1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif • Luděk Bláha, PřF MU •Ekotoxikologie – závěr přednášek •nové přístupy a poznatky OPVK_MU_stred_2 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Přehled závěrečné přednášky •Moderní přístupy experimentální ekotoxikologie –In vitro modely –Biomarkery a „MOA“ (mode-of-action / omics) techniky • •Modely v ekotoxikologii –SAR a QSAR –AOP / PBPK / TOXCAST – •„Nové“problémy v ekotoxikologii –Nanočástice – •Novinky a zajímavosti 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Výzkum mechanismů toxicity •in vitro modely a biotesty • •Zjišťování účinků (Biologie, Toxikologie a Ekotoxikologie) - existuje velké množství modelů • •Účinky na celých organismech –Standardní biotesty in vivo: legislativa –„Nestandardní“ biotesty in vivo: experimentální výzkumná práce • •Pochopení a identifikace specifických mechanismů působení –In vitro modely: Orgánové / Tkáňové / Buněčné –Výhody •Mechanistické porozumění •Šetření experimentálních zvířat (etické principy „3R“) –Nevýhody •„Jen“ in vitro, chybí komplex a interakce v organismu ____2 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Výzkumy mechanismů toxicity •in vitro modely a biotesty • ____3 •Práce s in vitro kulturami •(kultivační / expoziční nádoby a média) ____1 •Sterilní práce s modely in vitro 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Page 5 Počty obratlovců používaných pro hodnocení chemických látek v Evropě • •Commission of the European Communities, 2010 •12 million •animals •8.7 %: Toxicology •50 %: Regulatory testing •15 %: Fish, birds, amphibians •~ 80 000 animals 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •In vitro modely v ekotoxikologii 1 – rybí buňky • •Rybí buňky in vitro –Relativně snadná izolace buněk a udržování v kultuře (na rozdíl od savčích primárních linií se rybí buňky in vitro chovají jako imortalizované) –Příklady linií •RTL-W1 (Rainbow Trout Liver - W1) •RTgill (Rainbow Trout Gill) –Využití např. pro testování akutní toxicity (snaha o nahrazení testů in vivo) •podobná citlivost s in vivo modely à validace / standardizace • Full-size image (40 K) http://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S1568988312001412-gr6.jpg 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •In vitro modely – stanovení specifických účinků •Jaderné receptory – ER, AhR •Toxicita závislá na jaderných receptorech à velký význam v ekotoxicitě (viz jinde v přednáškách) •Jaderné receptory = transkripční faktory –Aktivace receptoru à produkce nových proteinů (zvýšené hladiny = marker expozice) –Možnosti měření •Měření aktivity (např. oxidace – CYP450 – viz dále) •Měření celých proteinů (např. WesternBlotting nebo ELISA) •Měření na úrovni mRNA – genová exprese - PCR nebo kvantitativní PCR •Sleování „reporterových genů“ (viz dále) • •Měření aktivity AhR à indukce detoxikačních enzymů – CYPs –Nejčastěji - měření oxidázové aktivity CYP (metoda EROD) –(využívají se i další analýzy – Wblotting, mRNA …) •Měření aktivity ER à indukce ER-závislých proteinů –Vitellogenin (prekurzor žloutkového proteinu u vejcorodých – ryby, ptáci ..): měření WBlottin, ELISA nebo exprese mRNA 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Reporterové testy •analýza účinků závislých na jaderných receptorech •Specificky vytvořené buněčné linie •Původně odvozené z lidských, potkaních, rybích či jiných tkání •Následná úprava („GMO“) –stabilní transfekce specifickými geny, které se v buňkách normálně nevyskytují –Luciferáza (ze světlušky), Beta-galaktosidáza –Vložení do DNA v místech, která jsou kontrolována příslušným receptorem (AhR, ER…) •Princip – viz obrázek –Měření světla z luciferázy ~ množství dioxinově aktivních látek • •Někdy označované „CALUX“ (Chemical Assissted Luciferase Expression) –jde o komerční název některých buněk, ale v mnoha laboratořích (včetně RECETOX) se užívají principiálně stejné „nekomerční“ buňky (např. H4IIE.luc / MVLD / MDAkb2) – • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Stanovení toxicit závislých na intracelulárních receptorech • • • • •Light •Light • •Luciferase • •Nuclear •Factors • •1 • • •P • • • • • • •+ • • •AhR • • • •HSP90 • •HSP90 • • •Src • • •HSP90 • • •HSP90 • •Adapted from Blankenship (1994) • •DRE •- •Luc • • •AhR • •ARNT • •Modulation of Gene •Expression • •ARNT • • • • • •Src • •“Activated” • •2 • • •P • • •P • •Cytosolic •Proteins • •Membrane •Proteins • •Increased Protein •Phosphorylation • •Ligand (TCDD) • •Light •Light • •Luciferase • •Nuclear •Factors • •1 • • •P • • • • • • •+ • • •AhR • • • •HSP90 • •HSP90 • • •Src • • •Src • • •HSP90 • • •HSP90 • •Adapted from Blankenship (1994) • •DRE •- •Luc • • •AhR • •ARNT • •Modulation of Gene •Expression • •ARNT • • • • • •Src • •“Activated” • •2 • • •P • • •P • •Cytosolic •Proteins • •Membrane •Proteins • •Increased Protein •Phosphorylation 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Stanovení aktivit/toxicit závislých na intracelulárních receptorech •AhR, ER – experimentální design • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •96 j. mikrodeska: •buněčné linie • •transgenní: •H4IIE.luc – diox. •MVLN, T47D.Luc • – estrog. • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •Lyza buněk, zamražení •(uchování enzymových aktivit) •Přídavek vzorků, standardů •Expozice (6 – 24 hod) • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •Lumino • • • •Stanovení LUCIFERÁZOVÉ •(reporterové) aktivity •- komerční detekční kity 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Příklad – využití reporterových testů •Hladiny estrogenních látek (stanovení pomocí MVLN testu) na •Přítoku a Odtoku ČOV Brno-Modřice • Velká účinnost čištění • Výsledné kncentrace (až 5 ng/L) jsou i tak biologicky účinné ! 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Budoucnost ekotoxikologie: •Big data a „omics“ 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif http://3.bp.blogspot.com/-dokK9_P3A4I/UZ38uN8AoUI/AAAAAAAAAJc/d1N8vDjsmAw/s1600/what+is+a+chemical+ reactions.jpg http://upyourtalent.com/wp-content/uploads/2012/04/white-rat.jpg https://encrypted-tbn3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcS52E4zw_1IWgj6a-zMCfagRjY0GxrrXUj7RPtc7h6W2mD _trk2 http://www.lfu.bayern.de/analytik_stoffe/biol_analytik_toxizitaetstests/pic/159498_gr.jpg •Organism •Chemical •Adverse Effects •Death •Altered Reproduction •Inhibition of Growth • •Tumorigenicity •Skin irritation •… •+ •Traditionally – Evaluation of adverse effects using the whole organism models Hazard assessment •REGULATORY FOCUS (APICAL ENDPOINTS) Výsledek obrázku pro cyp19 Výsledek obrázku pro caco2 •Newly added aspects •What are the mechanisms (MoA – mode of action)? •Can mechanisms serve for predictions? 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Extrémní rozvoj analytických technologií à „OMICS“ http://www.omics.jp/about/img/omics_01.jpg A další „ómy“ •Lipidóm •Mikrobiom … 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif http://systemsbiology.usm.edu/SystemsBiologyCenter/EL_ERDC/ERDC_img/Earthworm-Toxicogenomics.jpg Omics? … nejen obratlovci … 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Sběr omics podporují strategické dokumenty & projekty • •Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy •US National Academies of Sciences •http://www.nap.edu/catalog/11970.html https://encrypted-tbn3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcTAlr7MmMMxBP1Gffwd_0Gk4X2faiMuSVai0zxTF1WtiV1 DANMq https://encrypted-tbn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcQyQs5sVs1TzKletUOC20iLNg93Liu4X5Q_XF_I6rQWsL4 04Y83 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif http://3.bp.blogspot.com/-dokK9_P3A4I/UZ38uN8AoUI/AAAAAAAAAJc/d1N8vDjsmAw/s1600/what+is+a+chemical+ reactions.jpg http://upyourtalent.com/wp-content/uploads/2012/04/white-rat.jpg https://encrypted-tbn3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcS52E4zw_1IWgj6a-zMCfagRjY0GxrrXUj7RPtc7h6W2mD _trk2 http://www.lfu.bayern.de/analytik_stoffe/biol_analytik_toxizitaetstests/pic/159498_gr.jpg •Organism •Chemical •Adverse Effects (EC50) •Death •Inhibition of Growth •Altered Reproduction •Tumor •Skin irritation •… •+ •Traditionally – Evaluation of adverse effects using the whole organism models http://www.tdi.ox.ac.uk/_asset/image/tdi-barcoded-plates.jpeg/fit/300/300/FF0000 http://wallpoper.com/images/00/27/10/25/rainbows-vials_00271025.jpg •+ http://ehp.niehs.nih.gov/wp-content/uploads/118/4/ehp.0901392.g001.png •10^4 Chemicals •HTS •Chemical-biological interactions, •Mechanistic Toxicological Data Hazard assessment •New – Ex vivo / in vitro / In chemico / In silico Methods • •Key task/question: •How to link MECHANISTIC INFORMATION with APICAL ENDPOINTS ? 