Souhrn 4. přednášky • Genetické metody – Plasmidy (kvasinkové elementy) – Integrace (plasmidy, PCR, kazety) – Analýza funkce ne-esenciálních genů – Syntetická letalita, epistase, suprese Pomocí těchto genetických metod byly analyzovány metabolické dráhy, proteinové komplexy, evoluce biologických systémů … připravovány nové kmeny pro biotechnologie … řešeny otázky týkající se zdraví člověka Osnova 5. přednášky • Genetické metody – analýza esenciálních genů (ts mutanty) – tetrádová analýza – genetické interakce – mutageneze/“screen“ • Buněčný cyklus – průběh a regulace BC – synchronizace buněk – mechanismy regulace párování – homothalické kmeny Delece/mutace genu - Studium funkce genu – delece nebo mutace genu - esenciální gen => buňky potřebují gen např. na plasmidu - plasmid shuffling - => buňky potřebují funkční gen aspoň za určitých podmínek (kondicionální exprese nebo kondicionální mutanty – ts mutanty) - => buňky potřebují aspoň „částečně“ funkční gen – hypomorfní mutanty - ne-esenciální gen – lze přímo integrovat do genomu (předchozí přednáška) - deleční/mutantní kmeny se testují na životaschopnost … za různých podmínek – dále je lze křížit s funkčně podobnými geny/mutantami a hledat jejich funkční vztahy (synthetic lethal x epistatic x suprese) Plasmid shuffling Pokud je YFG1 esenciální musí být v deleční mutantě přítomna extra divoká kopie genu např. na URA3 plasmidu, který lze odstranit (pomocí FOA) – analýza terminálního fenotypu Na dalším plasmidu může být vnesena mutovaná verze yfg1 – její efekt se projeví až po odstranění plasmidu s divokou kopií genu (pomocí FOA) Podobně lze použít ade2, ade3 systém s YFG1 wt genem na plasmidu s ADE3 (kolonie jsou červené díky ade2 mutaci) – po ztrátě plasmidu jsou sektory kolonii bílé (bez Ade3p enzymu je metabolická dráha blokována dříve než vzniká červený metabolit) Analýza esenciálních genů: ts mutanty - ts mutanty jsou výhodné pro studium funkce esenciálních genů – mutanty jsou normální na permisivní (25°C) teplotě, ale nemohou dokončit buněčný proces vyžadující aktivní protein za restriktivní teploty (37°c) - ts mutanty = většinou nestabilní proteiny, které se při zvýšené teplotě denaturují/ztrácí aktivitu a jsou degradovány Dohmen et al.: Science, 1994 - ubiquitinace „označkuje“proteiny pro proteasom (degradaci) ts alela DHFR je degradována (nestabilní protein – strukturní mutace) - fůze DHFR (ts alely) s heterologním proteinem => celý protein je na 37°C degradován - je možno využít pro přípravu ts mutantních kvasinek (fůze s CDC28 – kvasinky arestují v G1 fázi – sleduje se terminální fenotyp) Haruki et al, Mol Cell, 2008 Rychlé vyřazení proteinu z funkce protein je cíleně relokalizován tj. vyřazen z funkce (např. transkripční faktor je pomocí rapamycinového systému „vytažen“ z jádra – transkripce nebude spouštěna) Životní cyklus kvasinek - Deleci či mutaci lze provést v haploidní či diploidní buňce - v haploidní buňce hrozí suprese defektu proto je lépe používat diploidní buňky (druhá kopie zůstává nezměněná) - lze připravit dvojitého mutanta křížením haploidních mutant a poté sporulací diploida - pouzdro spory je třeba rozrušit a pomocí mikromanipulátoru získat jednotlivé haploidní buňky (lze provést i tzv. random sporulation) - u S.pombe jsou diploidní buňky nestálé a okamžitě sporulují (pouzdro se rozpadá samo) S. cerevisiae neesenciálnígen Tetrádová analýza YPD Selektivní médium (SD-ura ... testy) segregace 2:2 Mendlovy zákony AAaa AaAa AaAa . . + A a esenciální gen A a a A a A a A A A a a integrace křížení haploidní buňky 1 gen vřecko 4 spory Tetrádová analýza YPD Selektivní médium (SD-ura ... testy) segregace 2:2 Mendlovy zákony AAaa AaAa AaAa . . . + A a aB Ab AB ab ab Ab aB AB Ab aB ab AB + Ab aB AB Ab aB ab kombinace těchto mutací je synteticky letální křížení haploidní buňky 1 gen křížení haploidní buňky 2 geny