21.09.201710- 28.09.2017 05.10.201710- 12.10.201710- 19.10.201710- 26.10.201710- 02.11.201710- 09.11.201710- 16.11.201710- 23.11.201710- 30.11.201710- 11.30hod A2-2.11 11.30hod 11.30hod 11.30hod 11.30hod 11.30hod 11.30hod 11.30hod 11.30hod 11.30hod A2-2.11 A2-2.11 A2-2.11 A2-2.11 A2-2.11 A2-2.11 A2-2.11 A2-2.11 A2-2.11 Doc. Paleček Uvod - historie, význam volno Doc. Paleček Základní charakteristiky kvasinek Doc. Paleček Diagnostické a molekulárně biologické metody Doc. Paleček Genetika kvasinkových organismů Doc. Paleček Morfologie a buněčný cyklus, párovací proces, prof. Svoboda Protoplasty kvasinek jako modelový objekt prof. Svoboda Struktura kvasinkové buňky, sekreční dráhy a endocytóza prof. Svoboda Patogenní kvasinky, morfologická charakteristika, medicínské aspekty Doc. Paleček Regulace transkripce, 1 -2-3 hybridní systémy, reportér systémy Doc. Paleček Organizace kvasinkového chromatinu a evoluce 07.12.20179-12hod A2-2.11 14.12.20178-12hod A7-2.17 Doc. Paleček test + předtermín zkoušky Svoboda+Paleček Cvičení k přednáškám Osnova přednášky • Taxonomie kvasinek • Základní charakteristiky kvasinek • Podmínky růstu • Morfologie buněk a kolonií • Komunikace (killer toxiny ...) Bakterie x kvasinka Bakterie Kvasinka Četnost v lidské mikroflóre 99% <1% Velikost buňky 1um 10um Buněčná stěna peptidoglykan, LPS, LTA chitin, mannan PPM, PLM, glukan pH 6,5-7,5 4,5-6,5 Teplota 10-80 20-30 Rezistence na antibiotika Ne Ano Přenos genetického materiálu Jádro Ano Ne Ne Ano LPS - lipopolysacharid, LTA - lipoteichoová kyselina, PPM - fosfopeptidomannan, PLM - fosfolipomannan Taxonomie kvasinek - Kvasinky se řadí do říše hub (ačkoliv jsou to mikroskopické jednobuněčné organizmy), domény (nadříše) Eukarvota. Netvoří však žádnou přirozenou taxonomickou skupinu, aproto je nemožné je jednotně definovat. Jako takové jsou roztroušeny ve dvou odděleních hub, buď jako houby vřeckovvtrusné nebo stopkovvtrusné (asko-, basidio- a deuteromycetes + kvasinkové mikroorganismy) - 1500 identifikovaných (odhad o několik řádů vyssi) Hiurticelíutat phQtosjTilhesíií norwnotile ... šokují 1* % euKaryoEič muUiceíMar ingest í-ukňrygltr. mufticaílular aĎSůrí) non motile sexual Saccharomyces cerevisiae: nadříše > Eukarvota říšfi_> Funai íhoubv)_ oddělení pododdělení třída řád čeleď rod druh Ascomycota (vřeckovýtrusé) Ascomycotina (hemi) Ascomycetes > Saccharomycetales (kvasinkotvaré) > Saccharomycetaceae > Saccharomyces > Saccharomyces cerevisiae wikipedie Hedges, Nat Rev Genet, 2002 Kvasinky netvoří žádnou přirozenou taxonomickou skupinu - jsou roztroušeny ve dvou odděleních hub, buď jako houby vřeckovvtrusné nebo stopkovvtrusné pododdělení/třída: oddělení: říše hub: i— Pezizomycotina (47,000 spp.) p-TĽSaccharomycotina (300 spp.) '— Taphrinomycotina (120 spp.) _ Ascomycota (47.420 spp.) Urediniomycetes (8.000 spp.) Ustilaginomycetes (1.500 spp) Hymenomycetes (20,000 spp.) Glomales (160 spp.) Zygomycetes/Mucorales (700 spp.) ChitrkJiomycota (900 spp.) Basidiomycota (29.500 spp.) 670 3 70 1.0901 SO Většina využívaných kvasinek je z třídy (hemi)ascomycetes 1.1401 l.?10± na rtggg:**- sagas I—I PentcilBum cnrysogenum [penicillin fungusf Coccfdtoides immte [coccidioidomycosis fungusf I—| Fusarium graminearvm Sordariomycetes (head scab fungus} 1—| Nmrospora crassa (orange bread mould) Magnaponhe grisea [rice blast fungus) (pyrenomycetes) Yarrowia hpoiyOca (yarrowia yeast) Sacch arómy c oti na ^ E o N N ďe Saccharomyces paradoxus Saccharomyces mikatae Saccharomyces kiidr.avzev; Saccharomyces bayanus Saccharomyces exiguus Saccharomyces servazzii Saccharomyces castellii Candida glabrata Zygosaccharomyces rouxíi K^yvercri-.t ces S^emiaderars KUiyveromyces waJlh \ Saccharomyces kluyven Kíuweromvces lactis KJuyvemmyces marxianus -4 Ashbya gossypii i Pichia angusta Debaryomyces hansenh Pichia sorbitophila Candida guilliermondii Candida hmitaniae Candida tropicalis Candida parapsilosis Candida a! Lve ans Candida dubliniensis Yarrowia lipolytica Pivo, víno Chleba Lidský Patogen Xerotolerant Využívá laktózu Rostlinný Patogen Halotolerant Lidský Patogen Využívá alkany rody: Saccharomyces Kazachstania Naumovia Nakaseomyces Zygosaccharomyces Lachancea Kluyveromyces Eremothecium C kiele 2 Clade 1 (Neurospora. Magnaporthe, Aspergillus, Podospora, etc) i Archiascomycetes Schizosaccharomyces ponibe Pivo Basidiomycota - CryptocoCCUS neoformans Lidský pStOgen Srovnání průměrná^% shody sekvence proteinů v taxonech Hemiascomycotina a Chordata Vychází převážně z analýzy rDNA; nověji srovnáním rozdílů sekvencí aminokyselin v ortologních proteinech. Přes velkou morfologickou podobnost vykazují kvasinky velké rozdíly v genomu. Genomy (sekvence) kvasinek ze vzdálenějších větví fylogenetického stromu se srovnávají těžko Yarrowia lipolytics Debaryomyces hanserw Kluyveromyces lactis ■ Ciona intestinalis Candida glabrata ■ 60- 70 Saccharomyces uvarum-*- 80 90 Saccharomyces paradoxus Takifugu rubrtpes Tetraodon negroviridis Gallus gallus -Mus musculus Saccharomyces cerevisiae-*- 100^ ** Homo sapiens % odlišnost sekvence proteinů: - S. cerevisiae a C. glabrata ~ člověk a ryba - mezi druhy S. sensu stricto ~ mezi řády savců - Proteiny člověka a hlodavců jsou si více podobné (lze rekonstruovat změny, jimiž genomy během evoluce od společného předka prošly) než proteiny druhů ze skupiny sensu stricto, mezi nimiž mohou vznikat životaschopné hybridy! rozdí| mezj Sc a s je cca 300MYA Potřebují vodné prostředí, kyslík a živiny volná voda (nikoli chemicky vázaná) - Vodní aktivita = volně přístupná voda/fyziologicky využitelná voda = available water (aw) aw = poměr tlaku vodních par nad substrátem a tlaku par destilované vody Bakterie vyžadují vyšší hodnoty a^ (víc dostupné vody) než kvasinky a plísně (z toho důvodu např. chléb napadají plísně, nikoliv bakterie) Aktivitu vody lze snížit proslazováním nebo solením (marmelády, nasolování masa ... lze takto potlačovat i růst bakterií v kvasinkových izolátech) Xerotolerantní kvasinky rostou i za zvýšeného osmotického tlaku - (a^=0.65), rod Zygosaccharomyces (rouxii, bailii, bisporus) - rostou přednostně v potravinách s vysokým obsahem cukru či solí; ostatní (S. pombe, Debaryomyces hensenii, Hansenula anomala) vyšší osmotický tlak tolerují, ale lépe rostou za standardních podmínek (více polyolů, ATPazové pumpy), Lipomyces mají pouzdro - při zvýšené koncentraci solí upravují jeho složení Test: schopnost růstu na 50-70% glukose (většina pouze do 40 %) nebo na 10% - 0,95: Pseudomonas, Escherichia,..., většin a bakterií - 0,85: kvasinky (Candida, Toru lops is, Hansenula) - 