2. P L Y N O V Á CH R O M A T O G R A F I E (GC) Stanovení methylalkoholu CH[3]OH v konzumním destilátu pomocí GC Plynová chromatografie (GC) je vysoce účinná separační metoda pro stanovení plynných látek nebo látek, které lze zplynit. Je založena na rozdílu v distribuci oddělovaných látek mezi dvě nemísitelné fáze – mobilní a stacionární. Hnací silou je proud inertní mobilní fáze. Stacionární (nepohyblivá) fáze interaguje se složkami vzorku, který je unášen mobilní plynnou fází, a proto se při pohybu zdržují. Na konec stacionární fáze se tedy dostávají dříve složky méně zadržované. Síla interakce látky se stacionární fází je přímo úměrnápočtu uhlíků v molekule. GC se používá pro směsi, které jsou teplotně stálé, ale současně i těkavé. Methanol vzniká hydrolýzou pektinů ovoce, které bylo použito ke kvašení, proto je přítomnost metanolu v ovocných destilátech naprosto přirozená, takže v nich naše i evropská norma stanovuje povolený obsah 12 gramů metanolu na litr čistého alkoholu, což je šest gramů metylalkoholu v litru 50% ovocné pálenky. Kvalitní potravinářský líh k výrobě lihovin obsahuje max. jen 0,5 g metanolu v 1 l čistého (tj. 100% lihu). Jiným méně významným zdrojem methanolu v destilátech může být rozklad dalších přirozených složek ovoce, zejména anthokyanových barviv a podobných látek při kvašení zejména barevného ovoce. Obsah methanolu v destilátu může být také ovlivněn také způsobem destilace, kdy oddělením většího objemu první části destilátu, tzv. úkapu, dochází ke snížení obsahu methanolu v destilátu. Ovocný destilát je velmi složitou směsí desítky až stovek sloučenin jejíchž přítomnost díky azeotropii, či jejich absence rozhoduje o čichovém či chuťovém vjemu daného destilátu. Jednotlivé ovocné destiláty mohou např. obsahovat stopová množství následujících látek: 2-propylalkohol, 2-butanol, octan ethylnatý, isobutanol, ethylpropionát, isohexanol, 3-methylbutanol, n-butanol apod. Hranice nebezpečnosti methylalkoholu pro člověka je individuální, ale v destilátech významně převládá ethanol, který je metabolizován přednostně. Případy úmrtí nebo významného poškození zdraví proto nemohou být způsobeny lihovinami vyrobenými kvasnou cestou, ale přídavkem methanolu do lihoviny nebo úplnou záměnou kvasného lihu za methanolpři výrově lihovin. Důležité pokyny: · uzávěry tlakových láhví otevírat vždy po směru hodinových ručiček · nastřikovat vždy až po rozsvícení červené kontrolky Ready na předním panelu plynového chromatografu · metoda nástřiku - stříkačku vždy propláchnout destilovanou vodou, poté několikrát analyzovaným roztokem, po promytí nasát požadované množství vzorku → nástřik provést co nejrychleji · uzávěry tlakových láhví uzavíráme vždy proti směru hodinových ručiček · plynový chromatograf můžeme vypnout, až teploty detektoru (DET 1) a nástřikového prostoru (INJ 1) klesnou pod 50 °C Kvalitativní charakteristikou látky je retenční čas t[r], popř. redukovaný retenční čas t[r]´= t[r] - t[0], kvantitativní charakteristikou látky je výška píku h[max], popř. plocha píku A Mírou účinnosti kolony je počet efektivních teoretických pater N[ef]: Mírou separace dvou píků je rozlišení R[s]: ( např. hodnota R[s] = 1 udává, že dva stejné píky vykazují jen 2% překryv. Při R[s] = 1,5 považujeme píky za kvantitativně odseparované) Pracovní podmínky: · plynový chromatograf YL 6100GC · kolona: typ CARBOWAX, délka 30 m, vnitřní průměr 0,25 mm, tloušťka sorbentu 0,25 µm · nosný plyn N[2] – průtok přes kolonu 1 ml/min · detektor: plamenově ionizační (FID · metoda 3 – GC3 (FID - průtok: H[2] 30 ml.s^-1, vzduch 300 ml.s^-1, tepelný program kolony: 50 °C (3,5 minuty), 40 °C/min, 180 °C (0 minut) ≈ 6,8 minut + 6 minut chlazení; celkový čas cyklu ≈ 12,8 minut, teplota nástřikového prostoru 200 °C, teplota detektoru 220 °C, split (rozdělovací poměr nástřiku) 1/100) 2.1. Stanovení času, za který projde kolonou mobilní fáze (tzv. mrtvý čas) Mrtvý čas kolony t[M] je retenční čas analytu, který není v koloně zadržován, tj. analytu, který se pohybuje kolonou stejnou rychlostí jako mobilní fáze. Všechny analyty