Analýza genetických interakcí (funkčních vztahů) Dvojité mutanty – funkční příbuznost haploid x haploid => diploid – stejný fenotyp - identický gen - bez fenotypu – díky wt alele (různé geny) sporulace => haploid – stejný fenotyp – epistatický (funkčně příbuzné geny) - aditivní až letální (paralelní dráha, redundance, rozpad komplexu) - suprese (mutace může napravit původní defekt …) A b C D e F A B E A b c D E F Mutageneze pomocí hydroxylaminu … hledání (screening) letálního mutanta – mutageneze kmene s vypínatelným plasmidem (promotor nebo FOA – viz plasmid shuffling) Epistatický Letální D C F Proteinový komplex • Studium metabolických drah (URA, GAL …) • … flokulace, aglutinace (FLO, AGA …) • … sekrece, endocytózy, morfogeneze (SEC, END … ORB) • … mechanismu párování (STE …) • … vlivu záření na buňky … rad mutanty (např. RAD21, RAD50, RAD51) • … buněčného cyklu (CDC …) ředící řada WT Mut1 Mut2 rad51 mut γ-záření (budova A3) sec mutanty • Studium metabolických drah (URA, GAL …) • … flokulace, aglutinace (FLO, AGA …) • … sekrece, endocytózy, morfogeneze (SEC, END … ORB) • … mechanismu párování (STE …) • … vlivu záření na buňky … rad mutanty (např. RAD21, RAD50, RAD51) • … buněčného cyklu (CDC …) Allele Reverts? Notes Molecular descriptiona Reference ade2-101 yes ochre mutation, red colonies G to T transversion at nucleotide 190, changing amino acid 64 from a Glu to a STOP Gai and Voytas, 2005 his3-200 no Cold sensitive; high frequency of petite formation, especially during transformation. 1 kb deletion, (-205 to 835) Struhl 1985; Fasullo and Davis 1988 leu2-3,112 no double mutant GTT-to-GCT missense change at codon 69, G insertion at nucleotide 249, G insertion at nucleotide 792, GAC-to-AAC missense change at codon 300. Hinnen et al. 1978; Gaber and Culbertson 1982; trp1-1 yes amber mutation GAG-to-TAG amber (STOP) nonsense change at codon 83 McDonald, et al. 1997 Křížení – ověření - jedna mutace, meioticky defekt - rozdělení do komplementačních skupin (allelická kompl.) Kontrola závislosti na plasmidu na FOA plotnách Ověření pravosti (mutant+delece) X supresor na plasmidu Izolace mutant Počet mutací dnes - NGS ura, ade, rad … PCR genom sekvenace Verde, Mata, Nurse, JCB, 1995 - mutagenese S. pombe – hledání ts mutant (55 000 kolonii) s defektní morfologií – našli 64 kmenů (3 druhy defektu: 51 kulatých=orb, 8 tip elongation aberrant=tea, 5 banana=ban) - z 51 orb mutant křížených s WT segregovalo 43 v poměru 2:2 tj. jeden gen (8 sterilních), „linkage analysis“ mezi mutantami ukázala 12 orb genů (skupin – Tab.I) ... aktinový cytoskelet (polarizovaný růstu) Leland Hartwell začal studovat buněčný cyklus v 60.letech na S. cerevisiae. - izoloval mutantní kvasinky s mutovaným genem - >100 genů kontrolujících buněčný cyklus (např. CDC28) - také sledoval citlivost kvasinek na poškození DNA radiací - zjistil, že BC je při poškození DNA zastaven – aby získal čas na opravu DNA Paul Nurse studoval buněčný cyklus na S. pombe - v 70. letech objevil gen Cdc2 (homolog CDC28) - zodpovědný za regulaci většiny fází BC - v roce 1987 izoloval homologní lidský gen a nazval jej CDK1 (cyclin dependent kinase). Tim Hunt na začátku 80. let objevil první cyklin – cykliny jsou proteiny, které jsou syntetizovány a odbourávány (ubikvitinace) během určité části buněčného cyklu. Cykliny se váží na CDK a regulují jejich aktivitu. Nobelova cena za výzkum buněčného cyklu v roce 2001 Nobelova cena za výzkum buněčného cyklu v roce 2001 Leland Hartwell začal studovat buněčný cyklus v 60.letech na S. cerevisiae. - izoloval mutantní kvasinky s mutovaným genem - >100 genů kontrolujících buněčný cyklus (např. CDC28) - také sledoval citlivost kvasinek na poškození DNA radiací - zjistil, že BC je při poškození DNA zastaven – aby získal čas na opravu D Paul Nurse studoval buněčný cyklus na S. pombe - v 70. letech