0,75: většina halofilních mikroorganismů - 0,65: xerofilní plísně {Aspergillus) - 0,4: potlačení růstu veškeré mikroflóry Debaryomyces hensenii NaCI Podmínky růstu - kyslík - Většina kvasinek je obligatórne aerobní (vyžadují aspoň stopová množství kyslíku nezbytné pro syntézu některých esenciálních metabolitů - ergosterol, nenasycené mastné kyseliny) - fermentativní typy {Saccharomces c, S. p.) - pro fermentaci jsou vhodnější anaerobní podmínky, ale S.c. i v aerobních podmínkách fermentují (gluk. repr.) - respirativní typy (většina) - převládá energeticky výhodnější respirace nad fermentací - nefermentativní typy (nemají alkoholdehydrogenásu -neprodukují ethanol) - rody Lipomyces, Cryptococcus, Saccharomycopsis - teploty, při nichž mohou kvasinky růst: - mezofilní (0 - 48 °C) - většina druhů - psychrofilní (-2 - 20 °C) - voda, půda v Antarktidě (některé Leucosporidium, Cryptococcus) - termofilní (ne méně než 20 °C) - potenciální patogeny (Candida, Cyniclomyceš) Maximální teploty, které (některé) kvasinky přežívají, se pohybují kolem 57-59 °C Laboratorní podmínky 25-30 °C (S.c. i S.p. - rostou i při 15°C a přežívají krátkodobě 50°C), teplotně senzitivní mutanty (ts, 37°C), chladově sensitivní mutanty (cs, 20°C), živiny • Nejčastějším zdrojem uhlíku a energie jsou mono-, di- a oligosacharidy (jsou schopny hydrolyzovat i polysacharidy jako škrob, xylany či celulózu ... nebo methanol (Pichiapastoriš), alkany apod. • Nepreferovanějším cukrem S.c. je glukóza (represe ostatních) • Zdrojem dusíku jsou amonné ionty a aminokyseliny Laboratorní podmínky: YPD/YES - bohaté médium = 10g/I yeast extract, 20g/l pepton, 20g/l dextrose (2%glukosa)/u S.pombe supplements: A, U, H, L, K Sabouraudův agar (1892) = 10g/I pepton, 40g/l dextrose (4%glukosa), 20g/l agar, pH 5.6 Syntetické SD médium = 6.7g/l yeast nitrogen base w/o amino acids (aminokyseliny se přidávají dle potřeby), 20g/l dextrose (2% glukosa) - např. SD-L,T pro Y2H system Minimální agarová půda = 5g/l (NH4)2S04, 1 g/l KH2S04, 0,5g/l MgS04 x7H20, 10g/I glukosa, 1 ml/l Wickerhamův roztok, 20g/l agar Wickerhamův roztok: 0.2mg biotin, 200mg inositol, 20mg riboflavin, 40mg thiamin, 40mg pyridoxin, 20mg kyselina p-aminobenzoová, 40mg kyselina nikotinová, 0,2mg kyselina listová (na 100ml vody) Forsburg and Rhind, Yeast (2006) - Živiny určují morfologii/buněčnou formu - kvasinková nebo houbová (pseudohyfy) nebo sporulace ... - limitování klíčových živin spouští různé vývojové odpovědi - zdroje uhlíku a dusíku jsou monitorovány signálními dráhami Carbon Rich Poor Yeast Form Growth Colony Morphology o o ľ. Pseudohyphal Grq,y$f w Sporulation 'J* B Mutant Phenotype Gain of CCM Loss of CCM r Glucose Elongator i Nitroc MAP Kinase cAMP-PKA Nitrogen Discrimination Ira2p Ras2p Tpk2p Tpk3p G,n3p Flo11p Rim15p Sporulace/meiosa Complex Colony Morphology Rim15p Granek and Magwene, PLoS Genet (2010) Kvasinková forma - morfologie - za běžných podmínek (bohaté C i N zdroje) převládá kvasinková f. - rotační elipsoid, kulaté, protáhlé - rod Dipodascus až 130 mikrometrů - 3-15 mikrometrů (bakterie^ CO cytokinese & transkripce (RNApol, mediator, SAGA) HP = high penetrance (>30% buněk v populaci) LP = low penetrance (<30% buněk v populaci) Kvasinková forma - morfologie visualní analýza kvasinek deleční