prostředí než původní polutanty Biotransformace místo biodegradace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 140 < TOXICITA Biotransformace místo biodegradace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 141 Polychlorované dioxiny Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 142 Biotransformace může způsobit: 1) Vyšší toxicitu 2) Endokrinní disrupci 3) Mutagenitu 4) Další negativní vlastnosti podle druhu vzniklého metabolitu 5) Zvýšit polaritu a mobilitu v horninovém prostředí Biotransformace místo biodegradace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 143  Z pohledu degradované látky či spíše směsi látek  Z pohledů využívaných mikroorganismů  Z pohledu prostředí, ve kterém se má proces realizovat Bioremediace – co musíme znát ??? Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 144 Z pohledu degradované látky či spíše směsi látek:  Strukturu zájmové látky či směsi látek  Fyzikálně-chemické vlastnosti – persistenci/reaktivitu, rozpustnost, těkavost, tendenci ke kumulaci v abiotickém prostředí a potenciál pro bioakumulaci  Její/jejich koncentrace  Produkty degradace a jejich vlastnosti  Biodostupnost v daném prostředí Bioremediace – co musíme znát ??? Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 145 Z pohledů využívaných mikroorganismů  Jejich schopnost degradovat danou látku či směs látek  Životní optimální podmínky – živiny, vlhkost, pH, kyslík  Přítomnost látek toxických pro používané mikroorganismy nebo jejich konsorcia Bioremediace – co musíme znát ??? Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 146 Z pohledu prostředí, ve kterém se má proces realizovat  Sorpční schopnosti – ovlivnění biodostupnosti  Fyzikálně-chemické vlastnosti  Mechanické vlastnosti  Toxicita prostředí Bioremediace – co musíme znát ??? Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 147 Vít Matějů  Mikroorganismy pro nás nepracují proto, že my chceme, ale proto, že jim to přináší různé výhody, především energii pro množení a tvorbu biomasy a pro nezbytné fyziologické pochody  Pokud jim zlepšíme podmínky v prostředí, pracují o to lépe. Zásady pro využívání mikrobiálních technologií Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 148  Pseudomonas sp.  Burkholderia sp.  Xanthomonas sp.  Acinetobacter sp.  Micrococcus sp.  Rhodococcus sp.  Ralstonia metallidurans  Deinococcus radiodurans  Arthrobacter sp.  Sphingomonas aromaticivorans  Nocardia sp.  Comamonas sp. Vít Matějů Bakterie využívané při sanacích Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 149 Bakterie rodů Xanthomonas sp. a Burkholderia sp. jsou schopné využívat > 100 chemických sloučenin jako substrát. Rhodococcus sp. – lipofilní složky buněčné stěny (peptydoglykan) usnadňují transport lipofilních polutantů do buňky. Vytvářejí biosurfaktant. Jsou schopné velkého množství metabolismů. Vít Matějů Bakterie využívané při sanacích Rhodococcus Xanthomonas Burkholderia Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 150 Pro biologickou sanaci se jen výjimečně využívá jediný bakteriální kmen. Prakticky vždy se jedná o vznik bakteriálního konsorcia, které je vytvořeno vnesenými aktivními kmeny a kmeny vzniklými pod selekčním tlakem kontaminace v prostředí. Mikrobiální konsorcium dehalogenující tetrachlorethan Vít Matějů Mikrobiální sanace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 151 1) Screening Level Methods  determine inherent & ready biodegradability  applicable mainly to sewage and soils  unrealistically high ratio of test substances to biomass  non-specific (indirect) detection methods  used for registering new chemicals in Europe & Japan 2) Realistic Methods  determine ultimate & practical biodegradability (kinetics)  applicable to all relevant environmental compartments  realistic ratio test substance to biomass  utilize radiolabeled test substances  specific detection methods Stacy Simonich *from TWF – P&G Biodegradability Test Methods Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 152 Ready tests Highly standardized batch systems Low level of inoculum (no pre-exposure) High test substance concentration (risk for toxicity) Test material is sole carbon & energy source Non-specific analytical methods  Oxygen consumption (indirect)  DOC disappearance  CO2 evolution Pass Criteria  DOC Loss exceeding 70% in 28 days or  Oxygen consumption or CO2 evolution exceeding 60% in 28 days And these levels must be reached within 10 days of biodegradation exceeding 10% (Ten day Window) Stacy Simonich *from TWF – P&G Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 153 Ready Test CO2 - Free Air BOD Water 1% Settled Activated Sludge Test Material (10 - 20 mg ) 0.5 N Ba(OH)2 CO2 TITRATION CO2 % Mineralized = CO2 Test - CO2 Blank ThCO2 x 100 Stacy Simonich *from TWF – P&G Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 154 Realistic radiolabeled (14C, 3H and 35S) testing – design considerations  Based upon known chemistry, test the chemical species most likely to enter the environment  Based upon known physical/chemical properties, test in the compartments in which the material will most likely reside e.g. most relevant compartment for slow-degrading, sorptive polymer = soil  Dose the chemical in a relevant environmental form  Choose test concentrations based upon likely environmental concentrations estimated from usage information and modeling  Position the radiolabel in the portion of the molecule most resistant to biodegradation. AES (Alkyl Ethoxylate Sulfate) C14E3S n-C14H29O O O * * * * _ *Position of Radiolabel OSO3 Stacy Simonich *from TWF – P&G Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 155 Activated sludge die-away test 1.5 