Integrované laboratoře molekulární cytogenetiky Oddělení genetiky a molekulární biologie Ústav experimentální biologie PřF MU Oddělení lékařské genetiky FN Brno http://www.sci.muni.cz/cytogenlab/ Budoucnost medicíny: tahounem bude genetika !!! Genomika Personalisovaná medicína Lékařská genetika se snaží odhalovat příčiny závažných dědičných onemocnění Přínosem lékařské genetiky je poznání molekulární patogeneze onemocnění Pochopení molekulárně genetické podstaty chorob umožňuje jejich přesnou diagnostiku a v mnoha případech i cílenou léčbu Kdo jsme ? Integrované laboratoře molekulární cytogenetiky vznik 1997 jako společné vědeckopedagogické pracoviště, na jehož činnosti se podílí: • Přírodovědecká fakulta MU (Oddělení genetiky a molekulární biologie ÚEB) • Fakultní nemocnice v Brně (Oddělení lékařské genetiky) Spolupráce: • Babákova výzkumná skupina (ÚPF Lékařská fakulta, MU v Brně) • Oddělení gynekologické onkologie (MOU Brno) Hlavní činnosti laboratoře 2018 1. molekulárně cytogenetická vyšetření pacientů FN Brno (OLG FN Brno) – zavádění nových technik do klinické praxe 2. teoretická i praktická výuka studentů bakalářských, magisterských a doktorských programů PřF MU a LF 3. výzkumy v oblasti molekulární cytogenetiky • analýzy vrozených chromozomových změn ve vztahu k některým dědičným onemocněním (děti s mentální retardacemi a VVV) • vyšetření získaných chromozomových aberací u některých hematologických malignit a solidních nádorů ve vztahu k prognóze onemocnění (dětské nádory, mnohočetný myelom, karcinom děložního čípku) Laboratorní medicína - specializace oblast molekulární cytogenetiky člověka!!! Personální složení laboratoří 2018 • RNDr. Vladimíra Vallová, PhD. • Mgr. Jan Smetana, PhD. PhD. student • Mgr. Markéta Wayhelová 2 Mgr. studenti 4 Bc. studenti Pracovníci OLG: Mgr. Hana Filková Mgr. Eva Zrnová, PhD. Spolupráce s OLG FN Brno • http://www.sci.muni.cz/cytogenlab/ Genetická poradna - ambulance Laboratoře cytogenetické (prenatální, postnatální, molekulárně cytogenetické, onkocytogenetické) Laboratoře molekulárně genetické (monogenně podmíněná onemocnění, onkogenetika, identifikace jedinců..) Naše laboratoře na OLG FN Brno – Dětská nemocnice I. Cytogenetická vyšetření pacientů FN Brno Klinické indikace pro vyšetření karyotypu člověka • problémy časného růstu a vývoje (neprospívání, opoždění, malá postava, obojetný genitál, mentální retardace) • narození mrtvého plodu a úmrtí novorozence • problémy s fertilitou • rodinná anamnéza (známá chromozomová abnormalita u příbuzných I. stupně) • těhotenství u žen pokročilého věku • nádorová onemocnění • jednobarevná a dvoubarevná FISH - 1996 • I-FISH - 1998* • CGH – 2000, HR-CGH 2005 • M-FISH, SKY – 2002 • FICTION – 2003 • MLPA, ARRAY – CGH 2006* • NGS – 2015 Zavedené techniky pro vyšetřování pacientů OLG FN Brno aneb co jsme už dokázali… Akreditovaná cytogenetická laboratoř – ČIA: norma 15189 -2013 Akreditovaná vyšetření: Vyšetření chromozomových aberací z biologického materiálu metodou fluorescenční in situ hybridizace (FISH) Vyšetření chromozomových aberací z biologického materiálu metodou komparativní genomové hybridizace na oligonukleotidových mikročipech (array-CGH) II. Kontaktní výuka na MU Výuka pro obory Molekulární biologie a genetika