• Proteinové interakce – 24.10.
– jak spolu proteiny interagují?
– interaktom
• Proteinové komplexy – 31.10.
– protein-proteinové interakce a komplexy
– komplexom, architektura a funkce komplexů
CG030 – Struktura a funkce proteinových komplexů
CG031 – cvičení z modelování proteinových komplexů
(jarní semestr)
doc. Jan Paleček
jpalecek@sci.muni.cz
Souhrn - protein-proteinové interakce
+
polá
hydrofob
rní
ní
primární
struktura
sekundární a terciární struktura
• proteiny jsou troj-rozměrné - mají různé tvary a více domén =>
mají více vazebných míst na povrchu => komplexy a “sítě“
• části proteinů/domény/motivy interagují s partnery
– domény mají určitou strukturu, která do značné míry determinuje tvar
jejího povrchu, ale …
– charakter (hydrofobicitu, polaritu, náboj) povrchu určují postraní řetězce
aminokyselin směřujících do solventu, takže …
– interakce proteinu je determinována povrchem, který musí mít tvar i
charakter komplementární s interakčním partnerem (typy interakcí: …)
coiled-coil
… kvarterní struktura
Sergeant et al.: MCB, 2005 NSE1
Nse3
MAGEG1
NSE4
NSE2
SMC6 SMC5
- více povrchů jednoho proteinu interaguje s více partnery
- vzájemné interakce více proteinů vytváří větší povrchy a
vzájemně se stabilizují – vzniká pevný (kvarterní) komplex
Nse4
Protein-proteinové interakce
• stabilní (velké plochy, většinou součástí komplexů)
• přechodné/slabé (součást dynamických procesů – předávání
signálů, modifikace)
• posttranslační modifikace mohou změnit vazebné vlastnosti
povrchu (fosforylace, ubiquitinace, SUMO)
• souhrn proteinových interakcí = interaktom
(modularita díky interakcím domén – různé kombinace domén
- různé „(re-)wiring“ komplexů)
interaktom
komplex
Baderetal,FEBSLett,2008
modulování interakcí – inhibice (virovými proteiny, mutacemi) vs nové interakce
Srovnání interaktomů => konzerv. interakcí (=> evoluce komplexů => evoluce organismů )
Síť neznamená komplex
(hůře popisuje stabilní
komplexy, ale lépe
popisuje vztahy)
Síť neznamená komplex (hůře popisuje
stabilní komplexy, ale lépe popisuje vztahy)
Interaktom x komplexom
Wang et al., Nature, 2004
transkripce
MAPK
- PPI „přiblíží“ proteiny vs difuze
- koordinované předávání
signálů, substrátů …
- ligandy, PTM … modulují PPI
… procesy
Regulace/modulace interakcí
α
γ
β
k kk
kkkk
kkk
scaf
kkk
k
G-proteiny (β, γ) disociují a následně
interagují (β) se scafold proteinem Ste5 …
Fus3 relokalizuje do jádra a aktivuje Ste12
Replikace DNA (video): DNA helikasa “denaturuje” dvoušroubovici (modrá) –
připojen je „clamp loader“ (šedá tlapka) - 2 raménka drží DNA polymerásy (fialové)
spojené s PCNA („sliding clamp“, zelená). „Leading strand“ je syntetizován
kontinuálně zatímco „lagging strand“ musí být primásou (žluto-zelená) odstartován
(RNA primer = žlutý – Okazakiho fragmenty).
Dynamika komplexů - PPI
DNAi_replication_vo2-lg
Kelch et al, BMC Biol, 2012
Citace, popis
Kelch et al, BMC Biol, 2012
Kelch et al, Science, 2011ATP modulace - clamp loader
ATP
ADP
Aktivovaný (ATP) clamp loader interaguje s PCNA a otevírá ji pro DNA. Vazba
DNA stimuluje hydrolýzu ATP a uvolnění clamp loader (uzavřeného s DNA).