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Využití mechanistických dat à AOPs 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Ecotoxicity is a consequence of sequence of events •Escher, B. I., Behra, R., Eggen, R. I. L., Fent, K. (1997), "Molecular mechanisms in ecotoxicology: an interplay between environmental chemistry and biology", Chimia, 51, 915-921. 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Adverse Outcome Pathways – Dráhy škodlivého účinku •The EXISTING KNOWLEDGE is used to link the two anchor points: Molecular Initiating Event (MIE) and Adverse Outcome (AO) via a series of intermediate steps: Key Events Chemical Macro-Molecular Interaction Cellular Response Organ Response Organism Response Population Response Molecular Initiating Event Key Event 1 Key Event 2 Adverse Outcome Tissue Effect Key Event 3 Chemical Property Receptor/Ligand Interactions DNA Binding Protein Oxidation Gene Activation Protein Production Altered Signaling Altered Physiology Disrupted Homeostasis Altered Development / Function Lethality Impaired Development Impaired Reproduction Altered Sex Ratio Extinction •Adverse Outcome Pathway •Toxicity Pathway •Mode of Action •In silico, In chemico, In Vitro, Ex vivo •In vivo •Ankley, G. T., R. S. Bennett, et al. (2010). "Adverse outcome pathways: a conceptual framework to support ecotoxicology research and risk assessment." Environmental Toxicology and Chemistry 29(3): 730-741. 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Ethinylestradiol (EE2) •MIE •Binding to •ESTROGEN RECEPTOR https://www-pls.llnl.gov/data/assets/images/science_and_technology/life_sciences/cancer_diet/kulp1. jpg •KEs - Activation Target genes - Proliferation/Apoptosis (sexual organs) - Synthesis of egg yolk (fish, amphibia) •KEs - Effects - Females: reproduction regulation - Males: feminization • (+ e.g. cancer promotion, development, • immunomodulation) AOP Example: Fish population decline due to estrogen receptor modulation 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Kidd, K.A. et al. 2007. Collapse of a fish population following exposure to a synthetic estrogen. PNAS 104(21):8897-8901 •Control lake lake with EE2 •EE2 - 5 ng/L (!) •7 years •Adverse outcome – fish population decline 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •AOP a regulatorní prediktivní toxikologie • •OECD AOP Knowledge Base 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Strategické směřování – podpora OECD •http://www.oecd.org/chemicalsafety/testing/projects-adverse-outcome-pathways.htm 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •http://aopkb.org/ •Key documents • •OECD Guidance document and a template for developing and assessing adverse outcome pathways (Series No. 184, Series on Testing and Assessment) • •Handbook for AOP developers 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif AOP Wiki •https://aopkb.org/aopwiki/index.php/Main_Page •Wiki-based platform for development of AOPs •Only members of an OECD AOP development project can create / edit AOPs • • https://aopkb.org/aopwiki/images/thumb/c/c9/FiveLogos.gif/780px-FiveLogos.gif 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Key Events • Are seminal intermediate events that are toxicologically relevant to the apical outcome. • The basis for hypothesis development and testing =>must be experimentally quantifiable • Are often assessed by rapid screening methods • • Identification of the chemical-biological interaction - Anchor 1 • Understanding of the apical outcome elicited by the MIE - Anchor 2 • Identification of intermediate key events depends on the level of knowledge about this outcome AOP Development •E.g. semi-automated literature searches, semantic & network methods •http://www.oecd.org/env/ehs/testing/AOP%20process_10%20June%202013.pdf • •Completeness (reliability & robustness) •Qualitative Understanding •Weight-of-Evidence supporting AOP (Bradford-Hill criteria) •Quantitative Understanding AOP Assessment 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif AOP components •doi: 10.1093/toxsci/kfu199 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif AOPs and their links … •doi: 10.1093/toxsci/kfu199 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif … further linking of AOPs •dx.doi.org/10.1021/es504976d Environ. Sci. Technol. 