objevil gen Cdc2 (homolog CDC28) - zodpovědný za regulaci většiny fází BC - v roce 1987 izoloval homologní lidský gen a nazval jej CDK1 (cyclin dependent kinase). Nurse et al, MGG, 1976 Buněčný cyklus S. pombe - nestálé diploidní buňky vstupují do meiosy hned po konjugaci (ade6-M210xade6-M216) - pro konjugaci je kritická G1 fáze jako u S. cerevisiae S.pombe má rovnocenné dělení - vznikají buňky stejné velikosti – hned vstupují do S fáze (jsou dostatečně velké) – pro vstup do mitozy musí být dvojnásobná velikost (kontrola v G2 fázi => nejdelší je G2 fáze) cdc2 Cortes et al, JCB, 2012 Hoffmann a spol, Genetics, 2015 http://www.genetics.org/content/suppl/2015/ 10/02/201.2.403.DC1 sekrece … aktinový cytoskelet jsou důležité pro procesy polarizace … v průběhu buněčného cyklu … mating/fusion … - Více prof. Svoboda S. cerevisiae Buněčný cyklus S. cerevisiae - zahájení tvorby pupene a duplikace SPB – začátek S fáze - rozchod jaderných plaků na opačné póly – přechod z S do G2 fáze - jádro se protahuje – začátek M fáze (mitózy) - mikrotubuly - oddělení pupene – cytokineze – přechod z M do G1 - oddělená dceřiná buňka je menší než mateřská – nerovnocenné dělení– pro další dělení musí dosáhnout určité velikosti => dlouhá G1 fáze Curr Opin Gen Dev 5 (1995) • Generovali teplotně-citlivé mutanty, z kterých vybírali kmeny zastavující v určité fázi buněčného cyklu (cdc = „cell division cycle“ mutanty) • Výběr dle morfologických (diagnostických) znaků charakteristických pro určitou fázi buněčného cyklu Mikrotubuly (nocodazol) Synchronizace S. cerevisiae buněk - v úseku A jsou buňky „nedorostlé“ – elutriace (centrifugace dle velikosti buněk) – tzv. G0 synchronizace - v úseku B se rozhoduje o konjugaci - za přítomnosti alfa-faktoru (krátký syntetický peptid) dochází k zastavení buněčného cyklu – G1 synchronizace - HU inhibuje syntézu nukleotidů potřebných pro replikaci – synchronizace v S fázi - nocodazol blokuje polymeraci tubulinu – schází mikrotubuly pro mitózu – G2 synchronizace - ts mutanty různých CDC genů – různé fáze buněčného cyklu • Generovali teplotně-citlivé mutanty, z kterých vybírali kmeny zastavující v určité fázi buněčného cyklu (cdc = „cell division cycle“ mutanty) • Výběr dle morfologických (diagnostických) znaků charakteristických pro určitou fázi buněčného cyklu Mikrotubuly (nocodazol) Klíčovým mezníkem BC u S. cerevisiae je START, kdy se rozhoduje o přechodu z G1 do S fáze: - pro další dělení musí buňka v G1 fázi dosáhnout určité velikosti - při nedostatku živin arestuje v G1 nebo posléze přechází do stacionární fáze (vyčerpání živin) - nedostatek dusíku – růst pseudohyf - při nedostatku N a C (diploidní buňky) zastavují v G1 a zahajují sporulaci - haploidní buňky v přítomnosti partnera zastavují v G1 fázi a konjugují Shlukování - párování - morfologie kolonii Granek and Magwene, PLoS Genet (2010) Klíčovým mezníkem BC u S. cerevisiae je START, kdy se rozhoduje o přechodu z G1 do S fáze: - STARTovní interval lze rozdělit na úsek A a B - v úseku A se rozhoduje o přechodu do stacionární fáze (mutanty zastavené v této fázi nemohou konjugovat) - v úseku A hrají roli CDC25 a CDC35 (komponenty RAS dráhy - živiny) - v úseku B se rozhoduje o konjugaci či sporulaci (zastavení pomocí alfa-faktoru, nemůže být zvolena alternativa přechodu do stacionární fáze) - pro úsek B (a další „checkpoints“) je klíčový CDC28 (tj. CDK1) a příslušné cykliny A B G1 fáze - S. cerevisiae CDC28 a cykliny u S. cerevisiae Interakce fosforylované Cdc28p s cyklinem vzniká aktivní komplex: - v G1 fázi Cln1p a Cln2p (CLN3 mRNA je konstantní) - pro vstup do S fáze jsou nutné Clb5p a Clb6p (transkripce stimulovaná CLN) - zahájení mitózy se účastní Clb3p a Clb4p - mitózu ukončují Clb1p a Clb2p a jejich degradace Nasmyth, Trends in Gen, 1998 Buněčný cyklus S. cerevisiae - detail - další CDC - fosforylace - ubiquitylace