Lékařská genetika a molekulární diagnostika Předměty: Bi 3060 Obecná genetika Bi 3061 Praktikum z obecné genetiky – cvičení Bi 6170 Genetika II Bi 6270 Cytogenetika Bi 6270c Cytogenetika – cvičení Bi 7250 Lékařská genetika a genetické poradenství Bi9325 Molekulární genetika člověka Naše laboratoře na MU v UKB A3 Cytogenetika – cvičení III. ročník, letní semestr Bakalářské a diplomové práce vypisované 2017/2018 Bakalářské práce: Školitel: doc. RNDr. Petr Kuglík, CSc. • Molekulární mechanismy vzniku chromozomových aberací • Význam ztráty chromozomu Y z hlediska zvýšeného rizika onemocnění a mortality u stárnoucích mužů • Genomové poruchy na chromozomu 22 Mgr. Markéta Wayhelová • Poruchy organizace chromatinu v patogenezi mentálních retardací • Význam nekódujících oblastí lidského genomu v patogenezi poruch autistického spektra Mgr. Jan Smetana, PhD. • Molekulárně genetická charakteristika Ph-like akutní lymfoblastické leukemie Diplomová práce: Školitel: doc. RNDr. Petr Kuglík, CSc. • Detekce patogenních genetických variant pomocí sekvenování nové generace u dětských pacientů s mentální retardací Bakalářské a diplomové práce vypisované 2018/2019 Bakalářské práce Doc. RNDr. Petr Kuglík, CSc. • Trizomie pohlavních chromozomů u mužů 47,XYY a tendence ke kriminálnímu chování • Genetické a epigenetické mechanismy stárnutí Mgr. Jan Smetana. PhD. • Význam genomických studií genetické variability populací pomocí masivně paralelního sekvenování pro klinickou praxi Mgr. Markéta Wayhelová • Sekvenční variabilita lidského mitochondriálního genomu a její význam v patogenezi poruch autistického spektra Diplomové práce Doc. RNDr. Petr Kuglík, CSc. • Analýza vybraných molekulárních markerů dětských mozkových nádorů a jejich prognostický význam III. Výzkumy a grantové projekty 2018 Ukončené projekty (do roku 2015) • Úloha genetických abnormalit ve vývoji a progresi prekancerózy monoklonální gamapatie nejasného významu – IGA MZ 2015 • Diagnostický význam amplifikace genů hTERC a MYCC při vzniku a vývoji cervikálních intraepiteliálních dysplázií a karcinomu děložního hrdla - IGA MZ: NT11089-4/2010 Nově řešené a podané projekty - 2018 • Detekce patogenních genetických variant u dětských pacientů s mentálními retardacemi pomocí sekvenování „nové generace“ (NGS) pro individualizaci a zlepšení lékařské péče • Inovace praktické výuky v předmětu Bi6270c Cytogenetika-cvičení: rychlé vyšetření aneuploidií chromozomů 13, 18, 21, X a Y metodou QF-PCR a implementace interaktivních prvků do výuky Genetické příčiny mentálních retardací a vrozených vývojových vad u dětí • MR - heterogenní manifestace dysfunkce CNS charakterizovaná podprůměrnými intelektuálními funkcemi • Postihuje 1-2 % populace (Tao et al., Nature Gen., 2016) • Často spojena s celkovým vývojovým opožděním, vrozenými vývojovými vadami (VVV), faciální stigmatizací aj. Komplexní etiologie • Negenetické příčiny • Genetické příčiny • (syndromické x nesyndromické MR) u Na OLG FN Brno přichází cca 200 dětí s MR ročně…. Nejčastější genetické příčiny MR mikrodelece 22q13 Př. syndrom Phelan McDermid patogenní sekvenční varianty Bodové mutace Strukturní aberace - CNVs – např. mikrodelece, mikroduplikace Početní chromozomové aberace Metody vyšetření genetických příčin u