Gelová elektroforéza

Reagencie:

AgarGel H/M Biotech Grade Agarose, 20–5000 bp, MERCURY

Agarose SERVA for DNA electrophoresis research grade, SERVA.

Hmotnostní standard:100 bp DNA standard ladder. SERVA.

MetaPhor® Agarose, LONZA.

TBE pufr 10 x, SERVA.

PCR produkt

Spotřební materiál:

Váženky, 20 µl pipeta, špičky, lžička, skleněné kádinky, víka na kádinky

Laboratorní vybavení:

Elektroforetická vana: Midigel XL. Apelex

Elektromagnetické míchadlo: Monotherm. Variomag

Mikrovlnná trouba: mikrovlnná trouba Electrolux 1300W

Váhy: ACB plus-300. Adam Equipment.

Zdroj napětí: PS 304 MiniPac II. Apelex

Ethidium bromid

Postup:

1.       Na 3% agarózový gel odvážíme 2,1 g agarózy, kterou rozmícháme v 80 ml TBE pufru.

2.       Směs promícháváme pomocí elektromagnetického míchadla. V momentě, kdy se agaróza
rozsuspendovala, vložíme kádinku do mikrovlnné trouby, nastavíme na nejnižší výkon a směs ohříváme,
dokud nezačne vřít (bublat). Troubu vypneme, navýšíme výkon a postup opakujeme až do momentu, kdy
se po při varu neobjevují drobné bublinky. Poté necháme tekutou agarózu vychladnout.

3.       Při cca 60°C přimícháme 20 µl ethidium bromidu. Směs necháme vystydnout na 50 °C a
nalijeme ji do elektroforetické vany s hřebenem. Gel tuhne 45 minut, poté vyjmeme hřeben.

4.       Zalijeme 1,5 l TBE pufru a do jamek pipetujeme 10 µl alelického žebříku, 10 µl PCR
produktu smíšeného s nanášecí barvičkou. Elektrody zapojíme do zdroje napětí a zpustíme reakci.
Napětí je nastavováno automaticky. Výsledky elektroforetické separace lze hodnotit v momentě, kdy
nanášecí modrá barva doputovala cca do 2/3 gelu.

SYBR®Green I nucleic acid gel stain (Sigma Aldrich)

Postup:

1.       Připravte barvicí lázeň: 100µl SYBR®Green I nucleic acid gel stain v 1l TBE pufru. Lze
uchovávat v temnu a chladu (2 - 8°C)po dobu 3 – 4 dny.

2.       Proveďte elektroforézu běžným způsobem.

3.       Vyjměte gel z elektroforetické vany a ponořte do barvicí lázně tak, aby byl pomořen.
Barvení probíhá 20 – 40 minut.

4.       Po dokončení elektroforézy vyhodnoťte standartním způsobem

Nancy – 520 DNA Gel stain (Sigma Aldrich)

Postup:

1.       Připravíme agarózový gel ale standardního postupu (1. – 2.)

2.       Místo ethidium bromidu přidáme do chladnoucího gelu 16 µl Nancy – 520 Dna stain solution

3.       Smíchejte vzorek s gelovou barvou

Proveďte ELFO dle postupu „Ethidium bromid (4)

4.       Po dokončení elektroforézy vyhodnoťte standartním způsobem.