stráví v mobilní fázi stejný čas - mrtvý čas kolony. Tab.1. Stanovení mrtvého času kolony název V[nástřik] (µl) t[R ](min) A (mV.s) h (mV) w (min) w[05] (min) methan 1 2.2. Příprava kalibračních roztoků methylalkoholu Ze zásobního roztoku methylalkoholu o φ[%](MeOH)[ ]=100% v/v napipetovat do 100 ml odměrných baněk následující množství methanolu tak, abychom získali kalibrační roztoky o obsahu methanolu 0,025 %, 0,035 %, 0,045 %, 0,055%, 0,065% (v/v). Poté odměrné baňky doplnit po rysku destilovanou H[2]O a umístit na cca 5 min do ultrazvukové lázně. Tab.1. Kalibrační závislost pro methanol č. V[pip] (µl) t[R ](min) φ[%](MeOH)[ ] v % v/v A (mV.s) h (mV) w (min) w[05] (min) N[ef] 1. 25 0,025 2. 35 0,035 3. 45 0,045 4. 55 0,055 5. 65 0,065 2.3. Příprava vzorku konzumního destilátu a) do odměrné baňky na 10 ml napipetovat 1 ml vzorku konzumního destilátu a doplnit destilovanou vodou po rysku. Roztok umístit na 5 min do ultrazvukové lázně. b) do odměrné baňky na 10 ml napipetovat 1 ml vzorku konzumního destilátu a 40 µl (příp. 50 µl) standardu methanolu, doplnit destilovanou vodou po rysku. Roztok umístit na 5 min do ultrazvukové lázně. Tab.3. Stanovení obsahu methanolu v neznámém vzorku č. V[vz] (µl) V[st] (µl) c[st] (%) t[R ](min) A (mV.s) h (mV) w (min) w[05] (min) 1. 0 2. 40 2.4. Příprava roztoků směsi alkoholů Ze zásobních roztoků alkoholů (aceton, methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol a isobutanol) připravit do 100 ml odměrných baněk dva směsné roztoky ve vodě (obsah jednotlivých látek 0,05 % v/v). 1. roztok – do 100 ml odměrné baňky napipetovat posptupně 50 µl methanolu, ethanolu, isobutanolu a n-propanolu. Doplnit destilovanou vodou po rysku a umístit na 5 min do ultrazvukové lázně. 2. roztok – do 100 ml odměrné baňky napipetovat postupně 50 µl methanolu, ethanolu, isobutanolu, isopropanolu a acetonu. Doplnit destilovanou vodou po rysku a umístit na 5 min do ultrazvukové lázně. 2.5. Měření methylalkoholu Měření provést dle následujícího postupu. Nejprve proměřit nástřik 1 µl methanu (stanovení mrtvého času), který je třeba nasát do injekční mikrostříkačky (např.Hamilton) z plynového ventilu na laboratorním stole v laboratoři. Poté stejným způsobem proměřit jednotlivé vzorky. Postup měření CH[3]OH pomocí plynového chromatografu YL 6100GC: 1. Otevřít postupně ventily všech plynů (první otevíráme dusík – první tlaková láhev vlevo) 2. Plynový chromatograf YL 6100GC uvést do provozu stiskem tlačítka ON na zadním panelu přístroje, na počítači spustit program YLClarity 3. Kliknout na ikonu Login pod nápisem Instrument 1, po otevření okna vybrat možnost Student → heslo Slivovice → OK 4. Vybrat File → Open method... → metoda 1 – start.met → OK 5. Poté kliknout na ikonu Control (Přímé řízení GC/LC) → Apply → OK (metoda se tímto způsobem pošle do GC a přístroj začne pracovat) 6. Po rozsvícení červené kontrolky Ready na předním panelu přístroje GC vybrat File → Open method... → metoda 2 - vyhrivani.met → OK 7. Poté kliknout na ikonu Control (Přímé řízení GC/LC) → Apply → OK 8. Po opětovném rozsvícení červené kontrolky Ready na předním panelu přístroje GC vybrat File → Open method... → dle pokynu vyučujícího vybrat metodu 3 – GC 1 až 4.met → OK 9. Vybrat ikonu Control (Přímé řízení GC/LC) → Apply → OK 10. Během čekání na rozsvícení červené kontrolky Ready si připravit potřebné roztoky 11. Před prvním nástřikem provést kontrolu funkčnosti detektoru: nad detektor přiložit sklíčko, pokud se zarosí, vše je v pořádku a je možné dále pokračovat dle návodu, pokud se sklíčko nezarosí, přivolat na pomoc vyučujícího 12. Před nástřikem vždy rozkliknout ikonu Single Analysis (Jednotlivá analýza Start/Stop) → vypsat informace ke vzorku do kolonek Sample ID (vaše jméno a příjmení), Sample (stručný popis vzorku), Inj. Volume (objem nástřiku) a do pole Counter napsat 1 → vyčkat na rozsvícení červené kontrolky Ready 13. Provést nástřik 1 μl vzorku a na GC „ihned“ stisknout tlačítko Start (na GC se rozsvítí zelená kontrolka Run) 14. Průběh separace můžeme sledovat po rozkliknutí ikony Data