dětských pacientů s MR/VVV Vyšetření karyotypu Molekulární cytogenetika Subtelomerická FISH Molekulární diagnostika MLPA Molekulární karyotypování array-CGH (DNA čipy) Sekvenování „nové generace“ NGS záchyt ~ 3 % záchyt ~ 6 % záchyt ~ 6-10 % záchyt ~ 15-20 % SNVs záchyt ~ 42 %CNVs Současný algoritmus genetického vyšetření pacientů s MR/VVV na OLG FN Brno MLPAarray-CGH FISH FISH,QF-PCR Susp. specifický syndrom Karyotyp G-pruhování negativní ověření NGS negativní Neúčinnější jsou celogenomové techniky ! Vyšetření dětí s MR a VVV – technika array-CGH Zpracování DNA čipů pro techniku array-CGH 5. Scanning www.agilent.com Array-CGH profil Celkový záchyt CNVs u pacientů s MR/VVV vyšetřených pomocí array-CGH 2007-2017 Celkově provedeno 395 vyšetření pomocí oligonukleotidové array-CGH (208 chlapců, 187 dívek) • 226 vyšetření s normálním karyotypem • 169 vyšetření s pozitivním nálezem, tj. 42,8 % Nalezeno:  76 patogenních /pravděp. patogenních CNVs (19,2 %)  14 CNVs nejasného významu (3,5 %)  66 pravděpodobně benigních CNVs (16,7 %)  13 nálezů dosud nedošetřeno (3,3 %) Nejčastější mikrodeleční a mikroduplikační syndromy u dětských pacientů s MR a VVV detekované metodou array-CGH (2007-10/2017) rekurentní mikrodelece rekurentní mikroduplikace del 1q21.1 4x dup 1q21.1-q21.2 2x del 1q43-q44 4x dup 15q11.2-q13.1 3x del 16p11.2 4x dup 17q11.2 2x del 22q11.21-q11.22 4x dup 22q11.21 3x del 22q13.2-q13.33 2x del 11q24-q25 2x del 15q11.2 3x nerekurentní mikrodelecee nerekurentní mikroduplikace 34 mikrodelecí 15 mikroduplikací • navíc bylo detekováno 18 nálezů přestaveb alespoň 2 chromozomů (např. nebalancované translokace) nebo vícenásobných přestaveb 1 chromozomu Stanovení korelace genotyp – fenotyp příklad mikrodelece 2q13 – velikost mikrodelece, postižené geny, vliv na fenotyp… • … Hlavní genetickou příčinou MR jsou genové mutace ! Sekvenování - molekulární diagnóza až u 60 % pacientů Gilissen G. al.: Genome sequencing identifies major causes of severe intellectual disability. Nature 511, 2014 Lisenka E. et al: Genetic studies in intellectual disability and related disorders. Nature Reviews 17, 2016 Genetické příčiny MR – vrozené bodové mutace de novo dominantní mutace >700 genů spojených s MR vliv věku otce ! * Každý novorozenec si přináší: • 75 de novo mutací/genom • 1 de novo mutace/exom • 1 de novo mutace na 20565 protein kódujících genů/generaci Jónsson et al. 2017 92 % MR – sporadické případy, nepostižení rodiče Masivní paralelní sekvenování - NGSMasivní paralelní sekvenování - NGS • Princip • nové typy sekvenátorů (odtud NGS – next generation sequencing) umožnují paralelní sekvenování až tisíců molekul DNA současně = nižší náklady, úspora času • Systémy pro NGS • - v současnosti dominuje Illumina, Ion Torrent (založeny na PCR amplifikaci templátu) • - single molekule sequencing („3rd generation sequencing“) – HeliScope, PacBio RS SMRT systém, Oxford Nanopore • Worflow • a) příprava templátu neboli vytvoření knihovny amplikonů, • b) sekvenování a detekce inkorporovaných nukleotidů a • c) analýza dat • • Cílené (panel genů) • Exomové • Genomové Září 2016 - pilotní studie NGS u pacientů s PMR /VVV na OLG FN Brno – Najít SNV (SNPs + indely) asociované s fenotypem u 12 pacientů s MR / VVV bez detekované aberace