PCNA-Fen1 -> PCNA-Lig1
Zheng a Shen, J Mol Cell Biol, 2011
Gao a spol, Mol Cell, 2012
po skončení syntézy „lagging strand“ metylovaný
Fen1 (flap endonucleasa) nahradí polymerásy a
vyštěpí RNA primer (demetylace a fosforylace
disocuje Fen1) - … degradace
poté PCNA asociuje s Lig1 (ligásou), která spojí
cukrfosfátovou kostru
Posttranslační (PTM) modifikace
modulují složení komplexu
PCNA – regulace buněčného cyklu
p21 blokuje přístup polymerás – zastaví se
replikace a buněčný cyklus v S fázi
p21 je upregulován nádorovým supresorem p53
(v případě poškození DNA …)
Magaetal,FASEBJ,2004
p21 interaguje s
PCNA podobným
způsobem jako
polymerasy
(kompetuje)
Freudenthal et al, NSMB, 2010
pokud je DNA poškozená, polδ se
zastaví a je třeba poškození nejdříve
opravit – jednou z možností je
„zastoupení“ jinou polymerásou, která
poškozené místo „toleruje“ a překopíruje
(translesion synthesis) – přepíná se
ubiquitylací PCNA (na „zadní straně“) TLS
polymerasy (η, ι, κ) obsahují PIP a
UBM motivy pro interakce s Ubi-PCNA
Bergink & Jentsch, Nature, 2009
Sale et al, JCS, 2012
Oprava DNA: PCNA-ptm
TLS polymerasy (η, ι, κ)
obsahují UBM (správně
přečtou chybu a zařadí
správnou bázi)
Srs2 (antirekombinása)
obsahuje SIM (nedovolí
rekombinaci v průběhu
replikace)
Template switch
K63 polyUb
PCNA asociuje s CAF1 (chromatin
assambly factor) a pomáhá
znovunavázání histonů (nukleosomů) a
vzniku chromatinu
Dohke et al, Genes to Cells, 2008
Ransom et al, Cell, 2010
PCNA je “swiss-army knife”
(PCNA je „core – jádro“ komplexů)
PCNA – moduly
PCNA je „jádrem“ pro mnoho „attachments“
tj. s mnoha funkčními moduly
- Loading
- Sliding
- Terminace
- Buněčný cyklus
- TLS a oprava DNA
- Chromatinizace …
Gavin et al., Nature, 2006; Krogan et al, Nature, 2006
Izolace komplexů z kvasinky Saccharomyces cerevisiae
2
Liljas a spol.
ATPasová pumpa komplex
se stálým
složením/poměrem
podjednotek („neměnný“)
Stabilní komplex – molekulární stroj
14.4-ATP_synthase
Iino et al., CO in SB, 2015
PDB: 1C17:Apumpa obsahuje arginin, který předává proton/vodík aspartátu
Rastogi & Girvin, Nature, 1999
pumpa obsahuje arginin, který předává proton/vodík
aspartátu (ve vodném prostředí by byl negativně
nabitý, ale v prostředí lipidické membrány nikoli).
Dochází k neutralizaci náboje – otočka.
„ATP syntasa je jedním z divů molekulárního světa“. Je to dvojitý molekulární motor
– „nanostroj“ – vyrábějící většinu ATP (energie).
Molekula měsíce v prosinci 2005
Rastogi & Girvin, Nature, 1999
F0 je protonový rotor (uložen v
membráně) poháněný tokem vodíkových
iontů (z dýchacího řetězce) přes
membránu. Tento rotor je spojen s
druhým F1 chemickým motorem
poháněným ATP (nebo vyrábějícím ATP).
Oba rotory jsou spojeny statorem.
Pouze některé části byly vykrystalizovány (zbylé
části doplněny dle EM)
Mulkidjanian et al, NRM, 2007
mitochondriální vakuolární
Burkinshaw et al, BBA, 2014
Type III secretion systém (T3SS - injectisome)
– bakteriální patogeny injikují (efektorové)
proteiny skrze „jehlu“ do hostitelské buňky –
ATPasová část pomáhá „protlačit“ efektorové
proteiny z patogení bakterie skrze „jehlu“ do
hostitelské buňky
Mulkidjanian et al, NRM, 2007
- ATPasové pumpy …
- sekreční systém (T3SS injectisom)
- pohon bičíků …
Více CG030
•Cytoskeletalní motory
• Myosin – svalová kontrakce, transport váčků
• Kinesin - transport váčků po mikrotubulech od jádra
• Dynein - transport váčků po mikrotubulech k jádru, pohyb bičíků
•Rotační motory:
• FoF1-ATP syntása/ATPasa – přeměna energie ATP na elektrochemický
potenciál nebo naopak (mitochondrie) – pumpování protonů přes
membránu (vakuoly)
• rotace bakteriálních bičíků
•Motory nukleových kyselin:
• RNA polymerase – přepisuje DNA do RNA
• DNA polymerase – syntetizuje druhý řetězec na ssDNA
• Helicases – odděluje řetězce DNA (transkripce, replikace …)
• Topoisomerases - redukce supercoiling DNA
• RSC a SWI/SNF komplexy remodelují chromatin
• SMC proteins – zodpovědné za vytváření smyček na chromatinu
Molekulární motory
– evoluční výhoda podjednotek (nový komplex vzniká duplikací
a novou kombinací podjednotek/modulů)
Proč skládat komplexy z menších podjednotek?
– evoluční výhoda podjednotek (nový komplex vzniká duplikací
a novou kombinací podjednotek/modulů)
– komplexy mohou být dynamičtější - modulárnější …
Proč skládat komplexy z menších podjednotek?