Acquisition (Sledování analýzy) – pro sledování průběhu separace je vhodné nastavit rozsah pomocí ikony Signal range cca od 0 do 300 mV pro stanovení mrtvého času, cca od 0 do 1500 mV pro jednotlivé vzorky (tato hodnota se může lišit) 15. Po ukončení analýzy v okně chromatogramu určit pořadí jednotlivých analytů na základě očekávaného chování v GC systému s plamenoionizačním detektorem a ve vertikální nástrojové liště kliknout na ikonu > a vyřadit nepotřebné píky ve vybraném intervalu z integrace 16. Upravený chromatogram uložit pomocí funkce File → Print to PDF. Po uložení chromatogramu zavřít dialogové okno chromatogramu i okno sledování průběhu analýzy 17. Provést měření pro další vzorky dle postupu od bodu 12, před nástřikem vždy vyčkat na rozsvícení červené kontrolky Ready 2.6. Metody stanovení methylalkoholu v konzumním destilátu 2.6.1. Metoda kalibrační přímky Metoda založená na sestrojení grafické závislosti měřené veličiny na zvyšující se koncentraci kalibračních roztoků o známé koncentraci. Z této kalibrační křivky se hodnota hledané veličiny neznámého vzorku odečte. Použití metoda kalibrační křivky je oprávněné v případě, že všechny vzorky a standardy jsou si svými vlastnostmi rovnocenné, tzn. že lze zanedbat vliv matrice vzorku. POSTUP: Z jednotlivých chromatogramů pro stanovení methanolu je třeba si opsat následující položky pro vytvoření kalibrační závislosti v Excelu: retenční čas t[R] v min, plochu píku A v mV·s, výšku píku h v mV, šířku píku w[0,5], [ ]w je třeba dopočítat. Ze získaných hodnot sestrojit kalibrační závislost pro jednotlivé objemové koncentrace methanolu a z rovnice regrese vypočítat obsah methanolu ve vzorku konzumního destilátu (je nutné počítat také s ředěním vzorku) 2.6.2. Metoda přídavku standardu Metoda přídavku standardu předpokládá splnění podmínky linearity kalibrační závislosti mezi plochou píku a stanovovanou koncentrací. Její výhodou je eliminace vlivu matrice. Ke stanovovanému vzorku se přidá známé množství téže látky, u které se má stanovit neznámá koncentrace. Vždy se musí udělat nejméně dva nástřiky vzorku – při prvním se dávkuje přesné množství vzorku, při druhém se dávkuje přesné množství směsi. Koncentraci obsahu methanolu v neznámém vzorku při přídavku jednoho standardu ke vzorku je třeba určit podle následujícího vzorce: a) v případě, že, matrice a celkový objem je konstantní (tj. odm. baňka je doplněna po rysku) – tzv. metoda dvou roztoku b) v případě, že celkový objem není konstantní – tzv. metoda jednoho roztoku kde: c[vz] je koncentrace analytu ve stanovovaném vzorku, c[st] je koncentrace standardu, V[vz] je objem stanovovaného vzorku, V[st] je objem přidaného standardu, A[vz] je plocha píku stanovovaného vzorku, A[vz+st] je plocha píku stanovovaného vzorku a standardu. 2.7. Ukončení analýzy 1. Požádat vyučujícího o kontrolu naší práce 2. Kliknout na File → Open method ... → metoda 4 - ukonceni.met → OK 3. Poté kliknout na ikonu Control (Přímé řízení GC/LC) → Apply → OK 4. Vyhledat chromatogramy potřebné pro zpracování protokolu, tj kliknout na Počítač → Systém (C:) → YLClarity → Koralka → Data 5. Než se přístroj ochladí, vypnout PC a uklidit pracovní stůl 2.8. Vyhodnocení analýzy V protokolu uvést všechny výpočty, přiložit grafy vybraných chromatogramů s popisem (tj. chromatogramy stanovení mrtvého času, směsného roztoku č. 2, konzumního destilátu) a graf kalibrační závislosti: 1. Z nástřiku methanu určit mrtvý čas. 2. Z jednotlivých chromatogramů určit a uvést do tabulky pro jednotlivé látky retenční časy, plochy, výšky a šířky signálů w a w[05]. 3. Sestrojit graf log t[r]´ vs. počet uhlíkových atomů v molekule n-alkoholů. 4. Zjistit účinnost kolony pro separované látky na základě počtu teoretických pater. 5. Vypočítat rozlišení mezi dvěma signály (píky), které mají mezi sebou nejmenší rozdíl retenčních časů (rozlišení pro dva nejbližší signály). 6. Určit procentuální množství methanolu ve vzorku pomocí metody kalibrační křivky a metodou přídavku standardu. 7. V následné diskuzi porovnat mezi sebou obě metody a zdůvodnit případné rozdíly.