16/11/16	
1	
Enzymy
•  Biokatalyzátory
•  Snižují aktivační energii potřebnou pro chemickou reakci
•  V klinické biochemii se enzymy používají: ! pro diagnostické účely
! jako reagencie
Názvosloví
! triviální / historické TRYPSIN
! obecně užívané α-AMYLASA ( AMS)
! vědecké 1,4-α-D-glukanglukanohydrolasa EC 3.2.1.1.
!faktory ovlivňující enzymovou reakci :
TEPLOTA, pH, koncentrace SUBSTRÁTU, koE,...
často se volí kompromis mezi optimálními
podmínkami, cenou, technickými požadavky
Enzymy jako analytická činidla
vo
[S]
V/2
V
Rovnice Michaelis-Mentenové:
[S]+Km
[S].V
=v
[S]<<Km,	 																							=	konst.[S]	
	
v =
V . [S]
Km
n  End-point (reakce musí být rychlá a citlivá)
S P
E
P’
n  Kineticky (většinou metoda konstantního času)
vo
[S]
V/2
VRovnice	Michaelis-Mentenové:	
	
	
[S]+Km
[S].V
=v
Km
[S]	>>>	Km, 		v		=	Vlim	
	
Ideálně: [S] ≥ 100 Km
cena, rozpustnost, inhibice nadbytkem substrátu, …
Enzymy diagnostické markery
16/11/16	
2	
Možnost sledování enzymové aktivity
n  Substrát či produkt dokážeme specificky detegovat přímo
Pokud ne, následuje druhá.. (obvykle opět enzymová)
detekční (indikátorová) reakce
n  Indikátorová reakce NESMÍ určovat (limitovat) rychlost
vzniku/zániku detekovaného produktu/substrátu !!!
musí být vždy „rychlejší“ než primární reakce,
která určuje původní koncentraci substrátu či aktivitu
stanovovaného enzymu
Možnost sledování enzymové aktivity
n  Nejčastěji používané (indikátorové) reakce
1) H2O2 – vzniká při reakcích oxidas (využívají k oxidaci O2)
Substrát + O2 Produkt + H2O2
H2O2 + chromogen barevný produkt
V klinické diagnostice nejčastěji 4-aminoantipyrin
+ subst. fenol ⇒ CHINONIMIN (červený, 555 nm)
XO
POD
Možnost sledování enzymové aktivity
2) NADH, NADPH- Warburgův optický test 340 nm
O	 O	
+	
CH	
2	
O	 P	
O	
C	
N	
O	
NH	
2	
O	
-	
O	 O	
O	
-	
O	
P	 CH	
2	 N	
N	N	
N	
NH	
2	
OH	 OH	 OH	OH	
NH	
2	
O	
C	
N	
+	
H	
NH	
2	
O	
C	
N	
H	H	
+	 	H	
+	
+	2	[H]	
-	2	[H]	
substrátred + NAD+
produktox + NADH + H+
oxidoreduktasa
(dehydrogenasa)
16/11/16	
3	
Možnost sledování enzymové aktivity
2) využití hydrolyzovatelného chromogenního substrátu
(pro hydrolasy)
většinou nitrofenylderiváty à intenzivně žluté nitrofenoly
2-nitrofenyl-galaktosid
O
CH2OH
O
O2N
O
CH2OH
O2N
HONa
+
β-galaktosidasa
bezbarvý
žlutý
Enzymy jako analytická činidla
vo
[S]
V/2
V
Rovnice Michaelis-Mentenové:
[S]+Km
[S].V
=v
[S]<<Km 	 				=	konst.[S]	
	 Km
[S].V
=v
n  End-point (reakce musí být rychlá a citlivá)
S P
E
P’
n  Kineticky (většinou metoda konstantního času)
Enzymy - stanovení
1) Dvoubodové stanovení („metoda zastaveného času “)
fotometrické sledování změny absorbance (přírustek produktu
nebo úbytek substrátu) za časovou jednotku (nevíme, co se v
reakční směsi děje !), většinou v daném čase zastavujeme
enzymovou reakci (např. denaturace a kolorimetrické
vybarvení produktů)
A2 – A1
t2 - t1
ΔA/Δt =
A1, t1 většinou rovny 0
(počátek)
16/11/16	
4	
Enzymy - stanovení
1) Dvoubodové stanovení („metoda zastaveného času “)
fotometrické sledování změny absorbance (A) za časovou
jednotku
podmínka:
! konstantní rychlost ( kinetika 0.řádu)
! vždy kontrolovat průběh reakce !
t.j. rychlost reakce
2) „ KINETICKÁ“ stanovení („metoda tangent“)
fotometrické sledování tvorby produktu nebo úbytku
substrátu v čase (dA/dt)