standardními technikami – Spolupráce OLG FN Brno, LMC MUNI, IBA MUNI, CEITEC – Agilent SureSelect Inherited Disease Panel (2742 genů spojených s dědičnými chorobami) – Sekvenátor: Illumina MiSeq, 2x150bp párové čtení Cílené sekvenování „nové generace“ (NGS) (2017) - výsledky 2015-2016: 16 dětských pacientů s PMR/VVV (6 dívek, 10 chlapců) normální karyotyp a array-CGH bez nálezu patogenní CNV Pohlaví, rok narození gen genomová pozice (hg19) detekované sekvenční varianty Úroveň proteinu chlapec, *2004 MED13L NC_000012.11: g.116446801_116446804delGTCT p.(Gln473fs) dívka, *2013 ASXL3 NC_000018.9:g.31320374delT p.(Arg1004fs) dívka, *2016 TSEN54 NC_000017.10:g.73512930C>G NC_000017.10:g.73518081G>T p.(Arg54Gly) p.(Ala307Ser) dívka, *2014 SCN2A NC_000002.11:g.166243337A>G p.(Met1545Val) chlapec, *2007 SCN2A NC_000002.11:g.166166923C>T p.(Ala263Val) Pomocí cíleného NGS byla u 5 z 16 dětských pacientů (31,25 %) detekována patogenní/pravděpodobně patogenní sekvenční varianta Trio“ analýza – sekvenování postiženého dítěte a jeho rodičů Cílené sekvenování „nové generace“ (2017- 2018) - trio analýza vyšetřeno 14 rodin („trio“ analýza) – děti s MR/VVV a jejich rodiče * 4 rodiny – nálezy patogenních/pravděpodobně patogenních variant 1. rodina: syn a dcera po příbuzenském sňatku (rodiče bratranec a sestřenice) o geny ZNF644, SCN1A, PRODH, NPHS1, ABL1, HOXD10, PAH, MAGI1 o geny SPTAN1, SH3PXD2B (nalezeny varianty nejasného významu) 2. rodina: 1 dcera (PMR, faciální stigmatizace, rozštěp tvrdého a měkkého patra) o gen POLG (2 pravděpodobně patogenní varianty na maternální alele, 1 polymorfní SNP s modulujícím efektem in trans na paternální alele) o gen CACNA1H – varianta p. R797H de novo, dle in silico predikce pravděpodobně patogenní 3. rodina: 1 syn (PMR, faciální stigmatizace, VVV mozku) o gen TUBB3 – varianta p. E410K de novo, klasifikována v databázích klinických variant, recentní literatuře a dle in silico predikce jako patogenní 4. rodina: 2 synové (těžká PMR, epilepsie, parciální deficience biotinidázy) o gen IQSEC2 – u obou bratrů detekována varianta p.D605Pfs*3 maternálního původu. Dle in silico predikce klasifikována jako patogenní v patogenezi X-vázaných PMR. Nebyla detekována u zdravého bratra. o gen BTD - patogenní varianta p.R444H v homozygotním stavu u obou bratrů, rodiče jsou zdraví heterozygotní přenašeči této varianty, nyní probíhá cílené doplňující vyšetření u zdravého bratra. Cílené sekvenování „nové generace“ (2017-2018) Publikace 2018 • Wayhelova M., Oppelt J., Smetana J, Filkova H., Hladilkova E., Soukalova J., Gaillyova R., Kuglik P.: Two distinct de novo pathogenic sequence variants in SCN2A gene in children with intellectual disability and epileptic encephalopathy. Journal of Neurological Disorders (přijato) • Marketa Wayhelova, Jan Oppelt, Jan Smetana, Hana Filkova, Eva Hladilkova, Rastislav Beharka, Renata Gaillyova, Petr Kuglik: Novel de novo frameshift variant in the ASXL3 gene in a child with microcephaly and global developmental delay (odesláno) Pohled do našich laboratoří… http://www.sci.muni.cz/cytogenlab/ Výhody a nevýhody práce studentů v laboratořích FN Brno • Výhody – možnost získat potvrzení o praxi ve FN Brno… • Nevýhody – mohou zde pracovat až studenti po zadání BP nebo