knihovny -3500 kmenů (1. genome-wide) - např. delece genů regulujících buněčnou polaritu S. pombe způsobovaly oválný tvar buněk rounded buněčná stěna (a) miss E miss V miss weak V long HP long LP long Br rounilcd stubby curved small skiltle C- ČI - buněčná stěna a aktin krátké/tlusté mikrotubuly co o (M O CD £Z ^ CC x 4(H! (b) gene number Pseudohyfy - při nedostatku dusíku se diploidní buňky protahují a vytváří pseudohyfy/hyfy - vrůstají do agaru - unipolární pučení, mateřské a dceřiné buňky zůstávají spojené (úplná přepážka, neoddělí se dceřiné buňky x pravé hyfy mají přepážky průtočné) - chlamydospory - kulaté, silnostěnné, na koncích nebo po stranách hyf -spory nevykazují tak vysokou odolnost jako u bakterii - na koncích (i mezi buňkami) mohou vznikat spory (blastospory), které se dále množí pučením (odlišení C. albicansoó C. dubliniensis) Carbon 50 pm Candida albicans ,. - Spory při nedostatku dusíku v kombinaci s ne-fermentovatelným uhlíkatým zdrojem dochází k indukci meiosy a sporulace C. dubliniensis: nadbytek chlamydospor na koncích krátkých pseudohyf C. albicans: na delších hyfách či pseudohyfách jen ®® jedna terminálni chlamydospora Haploidní spory vřeckovýtrusných kvasinek vzniklé při sporulaci diploidních buněk (poh avní rozmnožováni) kulatý n , . , s lineárním Schizosaccharomyces uspořádáním spor Metschnikowia protáhlý s rozpolcenou sporou rhomboedrický pytlovitý kloboukovitý saturnovitý Saccharomyces Lipomyces Hanensula Nematospora VŘETENOV1TÝ jehlovity Spory - při nedostatku dusíku v kombinaci s ne-fermentovatelným uhlíkatým zdrojem dochází k indukci meiosy a sporulace http://www.genetics.org/content/suppl/2015/10/02/201.2.403. DC1 Hoffmann a spol, Genetics, 2015 Glue. 05% 2,0% a b 1 řmeí i G d • pMB1 wr ade2 (červená barva) ukazuje haploidizaci heterozygotního diploida (některé hapl. bílé vs červené) šipky ukazují vřecka se čtyřmi sporami Spory - kolonie - při vyčerpání živin na misce mohou (krajní) buňky začít meiotické dělení (diploidní S. cerevisiae) - meiosa je indukovaná IME1 transkripčním faktorem (v imelA se meiosa neindukuje vs. v plME1 overexprimovaných buňkách je indukována meiosa i bez vyčerpání živin tj. 2% glukosa) Purnapatre a Honigberg, Curr Genet, 2002 Vertical colony section U cells U cells Fraction 3 cells kolonie -větší buňky (4liiti) -malé mitochondrie a vakuoly -více lipidových váčků rozdíly jsou patrné i na expresní úrovni proteinů -menší buňky (3liiti) -velké mitochondrie i vakuoly (aktivnější respirace a více ROS) Čáp et al., Mol Cell, 2012 rozdíly jsou patrné i na expresní úrovni proteinů Differenciace S.cerevisiae v kolonii U (upper) buňky - aktivní glutaminem-indukovanou TOR dráhu, sníženou respiraci (málo mitochondrii), AMK-sensing systém (Gcn4) a vyšší „turnover" AMK (souvisí s produkcí amoniaku), produkují amoniak pro komunikaci kolonii - využívají živiny uvolněné z L buněk (autofagie) - jsou odolnější vůči stresu -déle přežijí - schopné proliferovat (po 10 dnech)_ L (lower) buňky - podléhají více stresu, hladoví (přestože jsou blíže mediu), aktivují degradační mechanismy (zásobují U buňky) Čáp et al., Mol Cell, 2012 Komunikace kolonií Kvasinkové kolonie spolu „komunikují" (i bez dotyku) pomocí amoniaku - inhibuje růst sousední kolonie (kolonie S. cerevisiae produkují amoniak