C7250 Charakterizace proteinů hmotnostní spektrometrií Příprava vzorku pro MS analýzu Gabriela Lochmanová a Hana Konečná Studijním ateriály Proteomický experiment buňky,tkáň Separace proteinů proteolytické štěpení m/z izolovaný protein MS Separace peptidů Bottom-up 2/celkem Studijním ateriály Faktory ovlivňující výsledek MS Kvalita a reprodukovatelnost přípravy vzorku Instrumentace Vyhodnocení dat 3/celkem Studijním ateriály 4/celkem Rozmanitost vzorku Protein extraction = “more of an art than a science” Obecné principy izolace: • Rozrušení buněk – lyzační pufry, mechanicky • Další postup dle povahy cílového proteinu: - srážení (např. aceton, TCA) - změna pH - změna koncentrace soli, imunoprecipitace… Studijním ateriály Mechanické přístupy rozbití membrán Přístup Nástroj /Pomůcka/Přístroj Princip Mechanický mixér Rozmělnění buněk/tkáně Homogenizace v roztoku Homogenizátory (Dounce Homogenizer, PotterElvehjem Homogenizer) French Press Buněčná či tkáňová suspenze protlačena úzkým otvorem Sonikace Ultrazvukový homogenizátor Rozbití buněk pomocí ultrazvukových vln Zmražení/rozmražení Mrazák či suchý led s EtOH Buňky jsou rozbity ledovými krystaly vznikajícími opakovanými cykly zmražování a rozmražování Manuální rozmělnění Miska a tlouček Rozmělnění rostlinné tkáně v tekutém dusíku 5/celkem Studijním ateriály 6/celkem • Jemnější a jednodušší přístup v porovnání s mechanickým rozbitím buněčných membrán (může být i v kombinaci s homogenizací či mechanickým rozmělněním) zpravidla jemnější s nižšími denaturačními účinky Rozbití membrán pomocí lyzačních roztoků Volba lyzačního roztoku s ohledem na kompatibilitu s následným zpracováním vzorku a jeho analýzou • Rozrušení lipidové vrstvy solubilizací proteinů a narušením interakcí lipid:lipid, protein:lipid a protein:protein • Složení lyzačního roztoku: detergent + pufr + další reagencie (specifické dle typu vzorku: chaotropní činidla, soli, inhibitory proteáz a enzymů odstraňujících modifikace, redukční činidla…) Detergenty – ionogenní (kationtové/aniontové) – silné solubilizační a denaturační účinky – zwitteriontové – neiontové • Vliv teploty Studijním ateriály MS analýza proteinového vzorku 7/celkem Cílový protein přítomen v komplexní směsi: •Abundantní komponenty – potlačení signálů nízkoabundatních Dynamický rozsah koncentrace proteinů v biologickém vzorku může překročit 10 řádů •Ionizace velkých molekul probíhá optimálně v přibližně vyvážených množstvích komponent •MS spektrum z komplexní směsi - překrývání množství komponent Požadavek: čistý vzorek s omezenou komplexitou Cíl MS: • Analýza proteinů v komplexní směsi • Analýza cílového proteinu/cílové skupiny proteinůStudijním ateriály 10 000km 100km 10km 10cm 1 000km 1km 100m 10m 1m 1cm Prefrakcionace a obohacení nízkoabundantních proteinů = efektivnější identifikace a studie cílového proteinu 8/celkem Studijním ateriály 9/celkem MS analýza proteinového vzorku Snížení komplexity vzorku Subcelulární frakcionace Frakcionace na úrovni proteinu Frakcionace na úrovni peptidu Separace Deplece Obohacení Studijním ateriály 10/celkem Buňky v kultivačním médiu Buněčný lyzát – charakter dle povahy lyzačního pufru (v případě jemnějších lyzačních podmínek zachovány intaktní organely) Povrchově vázané proteiny Proteiny sekretované do kultivačního média (sekretom) Odstranění buněk a buněčných zbytků Membrány Cytoplasma Odebrání buněk Buněčná lýze Jaderné proteiny Mitochondriální proteiny Cytosolární proteiny Izolace buněčných kompartment Membránové proteiny MS analýza proteinového vzorku Snížení komplexity: Subcelulární frakcionace hydrofobicita, bazicita, velikost Specifické detergenty pro selektivní extrakci membránových proteinů - separace od cytosolárních hydrofilních proteinů Studijním ateriály 11/celkem Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů MS analýza proteinového vzorku Frakcionace Proteinů = Separace komplexních proteinových směsí Deplece abundatních proteinů Obohacení nízkoabundatních proteinů proteinový vzorek komplexní proteinový vzorek jednoduchý ~ Studijním ateriály 12/celkem Frakcionační metoda Fyzikálně-chemický parametr Centrifugační metody Ultracentrifugace Hustota