DP…jinak je to považováno za stáž, kterou si studenti musí platit…? • (vyjimka placená brigáda..) Uplatnění absolventů oboru Molekulární biologie a genetika a Lékařská genetika a molekulární diagnostika s titulem Mgr. ve zdravotnictví Uplatnění absolventů Přírodovědecké fakulty ve zdravotnictví • genetika a molekulární biologie patří mezi obory studované na PřF, které mají uplatnění ve zdravotnictví ( ale i mikrobiologie, biochemie….), absolvent s titulem Mgr. VŠ nelékařský zdravotnický pracovník • medicína je stále více závislá na laboratořích a analýzách genetických dat • je třeba vychovávat specializované odborníky profilované pro práci ve zdravotnických laboratořích či v základním výzkumu (AKREDITACE LABORATOŘÍ !!! – nutnost VŠ s atestací, personální minimum) • zákon 96/2004 Sb., definuje požadavky na odbornou způsobilost VŠ-nelékařů působících ve zdravotnických zařízeních • Absolventi některých oborů studovaných na PřF (s titulem Mgr.) mohou pracovat ve zdravotnických laboratořích na pozici VŠ – nelékař jako „Odborný pracovník v laboratorních metodách (OPLM - bioanalytik) • nejsou to laboranti…..!!! • jedná se o regulované povolání (profesi) !!! Regulovaným povoláním nebo činností se rozumí takové povolání nebo činnost, pro jejichž výkon jsou právními předpisy členského státu EU předepsány určité požadavky (odborná způsobilost), bez jejichž splnění nemůže osoba toto povolání či činnost vykonávat (např. stupeň a obor vzdělání, praxe, bezúhonnost, zdravotní způsobilost, pojištění odpovědnosti za škodu způsobenou výkonem předmětné činnosti atp.) Nelékařský zdravotnický pracovník, který vykonává a) laboratorní činnost v rámci diagnostické péče a vyšetřování a měření složek životních a pracovních podmínek v rámci ochrany veřejného zdraví, b) přípravu léčivých přípravků na pracovištích nukleární medicíny, imunologických či mikrobiologických pracovištích zdravotnických zařízení nebo v zařízeních ochrany veřejného zdraví. Popis činnosti (zákon č 96/2004 Sb.) Odborný pracovník v laboratorních metodách (OPLM) a v přípravě léčivých přípravků Zákon č 96/2004 Sb. • § 26 • Odborná způsobilost k výkonu povolání odborného pracovníka v laboratorních metodách (OPLM - bioanalytik) a v přípravě léčivých přípravků • (1) Odborná způsobilost k výkonu povolání odborného pracovníka v laboratorních metodách a v přípravě léčivých přípravků se získává absolvováním • a) akreditovaného zdravotnického magisterského studijního oboru pro přípravu odborného pracovníka v laboratorních metodách, nebo • b) akreditovaného magisterského studijního oboru přírodovědného zaměření a akreditovaného kvalifikačního kurzu – AKK- odborné zdravotnické laboratorní metody nebo kvalifikačního kurzu výroba, příprava a kontrola léčivých přípravků LGMD MBG Akreditovaný kvalifikační kurz – AKK www.ipvz.cz Musí absolvovat studeni oborů, které nemají akreditaci MZ… VYHLÁŠKA 39/2005 Sb. ZE DNE 11. LEDNA 2005, KTEROU SE STANOVÍ MINIMÁLNÍ POŽADAVKY NA STUDIJNÍ PROGRAMY K ZÍSKÁNÍ ODBORNÉ ZPŮSOBILOSTI K VÝKONU NELÉKAŘSKÉHO ZDRAVOTNICKÉHO POVOLÁNÍ • § 25 ODBORNÝ PRACOVNÍK V LABORATORNÍCH METODÁCH A V PŘÍPRAVĚ LÉČIVÝCH PŘÍPRAVKŮ • (1) Odborná způsobilost k výkonu povolání odborného pracovníka v laboratorních metodách a v přípravě léčivých přípravků se