po 10 dnech růstu) Aktivní inhibice růstu sousední kolonie nikoli (pasivní) důsledek spotřebování živiny ■•----i i fn----w m-----2 1 cm-----m kolonie přesměrovává růst sousední kolonie -nekompetují o živiny - ■ 2.9 cn> — Pálková et al., Nature 390 (1997) - různé vývojové programy (formy) vedou k mnoho-buněčným strukturám (...hyfy) - tvorba biofilmu na pevném podkladu se sníženým množstvím agaru (málo glukózy) - naopak tvrdý agar (4%, + suchá) a UV záření indukuje „stopkování" (složená z kvasinkových nikoli pseudohyfálních buněk) - zvyšuje šanci na diseminaci - buňky v jamkách jsou chráněny před UV, zatímco ty na povrchu jsou zabity Kolonie - různé tvary kolonií: - hladké i „fluffy" kolonie - kulaté a oválné buňky (S.c.) - není určující faktor - drsné kolonie - protáhlé buňky (Pichia) Kolonie různé tvary kolonií: - hladké i „fluffy" kolonie - kulaté a oválné buňky (S.c.) - není určující faktor - drsné kolonie - protáhlé buňky (Pichia) - slizovité kolonie - pouzdra {Lipomyces) obvykle krémová barva - Day 0f Growth červený pigment {Rhodotorula, Sporidiobolus) černý pigment (melanin - Aureobasidium) - využívá se např. pro odlišení Cd. od Ca. (kultivace na Staibově agaru při teplotě 37°C) Carbon Rich Poor Yeast Form Growth Colony Morphology c o Cl Pseudohyphal Growjff Sporulation VP 0f • # # # Granek and Magwene, PLoS Genet (2010) D CD X o in CD O o =3 n CD O) O" Z) Morfologie kolonie - Candida Např. odlišení Cd. od Ca.: 24h kultivace na Staibově agaru při teplotě 37°C (a) C. dubliniensis (b) C. albicans Extracelularní matrix wild type Mo11 I Cl - morfologie kolonie závisí na ECM (extracellular matrix tj. glykoproteiny) - ECM zachycuje vodu a chrání kolonii před vyschnutím - buněčná adhese je důležitá pro všechny specifické morfologie (... biofilm, flokulace) - závisí na FL011 (adhesin - glykoprotein -faktor důležitý pro flokulaci, biofilm, pseudohyfy) ECM Stovicek et al, Fungal Gen Biol (2010) Laboratorní kmeny jsou hladké (např. S288C - Genotyp: MATa SUC2gal2 mal mel flol flo8-1 hapl) Biofilm 88^ 5 ..... surface - tvořen EC matrix s mikrokoloniemi kvasinek, hyfami a pseudohyfami (komplexní struktura) - více rezistentní než planktonické buňky - významně přispívá k rozvoji a odolnosti kandidóz (rezistentní k antimykotickým látkám) - ECM a adhesiny/flokuliny FL01, FL011 jsou potřebné pro tvorbu biofilmu - váží např. peptidy na povrchu hostitelské buňky {C. albicans = ALS2, 3, 6, 7, 9 exprimovány při vaginální infekci zatímco ALS1, 2, 3, 4, 5, 9 exprimovány při orální infekci) S.c. kmen Z1278b B Invasivní růst B Pseudohyphal Growth Biotilm G i>: iy Betore Wash A tor Wash WT Ca_flo8t>: Cajk>8b Ca_mtg1&/ Ca_mfgi& □ •A" • • ■ □ • * • v □ ■ ». • • V: 'J : V □Hi □ • • • • DDLU • O&OO •[#]♦ • QQQD Phenotypic Score ■■■ -7 0 10 Phenotypic Score ■■■ -26 0 26 - buněčná adhese je důležitá pro všechny specifické morfologie (invasivní růst, pseudohyfy, biofilm, flokulace) - FL011 = adhesin (glykoprotein - faktor důležitý pro uchycení - Flo8, Mfg1 jsou TF aktivující transkripci Flo11 - Flo11, FI08, Mfg1 faktory jsou konzervovány ... a podílí se na invasivních vlastnostech (virulenci) patogenních kvasinek C. albicans Ryan et al, Science (2012) Invasion 190 FL011 RIMÍ01 RPD3 FLOS SIN3 TEC1 RXT2 MSS11 MIT1 MFG1 SPE1 SPE2 "* SPE3 SPE4 Biofilm Pseudohyphal F ✓ wt • • • • • • • Phenotypíc * • s # □ • • • • Score 10 ■ díglb i • • * • • • • ■ •SE • • • • • adhesin Rslalíve FZ.OÍ ípr-GFP expressem o o.a o.e o.