Elektroforetické metody Gelová elektroforéza Velikost/náboj Izoelektrická fokusace Izoelektrický bod Kapilární elektroforéza Velikost/náboj Chromatografické metody Reverzní fázová kapalinová chromatografie Hydrofobicita Iontoměničová chromatografie Náboj Afinitní chromatografie Specifická biomolekulární interakce Gelová chromatografie Velikost molekul Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů MS analýza proteinového vzorku Studijním ateriály Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů 2D SDS-PAGE MS analýza proteinového vzorku 2D SDS-PAGE: • 1. rozměr = Izoelektrická fokusace (IEF) - elektroforetická metoda - separace proteinů dle pI • 2. rozměr = SDS-PAGE - elektroforetická metoda - separace proteinů dle MW - 1.4g SDS/g protein - SDS pro 2D v kontinuálním uspořádání pI MW KONTAMINANTY: Soli, iontové detergenty, nukleové kyseliny, polysacharidy, lipidy, fenolické látky… 13 Studijním ateriály Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů 2D SDS-PAGE – Solubilizace proteinů MS analýza proteinového vzorku Složení solubilizačního roztoku: • Chaotropní činidla (močovina, thiomočovina) • Neionogenní detergent (CHAPS, C7BzO) • Redukční činidla (DTT, TBP) • Inhibitory proteáz a enzymů odstraňujících modifikace (např. fosfatáz, deacetyláz, …) • Amfolyty Komponenty kompatibilní s IEF - nesmí zvyšovat iontovou sílu CHAPS C7BzO Studijním ateriály Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů 2D SDS-PAGE – 1. rozměr MS analýza proteinového vzorku pH 3 10 • 1. rozměr = Izoelektrická fokusace (IEF) Migrace nabitých částic v gradientu pH v elektrickém poli 15 Studijním ateriály Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů 2D SDS-PAGE – 1. rozměr MS analýza proteinového vzorku ROZSAH STRIPU ROZMĚR STRIPU 16 Studijním ateriály Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů 2D SDS-PAGE - 1. rozměr MS analýza proteinového vzorku ROZSAH STRIPU 17/celkem Studijním ateriály denaturace SDS  redukce DTT  alkylace IAA  EKVILIBRACE STRIPU Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů 2D SDS-PAGE - Ekvilibrace MS analýza proteinového vzorku Ekvilibrační pufr: Tris-HCl (pH 8.8) SDS močovina glycerol DTT IAA 18 Studijním ateriály Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů 2D SDS-PAGE - 2. rozměr MS analýza proteinového vzorku • 2. rozměr = SDS-PAGE • Migrace aniontů v elektrickém poli dle MW 19 Studijním ateriály 20 Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů 2D SDS-PAGE – DIGE = Difference gel electrophoresis MS analýza proteinového vzorku Studijním ateriály Obecné požadavky na vizualizaci proteinů • široký lineární rozsah závislosti intenzity barvičky na množství proteinu v gelu • kompatibilita s následnými analýzami (např. stříbro - glutaraldehyd!) • vysoká citlivost Dynamický rozsah = graf závislosti intenzity barvičky (osa y) na koncentraci proteinu (osa x) Barvení stříbrem – lineární závislost pouze v rozmezí do 100 ng proteinu. Při vyšších množstvích odklon od linearity. • kvantitativní barvení • end-point • trvanlivost (např. zhášení fluorescenčních barviček!) Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů 2D SDS-PAGE – Detekce proteinů MS analýza proteinového vzorku 21/celkem Studijním ateriály 22 • fosforylace: Pro-Q Diamond (pSer, pThr, pTyr), Pierce phosphoprotein staining kit (pSer, pThr) glykosylace: Pro-Q Emerald, Pierce glycoprotein staining kit • Radioaktivní značení Značení před analýzou (DIGE – CyDye, radioaktivní značení) Barvení po analýze Specifické barvení: post-translační modifikace (PTM) Nespecifické barvení: všechny proteiny • Viditelné barvení: Coomassie brilliant blue (R250, G250), stříbro (kyselá x amoniakální varianta) • Fluorescenční barvení: Sypro Ruby (Ex/Em = 280, 450/610 nm), Lucy (Ex/Em = 506/520 nm), Flamingo Pink (Ex/Em = 512/535 nm), Oriole (Ex/Em = 270/604 nm), Krypton (Ex/Em = 520/580), Deep Purple (Ex/Em = 365, 520/610 nm), Lumitein (Ex/Em = 280, 450/610 nm) Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů 2D SDS-PAGE – Detekce proteinů MS analýza proteinového vzorku Typy detekce: Sypro Ruby Coomassie silver Studijním ateriály Protean Plus Dodeca Cell Mini-Protean 3 