– evoluční výhoda podjednotek (nový komplex vzniká duplikací
a novou kombinací podjednotek/modulů)
– komplexy mohou být dynamičtější - modulárnější …
– skládání i rozpad komplexů jsou snadněji kontrolovatelné,
reversibilní (protože podjednotky asociují skrze množství
relativně slabých interakcí - nízká energie)
– skládání funkčního komplexu na specifickém místě (toxin je
transportován jako rozpustný monomer a poté se skládá =>
stává se toxickým až mimo původní buňku)
Proč skládat komplexy z menších podjednotek?
bakteriální toxin
porin v mitochondrii
– evoluční výhoda podjednotek (nový komplex vzniká duplikací
a novou kombinací podjednotek/modulů)
– komplexy mohou být dynamičtější - modulárnější …
– skládání i rozpad komplexů jsou snadněji kontrolovatelné,
reversibilní (protože podjednotky asociují skrze množství
relativně slabých interakcí - nízká energie)
– skládání funkčního komplexu na specifickém místě (toxin je
transportován jako rozpustný monomer a poté se skládá =>
stává se toxickým až mimo původní buňku)
– velký komplex (homo-oligomer) může být kódován relativně
krátkou genetickou informací (skládá se menší protein – větší
je méně stabilní a hůře se skládá)
– menší pravděpodobnost defektní makromolekuly (menší gen
=> méně mutací + dá se relativně snadno vyhnout chybám –
odstraní/degraduje se pouze jedna poškozená menší
podjednotka => méně energie než pro nápravu celé struktury)
Proč skládat komplexy z menších podjednotek?
Kde najít více proteinových komplexů = PDB
Interaktivní web PDB-101 - relativní velikost komplexů
voda, ATP ATP pumpa
mikrotubuly chromatin
proteasom
Příklady komplexů
chaperon
apoptosom
ATP pumpa
Více CG030
Shrnutí
• Proteiny mohou být součástí jednoho (stabilní) nebo více
komplexů (dynamické/modulární)
• Dynamické/modulární komplexy (PCNA)
– množství podjednotky determinuje složení komplexu
– Interakce/složení podjednotek dynamických komplexů
jsou modulovány např. posttranslačními modifikacemi
• Stabilní komplexy (ATPasová pumpa)
– podjednotky jsou často koexprimovány (koexprese je
vzájemně stabilizuje, lepší rozpustnost)
– stabilní komplexy disociují proteolyticky
– pokles hladiny jednoho proteinu má za následek
pokles hladiny ostatních podjednotek
CG030 – Struktura a funkce proteinových komplexů
CG031 – Cvičení z modelování proteinových komplexů
jarní semestr - doc. Jan Paleček
Molecular machinery of life:
https://www.youtube.com/watch?v=FJ4N0iSeR8U
Test 1• testy předat příště přednášejícímu
• 1. Jaké typy AMK se nejčastěji podílejí na protein-proteinových interakcích?
• a. plární
• b. nabité
• c. hydrofobní
• d. aromatické
•
• 2. Jaké sekundární struktury se podílí na coiled-coil vazbě?
• a. beta-listy
• b. beta-listy a šroubovice
• c. smyčky
• d. vzájemně se obtáčející šroubovice
•
• 3. interaktom je:
• a. interakční síť proteinů (pro daný organismus)
• b. soubor všech interakcí jednoho proteinu
• c. databáze všech interakcí biomakromolekul
• d. interakce podílející se na vzniku komplexů
• 4. Jaké charakteristiky musí splňovat povrchy vzájemně interagujících proteinů?
• a. stačí, když mají opačné náboje
• b. stačí, když mají komplementární tvary
• c. musí mít komplementární charakter (tvar, polaritu)
• d. stačí, když jsou hydrofobní
• 5. napište aspoň 2 příklady proteinů s coiled-coil doménou:
Test 2• testy předat příště přednášejícímu
• 6. Co je to komplexom?
• a. interakční síť proteinů v buňce
• b. soubor všech interakcí jednoho proteinu
• c. soubor proteinových komplexů v buňce
• d. síť silných interakcí
• 7. Jak může post-translační modifikace proteinu přímým způsobem ovlivnit protein-proteinovou interakci?
• a. nemůže ji ovlivnit
• b. ovlivní pouze konformaci proteinu
• c. blokuje nebo posílí vazbu
• d. degraduje protein
• 8. Jaké hlavní výhody skýtá proteinový komplex složený z podjednotek (oproti stejně velké makromolekule
obsahující pouze jeden protein)?
• a. lepší dynamika, modularita, regulace
• b. větší stabilita proteinů
• c. lepší přístup k proteinům
• d. účinnější převod regulačních signálů
• 9. Jak pracuje mitochondriální ATP pumpa při konverzi ADP na ATP?
• a. transportuje přes membránu Na+
• b. využívá molekulu cGMP
• c. transportuje K+ přes membránu
• d. generuje rotační pohyb při transportu H+ přes membránu
• 10. napište aspoň 3 příklady molekulárních strojů:
•
•
•