N KOH BioActive & Abiotic Activated Sludge 14C- Test Material (ppb-ppm) 15 ml subsamples Flash Frozen & Lyophilized Rad-TLCExtract Methanol:Water (80:20) LIQUID SCINTILLATION COUNTING Evolved 14CO2 BIOMASS BIOMETER FLASK 1.5 N KOH LIQUID SCINTILLATION COUNTING Dissolved 14CO2 PARENT METABOLITES Acidification Extracted Sludge BIOFRAX Stacy Simonich *from TWF – P&G Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 156 Continuous Activated Sludge System Air Lift Effluent Air Vent 14CO2 Traps Wastewater 14C Test Chemical 14C Parent & Metabolites by Rad-TLC Total 14C Clarifier Aeration Vessel Sludge Return - Realistic Test Concentration - SRT = 5 - 7 Days - HRT = 6 - 8 Hours Cinfluent - Ceffluent Cinfluent % Removal = X 100 Sludge Parent Metabolites Biomass *from TWF – P&G Stacy Simonich Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 157 Effluent in river water die-away test 1.5 N KOH Effluent River Water 14C- Test Material (ppb) BioActive & Abiotic 15 ml subsamples Flash Frozen & Lyophilized Rad-TLC Acidification Extract Methanol:Water (80:20) Filtration (0.4 um) Filtrate LIQUID SCINTILLATION COUNTING Evolved 14CO2 Filter LSC BIOMASS BIOMETER FLASK 1.5 N KOH LIQUID SCINTILLATION COUNTING Dissolved 14CO2 PARENT METABOLITES Acidification *from TWF – P&G Stacy Simonich Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 158 Converting Biodegradation Test Data to Rate Constants  If chemical passes Ready Test (including 10-day window) assume rate constant = 1 hr-1  If chemical passes Ready Test (but not 10-day window) assume rate constant = 0.3 hr-1  If chemical passes an inherently biodegradable test - assume rate constant = 0.1 hr-1  If chemical biodegrades in a realistic test at realistic concentrations (14C) - use measured rate constant Stacy Simonich Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 159 Biodegradability Test for Soil  OECD 304A – Inherent Biodegradability in Soil  Evaluation of mineralization rate of a 14C labeled compound in soil  50 g soil sample spiked with 14C compound and mixed, experiment run up to 64 days  14CO2 trapped in alkali solution  If compound vapor pressure > 0.0133 Pa polyurethane foam used to trap volatilized compound  14CO2 evolution measured over time Stacy Simonich Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 160 Estimating Probability of Biodegradation – BIOWIN  Estimates probability of rapid biodegradation  Training set = 295 chemicals, 186 classified as “biodegrades rapidly” (dependent variable = 1) and 109 classified as “does not biodegrade rapidly” (dependent variable = 0)  Probability > 0.5 then biodegrades fast; probability < 0.5 does not biodegrade fast  Multiple linear and nonlinear regressions of dependent variables against 37 independent variables (36 structural fragments + molecular weight): Stacy Simonich Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 161 BIOWIN Structural Fragments and Coefficients Stacy Simonich Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 162 Organismy v prostředí jsou v kontaktu s řadou látek, jež mohou mít potenciálně škodlivé účinky. Řada těchto látek je přijímána organismy. Vyšší koncentrace určitých látek v organismu mohou ovlivňovat jeho funkce. Organismus má dvě cesty pro eliminaci látek:  látka je vyloučena v nezměněné podobě  látka je v organismu transformována a v této změněné podobě je vylučována – biotransformace Biotransformace ovlivňuje osud látky snížením jejího množství konverzí na nový typ xenobiotika – metabolit. Biotransformace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 163 Biotransformace může být definována jako enzymaticky katalyzovaná konverze jedné chemické látky (xenobiotické, odpadní produkty organismu) v jinou. Vlivy biotransformací na xenobiotika Všeobecně – biotransformace vede ke konverzi rodičovské látky na ve vodě rozpustnější formu – hydrofilnější látka může být snadněji vyloučena z organismu než látka původní. Biotransformace ovlivňuje také toxicitu látky:  transformace na toxičtější formu – bioaktivace,  snížení toxicity - detoxikace Biotransformace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 164 Mechanismy biotransformací xenobiotik v živých organismech Prostředí Xenobiotika v organismu Superhydrofóbní Hydrofóbní Polární Hydrofilní Akumulace v tukové tkáni Fáze I Bioaktivace nebo detoxikace Oxidace, redukce, hydrolýza Fáze II Bioaktivace nebo detoxikace Konjugace Vylučování Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 165 Biotransformace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 166 Typy biotransformačních reakcí Dva typy: Fáze I - nesyntetické reakce – hydrolýza, oxidace, redukce – molekuly látky jsou měněny zaváděním polárních skupin (OH, -COOH, -NH2) – produkty jsou reaktivní látky snadno konjugující ve fázi II Fáze II – syntetické reakce – konjugace – tvorba glukuronidů, sulfátů, acetyl a glutathion konjugátů – výsledkem je konjugovaný produkt schopný exkrece Biotransformace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 167 Biotransformace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 168 Biotransformace Probíhá v játrech Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 169 Biotransformace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 170 Biotransformace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 171 Typy biodegradačních reakcí Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 172 Biotransformace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 173 Biotransformace Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 174 Typy biodegradačních reakcí Research Centre for Toxic Compounds in the Environment http://recetox.muni.cz 175 Biotransformace