* 1.2 1.5 i.a - Flo8, Mfg1 jsou TF aktivující transkripci Flo11 - Dig1 je represor transkripce Flo11 - FL011 = adhesin (glykoprotein - faktor důležitý pro uchycení - buněčná adhese je důležitá pro všechny specifické morfologie (... biofilm, flokulace) Ryan et al, Science (2012) 1 i i ■ .'cřťíú ^^^l H p 1—1 Flokulace reverzibilní schopnost kvasinek shlukovat se, tvořit větší celky (vločky, f loky); odpověď na stres flokulace je významná vlastnost využívaná např. při produkci piva (snižuje náklady na filtraci Diva) fíol- FL01+ -ovlivněno složením média, genetickou výbavou kmene (skupina FLO genů), teplotou, stavbou a morfologií buňky ... - Flolp váže manany na povrchu buněk stejného druhu (S.c.) => agregace - NewFlo váže manosu i glukosu => glukosa v mediu inhibuje agregaci -teprve po přeměně cukrů na etanol se važe na buněčnou stěnu ostatních buněk a dochází k vločkování Smukallaa kol., 2008, Cell Verstrepen, 2006, Mol. Microbiol Yeast surface display - His-His-His-His-His-His (chelatuje Ni, Cu, Co kovy) -GTS1 transkripční faktor spouštějící aglutinaci pod CUP1 promotorem (další přednášky) - biosorbce & sedimentace GPMM6/pMCOl (IOOmM CuSOJ - hybrid Aga2 (aglutininy nebo Flo1 ...) s testovaným proteinem - exprese eukaryotních proteinů v kvasince (podobné mechanismy ... posttranslační modifikace) - knihovny lidských cDNA (i protilátek z pacientů) - využití i pro biotechnologie - vychytávání těžkých kovů (dekontaminace) Kuroda et al, Appl Microbiol Biotechnol (2002) Pepper et al, CCHTS (2008) YSD - testy antigen/protilátka - v kvasince je exprimována knihovna (např. IgG klonů) - na kuličkách je navázán antigen - opakováním vychytávání dojde k nabohacení (i slabších interakcí) Boder et al, Arch Bioch Biphys (2012) Priony - epigenetická informace kvasinek Adhesivní vlastnosti mohou být ovlivněny přítomností prionů [PSI+] kódovaných Sup35 genem - jeho PrD doména spouští tvorbu amyloidových agregátů) [PSľ] Cured Total growth Adhesive growth Sup35APrD Wash UCD824 fluconazole 40 60 80 Time (h) YPD controls Original isolate Cured derivative 100 GdHCI curing Sup35 je translační terminační faktor (zastavuje translaci na STOP kodonu) - pokud agreguje/nefunguje, dochází k read-through genů tj. vznikají proteiny s delší sekvencí a novými vlastnostmi (záleží na genomu dané kvasinky jaké) - mohou dát kvasince nové výhody (např. zvýšenou rezistenci k fluconazolu) Halfmann a kol., 2012, Nature Pseudohyfy, adhesiny ... a candidalysin Kvasinky C. albicans jsou schopny se přichytit k epiteliálním buňkám hostitele (pomocí adhesinů - Hwp1) - invasiny (Als3 a Ssa3 mohou interagovat s receptory) se podílí na vnoření pseudohyfy do buněčné membrány hostitele - Ece1 je rozštěpen Kex2/Kex1 proteasami na peptidy (Golgi), které jsou sekretovány a vytváří (peptid III) póry v cytoplasmatické membráně (jako bakteriální toxiny) Mitchell, Nature, 2016; Moyes et al., Nature, 2016; Los et al, MMBR, 2013 Killer toxiny Některé kmeny S.cerevisiae produkují tzv. killer toxiny (proteiny a glykoproteiny sekretované do prostředí), které jsou letální pro citlivé kvasinky i bakterie; ekologická výhoda (výhoda pro vinaře - nepřerostou je cizorodé kmeny) - Poprvé analyzováno v roce 1963 (Makower a Bevan) kvasinky zabíjí podkladový kmen (K1=laboratorní, K2 a K3=vinařské kvasinky) Kvasinky ze stejné skupiny se navzájem nezabíjí (preprotoxin ...) - Geny jsou kódovány na dsRNA obalené ve „virus-like particles" (VLP, připomínají savčí dsRNA viry) - kódují obalové, replikační proteiny (ale potřebují buňku k replikaci ...), transkripční sekvence a toxin - Samotné VLP nejsou infekční (nejsou uvolňovány z buněk - lze je přenést konjugací buněk nebo fůzí protoplastů) ani toxické (preprotoxin v původní buňce interaguje/inaktivuje maturovane/sekretované toxiny) - Toxin je sekretován a váže se na buněčné stěny (p-1,6-glukany) -způsobuje perforace/póry v cytoplasmatické membráně - ztráta iontů, potenciálu ... buňka hyne - Kluyveromyces lactis, Píchla membranifaciens - lineární dsDNA (v cytoplasmě, pGK11), bez kapsidy, toxin se váže na chitin (chitinásová aktivita) - Hansenula mrakii... - geny na chromosomech, toxin inhibuje syntézu p-1,3-glukanu (v místě růstu pupenu) Table 2. Killer activity of P. membranifaciens CYC 1086 and CYC 1106 against yeasts and fungi of biotechnological interest Sensitive strain Killer activity Sensitive strain Killer activity Sensitive strain Killer activity 1086 1106 1086 1106 1086 1106 S. cerevisüie SGV — — B. bruxellensis 1D007 3 + — Pkhia anomala 11141 — — S. cerevisiae CEG - - B. bruxellensis D013 1 + - Pichia membranifaciens CYC 1070 2 + S. cerevisiae VRB - 3 + B. bruxellensis D014 1 + - Aspergillus spp. 27 - - S. cerevisiae NEM - - B. bruxellensis D015 1 + - A. carbonarius B MUM - S. cerevisiae 2056 - 2 + B. bruxellensis D017 2 + - A. orchraceus - - S. cerevisiae I3M45 - 3 + B. bruxellensis D018 1 + - A. orywe - - .S", cerevisiae 2323 - - B. bruxellensis D019 1 + - A. tubingensis - S. cerevisiae ALB - 3 + B. bruxellettsis D027 1 + - Fusarium culmorum - - S. cerťvŕstíiť SLO - 4 + B. bruxellensis D028 1 + - F. graminearum NRRL 28525 - - S. cerevisiae VN - - B. bruxellensis D029 2 + - F. graminearum NRRL 29020 - 5. cerevisiae 71B - 4 + B. bruxellensis D031 1 + - F. pone - S. cerevisiae CS2 - 1 + B. bruxellensis D032 1 + - F. proiiferatum MM 1-2 2 + S. cere\isüw CM - - B. bruxellensis D033 1 + - F. proiiferatum MM 3-1 2 + S. cerevisiae HAY - - B. bruxellensis D035 2 + - F. proiiferatum MM 6-2 - - S. cerevisiae FS - 3 + íí. bruxelletisis D036 1 + - F. reticulloides MM 6-3 - - S. cerevisiae 16 - - R bruxellensis D038 1 + - F. reticulloides MM 7-3 - - S. cerevisiae 17 - 3 + Debaryontyces hansenii 1021 - - F. sporotrichoides ITEM 550 - S. cerevisiae 18 - 3 + D. hansenii 1244 - - Botrytis cinerea 20003 3 + S, cerevisiae 19 - - D. hansenii 10388 - - B. cinerea 20004 1 + S. cerevisiae SCI — 4 + D. hansenii 10386 — — B. cinerea 20005 2 + - Kontaminace vinných kultur kmenem Brettanomyces bruxellensis může být potlačena P.m. - Význam při ochraně průmyslových kmenů (proti kontaminaci - odolné vůči toxinu a zabijí kontaminanty) - v léčbě (některé S.c. killer kmeny zabíjí kmeny Ca., C. podzolicus zabíjí Santos et al., 2009, Microbiology Souhrn 2. přednášky • Kvasinky patří mezi houby (asco- a basidiomycety) • Podmínky růstu - determinují morfologii/buněčný program • Morfologie buněk a kolonií • Killer... toxiny