Izolace starobylé DNA (LBMA)

Chemikálie a pomůcky:
  * 0,5 M EDTA (Sigma-Aldrich Co.)
  * 0,5% SDS (ICN Biomedicals Inc.)
  * proteináza K (Qiagen)
  * MinElute^TM PCR purification Kit (Qiagen)
  * 2 ml zkumavky (Eppendorf AG)
  * 10 ml polypropylenové zkumavky (Equimed®)
  * špičky (Eppendorf AG)
  * pipety (Eppendorf AG)


Přístroje:
  * thermoshaker TS-100 (Biosan Ltd.)
  * centrifuga Centrifuge 5415D (EppendorfAG)
  * vortex mixer (Velp Scientifica)


Postup:

Metoda purifikace vychází z publikace Yanga et al., (1998) a Anderunga et al., (2008).
  * 100 mg kostního prášku bylo naváženo a vsypáno do zkumavky o objemu 2 ml.
  * Přidáme 1 ml extrakčního pufru (0,5 M EDTA pH 8,0 a 0,5% SDS) a 1 mg proteinázy K (20 μl).
  * Směs inkubujeme v thermoshakeru při 56 ºC po dobu 12 hodin. Do vzorku opět připipetujeme 1 mg
proteinázy K (20 μl) a směs znovu inkubujeme 12 hodin při 56 ºC.
  * Poté lyzát centrifugujeme po dobu 5 minut při 2000 rpm.
  * 750 μl supernatantu přepipetujeme do 10 ml zkumavky a přidáme 2,5 ml PB pufru.
  * 700 μl této směsi napipetujeme do kolonky a centrifugujeme 1 minutu při 13000 rpm.
  * Filtrát ve sběrné zkumavce odstraníme. Promývání směsi peletu a PB pufru opakujeme až do
spotřebování směsi.
  * Následně do kolonky přidáme 600 μl PE pufru.
  * Poté probíhá centrifugace 1 minutu na 13000 rpm.
  * Kolonku umístíme do nové 1,5 ml zkumavky a přidáme 50 μl EB pufru.
  * Vzorek minutu inkubujeme při pokojové teplotě.
  * Centrifigujeme 1 minutu na 13000 rpm. Ještě jednou opakujeme tento krok. Celkem tedy získáme
asi 96 μl produktu.