získává absolvováním akreditovaného studijního programu nebo akreditovaného studijního programu a vzdělávacího programu kurzu. • (2) Programy uvedené v odstavci 1 mají celkovou standardní dobu studia a) v akreditovaném magisterském studijním programu po získání úplného středního vzdělání nejméně 5 let, z toho praktické vyučování činí nejméně 500 hodin, • b) v akreditovaném magisterském studijním programu navazujícím na akreditovaný bakalářský studijní program přírodovědného zaměření nejméně 2 roky, z toho praktické vyučování činí nejméně 500 hodin; požadavky na počet hodin praktického vyučování a požadavky stanovené v odstavci 3 mohou být absolvovány také v průběhu předcházejícího studia v akreditovaném bakalářském studijním programu. Povinné pro LGMD ! VYHLÁŠKA 39/2005 Sb. • (3) Studium v programech uvedených v odstavci 1 poskytuje znalosti a dovednosti stanovené v § 3 a dále obsahuje • a) teoretickou výuku poskytující znalosti v 1. oborech, které tvoří základ potřebný pro poskytování zdravotní laboratorní péče a přípravu léčivých přípravků, a to ve zdravotnické informatice, matematice, fyzice, chemii a biochemii, biologii, anatomii, fyziologii a patologii, základech radiační ochrany, • 2. klinických laboratorních a souvisejících oborech, a to v lékařské mikrobiologii, cytologii a histologii, molekulární biologii a genetice, klinické imunologii a alergologii, klinické biochemii a toxikologii, klinické hematologii a transfuzním lékařství, laboratorních metodách v ochraně veřejného zdraví, farmakologické propedeutice v oblasti přípravy radiofarmak, základech klinických lékařských oborů (zejména vnitřního lékařství, infekčního lékařství, intenzivní medicíny a pediatrie), ve zdravotnických prostředcích, zejména v laboratorních zdravotnických přístrojích, v zabezpečování systému jakosti, • 3. souvisejících oborech, a to v komunikačních dovednostech, základech informatiky, statistiky a metodologie vědeckého výzkumu, Odlišnosti oboru Lékařská genetika a molekulární diagnostika • profesní obor – bakalářský a přímo navazující magisterský • mezifakultní obor (PřF a LF) – některé předměty se učí na LF • upravený studijní plán – větší množství předmětů povinných • kladen větší důraz na praktickou výuku a spolupráci s praxí • v souvislosti s novelou VŠ zákona budou Bc. i Mgr. obory po roce 2020 transformovány na samostatné programy Akreditace MZ Jak to funguje v praxi? • V reálné praxi vypadá situace tak, že pokud se objeví volné VŠ místo například ve FN v Brně na Oddělení lékařské genetiky, může být na základě získaného vzdělání a výběrového řízení přijat čerstvý absolvent Přírodovědecké fakulty - obor Molekulární biologie a genetika s titulem Mgr. • Tento absolvent bude kvalifikačně zařazen jako VŠ - technický pracovník, dokud neabsolvuje AKK Odborné zdravotnické laboratorní metody v Praze. • Po absolvování AKK splní podmínky zákona č. 96/2004 Sb., bude zařazen do kategorie VŠ-NLZP, získá způsobilost pracovat pod odborným dohledem a eventuálně se může připravovat na další zvýšení kvalifikace v podobě atestace. • Do kategorie NLZP bude automaticky zařazen absolvent obor LGMD s titulem Mgr. • POZOR – AKK kurzy neexistuji pro absolventy – bakaláře !!! • Bakaláři MBG a LG nemohou pracovat ve zdravotnictví !!!