Test: 7.12., A2 (2.11) - psací potřeby (A,B,C,D)
Zkouška/prezentace:
7.12., A2 (2.11) – 4-5 studentů
Další termín v lednu … A2 (2.11) – 4-5 studentů
Kvasinky … oblast vaší DP (ne samotná DP)
- úvod do problematiky
- výsledky z článku (ne starší než 5 let)
- závěry, reference
přednáška 15 + 5 minut
Cvičení: 14. 12. 8.00, A7 (2.17) - pláště, psací a kreslící potřeby
• Párování kvasinek
– Fyziologie
– Regulační dráhy
– Přepínání párovacího typu
– Regulace transkripce specifických genů
• Regulace transkripce
– Gal4 transkripční faktor
• Hybridní systémy
– transkripční hybridní systémy
– alternativní kvasinkové hybridní systémy
Osnova
Párování/mating kvasinkových buněk
G1-A
G1-B G1
- haploidní buňky v přítomnosti partnera zastavují v G1 fázi a konjugují
- S. cerevisiae = a/alfa, S. pombe = h+/h-
vytváří diploidní buňky (S. cerevisiae = stabilní, S. pombe = okamžitě
sporulují)
- párování doprovázeno zásadními změnami v morfologii
Merlinietal,OpenBiol,2013
STE = sterile
lokalizovanátranslace
tvorba shmoo – polarizace
aktinového cytoskeletu
akumulace
faktorů
cvičení
Merlinietal,OpenBiol,2013
fůze buněčných stěn – vytvoří se pór v cytoplasmatické membráně
Signální dráha – α faktor
Park at al, MMBR, 2007
Wang et al., Nature, 2004
STE = sterile
GPCR –> G-proteiny
Hay-Oak Park, MMBR, 2007
buňka využívá podobné „nástroje“ pro jiné
programy (vláknitý růst)
Ren et al., Science, 2000
ChIP on CHIP - Ste12p transkripční
faktor (indukované geny)
Párování/mating kvasinkových buněk
G1-A
G1-B G1
- haploidní buňky v přítomnosti partnera zastavují v G1 fázi a konjugují
- S. cerevisiae = a/alfa, S. pombe = h+/h-
vytváří diploidní buňky (S. cerevisiae = stabilní, S. pombe = okamžitě
sporulují)
- párování doprovázeno zásadními změnami v morfologii
Přepínání párovacího typu
Homotalické - HO endonukleasa je exprimována pouze v mateřské buňce v G1
fázi (dceřinná si uchová původní typ)
Heterotalické – nemají funkční HO endonukleasu
Chant,CurrentOpinioninCellBiol,1996
homotalické
Přepínaní párovacího typu
HMLα HMRa
MAT
CEN
Chromosom III
umlčená kopie umlčená kopie
HO endonukleasa štěpí specifické sekvence v MAT lokusu - homologní rekombinace
- záměna kopií
Používá se pro vygenerování DSB a studium mechanismů opravy poškozené DNA
LeeaHaber,MicrobiolSpect,2015
Chromosom III obsahuje:
- MAT lokus
- MAT a (HMR) kazeta
- MAT α (HML) kazeta
HML a HMR jsou tiché
alely (heterochromatin)
Co a1, a2 + α1, α2
kódují? (transkripční
faktory)
HO endonukleasa –
výměna kazet v MAT
lokusu (rozeznává
specifické sekvence)
Heterothalické – stabilní
Homothalické – přepínají
párovací typ
Chromosom III
Regulace transkripce v haploidních buňkách
(konstitutivní)
a1, a2 + α1, α2 - transkripční faktory, které ovlivňují transkripci 3 skupin genů
a-spec.= MFA1,2 (a-feromon), STE2 (α-receptor), STE6, 14 (úprava a sekrece feromonu)
α-spec.= MFα1,2 (α-feromon), STE3 (a-receptor), STE13, KEX2 (proteasy)
haploid spec.= STE4,18 (podjednotky G-proteinu), RME1 (inhibitor meiosy), HO, NEJ1, LIF1
aSG ON
αSG OFF
haploid SG ON
MAT lokus Typ buňky Geny kontrolované MAT lokusem
a haploida1, a2
α haploidα1, α2 aSG OFF
αSG ON
haploid SG ON
α2
α1
diploidα1, α2
a1, a2
aSG OFF
αSG OFF
haploid SG OFF
α2
α1
α2a1
Lee a Haber, Microbiol Spect, 2015
α haploidα1, α2 aSG OFF
αSG ON
haploid SG ON
α2
α1
Struktura promotorů
Kvasinkové promotory se liší od bakteriálních a vyšších eukaryot (kvasinky
netranskribují z takových promotorů – kvasinkové plasmidy …)
-Většina míst pro iniciaci transkripce obsahuje TC(G/A)A a PuPuPyPuPu
(specifické pro kvasinky)