Dodeca Cell Protean II xi Cell Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů 2D SDS-PAGE - 2. rozměr MS analýza proteinového vzorku Instrumentace: Izoelektrický fokusátor Elektroforetická aparatura Denzitometr / Fluorescenční skener SW pro obrazovou analýzu 23/celkem Studijním ateriály • prefrakcionace v roztoku • prefrakcionace na IPG stripu Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů IEF Frakcionace MS analýza proteinového vzorku 24/celkem Studijním ateriály OFFGEL IEF prefrakcionace proteinů nebo peptidů Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů IEF Frakcionace MS analýza proteinového vzorku 25/celkem Studijním ateriály PREFRAKCIONACE MIKRO ROZSAHY pI Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů IEF Frakcionace MS analýza proteinového vzorku 26/celkem Studijním ateriály Separace proteinů z jiného konce MS analýza proteinového vzorku Elektroforéza nativních proteinů 27/celkem Studijním ateriály MS analýza proteinového vzorku Když SDS-PAGE nefunguje… reduced non-reduced proteins in sample buffer (SDS/DTT/heat) velké nativní proteiny membránové proteiny 28/celkem Studijním ateriály MS analýza proteinového vzorku Solubilizace membránových proteinů • SDS / 95º C často agregace • neionogenní detergenty detergent lipid-detergent micela micela detergent lipidová dvojvrstva protein-detergent < CMC > CMC 29/celkem Studijním ateriály MS analýza proteinového vzorku Jde to i bez SDS… Schägger & von Jagow, 1991 30 Studijním ateriály 31/celkem MS analýza proteinového vzorku 2D Blue Native Electrophoresis BN/BN PAGE BN/SDS PAGE Studijním ateriály Honey Bee Pupae Membrane Proteins (Pavel Plevka / Liya Mukhamedova) Homogenizace . Ultracentrifugace . Solubilizace Triton X-100 MS analýza proteinového vzorku Membránové proteiny včelích larev 32/celkem Studijním ateriály BNE: Imunodetekce protein + virus + protilátka …detekce ECLPVDF blot 33 Studijním ateriály MS analýza proteinového vzorku BNE vs. BNE / SDS-PAGE eluce SDS-PAGE BNE digest 2-3 PGs per band digest 92 PGs BNE 34 Studijním ateriály MS analýza proteinového vzorku BNE / SDS-PAGE imunodetekce St StSt Gel Blot 35 Studijním ateriály 36/celkem Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů MS analýza proteinového vzorku Frakcionace Proteinů = Separace komplexních proteinových směsí Deplece abundatních proteinů Obohacení proteinů •nízkoabundatních •PTM proteinový vzorek komplexní proteinový vzorek jednoduchý ~ Studijním ateriály Deplece abundatních proteinů Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů MS analýza proteinového vzorku Metody •Precipitace abundantního proteinu •Gelová chromatografie •Imunodeplece Vysoce specifická protilátka proti abundantnímu proteinu imobilizovaná na sorbentu - komerční kity (př. ProteoPrep 20 Plasma Immunodepletion Kit, Seppro (Sigma-Aldrich); Pierce Top 2/12 Abundant Protein Depletion Spin Columns) Výhoda: •Detekce nízkoabundantních proteinů, které byly před deplecí maskovány Riziko: •Nespecifická vazba cílového proteinu na depletovaný abundantní protein (např. nízkoabundantní protein krevní plasmy se může vázat na depletovaný protein, který slouží jako jeho transportní protein) cílový protein může být odstraněn společně s abundantním 37/celkem Studijním ateriály 38/celkem Deplece abundatních proteinů Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů MS analýza proteinového vzorku Příklad: Proteiny plasmy Abundantní proteiny: ~ mg/ml (Albumin: 30-50 mg/ml, ~ ½ proteinů plasmy) Potenciální biomarkery: ~ pg/ml, nízké hladiny zvláště v brzské fázi nemociStudijním ateriály Deplece HSA a IgG Deplece abundatních proteinů Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů MS analýza proteinového vzorku 39/celkem Studijním ateriály 40/celkem Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů Obohacení nízkoabundatních proteinů MS analýza proteinového vzorku ProteoMinerTM protein enrichment kit • Redukce dynamického rozsahu koncentrace proteinu v komplexní směsi Obohacení středně a nízkoabundantních proteinů a snížení množství abundantních proteinů • Princip: velká, vysoce různorodá knihovna hexapeptidů vázaných na kuličky Abundantní proteiny saturují