- TATA box (TATAT/AAT/A) je 60-120bp od iniciačního místa (podobné Pribnowovu
boxu u bakterii)
- UAS (upstream activating sequences) a URS (upstream repressing sequences)
- DAS (downstream activating sequences – přímo v sekvenci genu)
Represor
na URS
Aktivátor
na UAS
konstitutivní
Johnston et al., MCB, 1994
- glukosa reprimuje transkripci GAL genů na různých úrovních
- URS v promotorech GAL1 genu (Mig1 represor) - reprimuje transaktivaci
GAL4 transkripčním aktivátorem
- Gal80 blokuje Gal4 aktivační doménu
- reprimuje GAL3 induktor a GAL2 permeasu
aktivátor
inhibitor Gal4p
induktor
Regulace transkripce GAL genů
Chr. II Mig1
represor
GAL4 gen kóduje transkripční faktor
(aktivátor), který se váže na UAS GAL1,
GAL7, GAL10 …
Regulace metabolické dráhy galaktózy
Hittingeretal.,PNAS,2004
Johnston,MMBR,1987
Regulace metabolické dráhy galaktózy
Gal2 Gal1 Gal7 Gal5
Gal10
- pouze GAL5 gen je konstitutivně exprimován (potřebný pro metabolismus glukózy)
- GAL4 gen kóduje transkripční faktor (aktivátor), který se váže na UAS GAL1, GAL7,
GAL10, GAL2 …
Transkripční aktivátor Gal4p
UAS
Luban a Goff, CO Biotech, 1995
Ptashne a Gann, Science, 1997
Vznik 1-hybridních systémů
- Takto funguje např. i FASAY (Functional Analysis of Separated Alleles in Yeast)
pro testování mutantních p53 (transkripční faktor)
Různé transkripční faktory mají podobné domény a lze je kombinovat …
Lze hledat DNA-vazebné proteiny pro danou UAS sekvenci (AD-hybridní knihovny)
Stynen et al, Microbiol Mol Biol Rev, 2012
BD a AD domény lze zaměnit
2-hybridní systém
His3
His3
His3
kvantitativní
auxotrofie
(media bez …)
FACSorting
rezistence
(media s aureob)
Reportérové geny
Stynen et al, Microbiol Mol Biol Rev, 2012
Huang a Schreiber, PNAS, 1997
FK506 inhibuje vazbu proteinu FKBP12 na TGFβ-receptor
(životaschopnost na FOA plotnách)
Inhibitory proteinových
interakcí
A
B
A-B
A
B
A-B
Klasický dvoj-hybridní systém
Troj-komponentní (dvoj-H) systém
– heterotrimerní proteinové komplexy
- posttranslační modifikace
Dvoj-hybridní systém
- proteinový inhibitor interakce
Troj-hybridní systém
– RNA interakce
- ligand/receptor
Hybridní RNA molekula
Analýza vazby protein-RNA (Y3H)
SenGupta et al, PNAS, 1996
Tři hybridní/fůzní konstrukty:
1. DB-Gal4 a RNA-vazebný protein (MS2 virový coat protein)
2. RNA molekula složená z TAR (HIV trans-activation response element) a MS2
sekvence
3. AD-Gal4 a trans-activation protein Tat (váže TAR)
CytoTrap 2-hybridní systém
Kvasinkový cdc25-2 ts mutant – lidský hSOS (guanine exchange factor) aktivuje
RAS pokud je ukotven na membránu v jeho blízkosti
- jeden partner je myristylován (signální sekvence) a ukotven na membránu a druhý
(interakční) partner je fuzován k hSOS – spustí Ras dráhu (roste i na vyšší teplotě)
Broder et al, Cur Biol, 1998
alternativní G-protein hybridní systémy
Kvasinkový ste18∆ mutant nereaguje na αferomon
– Ste18p fůzovaný s jedním
partnerem a druhý je ukotvený na
membráně - silná interakce nedovolí
asociaci Ste18 a Ste4 a nespustí se signální
dráha (buňky rostou za přítomnosti α-
feromonu)
Ste18
Ste4
Ste18 Ste4
vhodný pro analýzu disrupce
Johnsson et al, PNAS, 1994
Stynen et al, MMBR, 2012
Komplementace proteinů
Interakcí dvou partnerů dochází ke komplementaci
eGFP na povrchu kvasinkové buňky (ukotveno
pomocí fůze s Aga2 aglutininem) – buňky mohou být
vytříděny pomocí FACS
Interakcí dvou partnerů dochází
ke komplementaci ubikvitinu –
původní verze založena na
Western blot detekci –
adaptováno pro kvasinky se
selekcí na klasickém principu
(reportérového genu)
Bruckner et al, IJMS, 2009
Přehled kvasinkových PPI biotechnologií