afinitní ligandy a nadbytečné proteiny jsou odmyty x Středně a nízkoabundantní proteiny jsou zakoncentrovány na specifických ligandech Výhody: Snížení dynamického rozsahu koncentrací při zachování zástupců všech proteinů původního vzorku : Metoda vhodná pro rozmanité typy vzorků, nezávislá na dostupnosti protilátek (na rozdíl od imunodeplece) Studijním ateriály ProteoMinerTM protein enrichment kit: CPPL Combinatorial Peptide Ligand Library Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů Obohacení nízkoabundatních proteinů MS analýza proteinového vzorku 41/celkem Studijním ateriály Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů Obohacení nízkoabundatních proteinů MS analýza proteinového vzorku ProteoMinerTM protein enrichment kit 42/celkem Studijním ateriály 43/celkem Digesce proteinů MS analýza proteinového vzorku Digesce Obohacení peptidů proteinový vzorek komplexní proteinový vzorek jednoduchý směs peptidů Studijním ateriály 44/celkem • Výběr vhodné proteinasy (event. kombinace proteinas) • Redukce a alkylace S-S můstků před digescí • Digesci ovlivňuje: poměr enzym:substrát, teplota, doba • Kompatibilita roztoků s následnou MS - odstranění kontaminant – např. FASP, SP3 v gelu v roztoku Digesce proteinů Digesce proteinů MS analýza proteinového vzorku Studijním ateriály 45/celkem FASP = filter aided sample preparation Digesce proteinů MS analýza proteinového vzorku SDS 8M Urea Peptides DTT IAA centrifugace proteiny nukleové kyseliny Lyzát 8M močovina Hydrogenuhličitan SDS DTT IAA amonný Trypsin PROTEINY PEPTIDY Nature Methods 6, 359 - 362 (2009) centrifugace centrifugace inkubace centrifugace Studijním ateriály SP3 = Single-Pot Solid-Phase-enhanced Sample Preparation 46/celkem MS analýza proteinového vzorku Digesce proteinů Mol Syst Biol. 2014;10:757 Studijním ateriály Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni peptidů Frakcionace peptidů v roztoku pomocí LC MS analýza proteinového vzorku Frakcionace: • off-line: LC (prefrakcionace) • on-line: LC-MS • Multidimenzionální chromatografie: LC-(LC)-… v různých provedeních Základní faktory ovlivňující frakcionaci peptidů: • Charakter kolony • Složení mobilní fáze • Fyzikálně-chemická povaha peptidů (náboj, polarita, hydrofobicita, velikost) 47/celkem Studijním ateriály 48/celkem Chromatografie na reverzní fázi • Nejčastěji používaná • Separace molekul v roztoku na základě hydrofobicity - separace na základě rozdělovacího koeficientu mezi polární mobilní a hydrofobní (nepolární) stacionární fázi • Separaci ovlivňuje: teplota, rozměry kolony, stacionární fáze, velikost částic, iontově-párující činidla, gradient Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni peptidů Frakcionace peptidů v roztoku pomocí LC MS analýza proteinového vzorku Iontově párující činidla Studijním ateriály 49/celkem Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni peptidů Frakcionace peptidů v roztoku pomocí LC MS analýza proteinového vzorku Hydrofilní interakční chromatografie (HILIC) • Separace hydrofilních peptidů • Hydrofobní mobilní fáze a • hydrofilní stacionární fáze • Vhodná pro separaci posttranslačně-modifikovaných peptidů 1. Distribuce mezi vodnou a organickou vrstvou 2. Iontoměničová interakce se skupinami stacionární fáze • voda • pufr • pH Studijním ateriály Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni peptidů Frakcionace peptidů na IPG stripu MS analýza proteinového vzorku 50/celkem Studijním ateriály 51/celkem Obohacení peptidů MS analýza proteinového vzorku Obohacení specifických posttranslačně modifikovaných peptidů • Fosforylace • Ubiquitinylace • Glykosylace • Acetylace Přístupy: • Imunoprecipitace (IP) (specifické protilátky proti PTM) • Afinitní chromatografie (protilátka nebo ligand – specifita pro PTM) • Enzymatická modifikace (specifický enzym pro danou modifikaci) • Chemická modifikace Studijním ateriály 52/celkem • Přístupy pro obohacení fosfopeptidů Obohacení peptidů MS analýza proteinového vzorku SCX Studijním ateriály Central European Institute of Technology c/o Masaryk University Žerotínovo nám. 9 601 77 Brno, Czech Republic www.ceitec.eu | info@ceitec.cz DOTAZY? Studijním ateriály