2015, 49, 3−9 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Jaké AOPs jsou •V AOP Wiki •(data z května 2016) OECD Endorsed (WNT and TFHA) 1 Covalent Protein binding leading to Skin Sensitisation EAGMST Approved 6 1x ecotoxicology: Aromatase inhibition leading to reproductive dysfunction (in fish) EAGMST Under Review 12 EAGMST Under Development 84 SAAOP AOP Under Development 15 •OECD Extended Advisory Group on Molecular Screening and Toxicogenomics (EAG MST) •The Working Group of the National Coordinators of the Test Guidelines Programme (WNT) •https://aopwiki.org/aops https://aopkb.org/aopwiki/images/thumb/c/c9/FiveLogos.gif/780px-FiveLogos.gif 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •https://aopwiki.org/aops 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •https://aopwiki.org/aops 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif AOP Example: MIE aromatase inhibition •Environmental Toxicology and Chemistry, Vol. 30, No. 1, pp. 64–76, 2011 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Aromatase inhibition leading to reproductive dysfunction (in fish) •https://aopwiki.org/wiki/index.php/Aop:25 • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif AOP Example: AcChE inhibition à lethality 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif AOP Example from RECETOX: Modulation of RAR/RXR à developmental toxicity in fish •Jonáš et al. 2014 Aquatic Toxicology •http://dx.doi.org/10.1016/j.aquatox.2014.06.022 Concentration-response curves of the retinoid-like activity (expressed as % of ... •Activation of RAR/RXR •in P19/A15 cells by atRA and cyanobacterial metabolites Comparison of phenotypes of control and zebrafish embryos exposed to ... •ZF exposed to ATRA and cyanobacterial (120 hpf) - Control (A), exudates of C. raciborskii 3.3× (B) and 10× (C), M. aeruginosa 10× (D) and D. quadricaudatus 17× (E). ATRA 4 μg/L (13.3 nM) (F), 12 μg/L (40 nM) ((G) and (H)), 36 μg/L (I) and 108 μg/L (J). •atRA •other RAs in cyanos 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •AOPs – další poznámky 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Regulatorní akceptace … pozitivní 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Workshop – AOPs: From Research to Regulation •September 3-5, 2014 (NIH Campus, Bethesda, Maryland, USA) • •150 participants (90% USA, also Canada, UK, Germany, Italy, Belgium, Denmark…) • •OECD, NIH (NIEHS, NICEATM, NLM, NCATS), US EPA, US FDA, EU-JRC, John Hopkins CAAT, US Army … •Dow Chemical, Bayer, Syngenta, American Chemistry Council, Lorillard Tobacco, British American Tobacco, General Electric Co., ExxonMobil, Agilent, … •Academia – universities, research institutes Workshop graphic with images representing in vitro tests and protecting human health 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •http://www.effectopedia.org/ -> link to program download •Visually Expresses AOPs in their biological context: –Life-stage, Taxonomy, Gender, Time-to-effect.. •Quantitative Relationships •ADME (Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion) •Open-knowledge, crowd-sourcing •Formal approval not required to enter / modify •Credit to authors / reviewers •Even fragments of information are welcome (any contribution) •Export<->Import from/to AOP Wiki & others • • Effectopedia 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Related Projects & Studies & Databases •TOXNET - http://toxnet.nlm.nih.gov/ –searching databases on toxicology, hazardous chemicals, environmental health, and toxic releases •Tox21 - http://www.epa.gov/ncct/Tox21/ –10,000 chemicals –14 concentrations, 4 logs, 3 replicates –1536 well plates, 2-8 uL volumes –50+ assays •ToxCast - http://www.epa.gov/ncct/toxcast/ –App. 2000 chemicals –700+ assay, 300 signaling pathways –DATA AVAILABLE iCSS Dashboard •http://actor.epa.gov/dashboard •http://ww.epa.gov/ncct/toxcast/data.html • • • • • http://epa.gov/research/annualreport/2012/images/toxcast1.jpg 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Related Projects & Studies & Databases •ToxRefDB (Toxicity Reference Database) –in vivo toxicological data –http://actor.epa.gov/toxrefdb/faces/Home.jsp •ExpoCast –information on human exposures –http://www.epa.gov/ncct/expocast/ •Human Toxome Project –information on human exposures –http://www.ewg.org/sites/humantoxome/ •Agriculture Health Study –Occupational Exposure to Pesticides – a cohort study –http://aghealth.nih.gov/ – • • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Modely SAR a QSAR 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif SAR, QSAR •SAR = Structure Activity Relationships –hledání vztahů mezi STRUKTUROU a AKTIVITOU látek (struktura -> eko-toxicita) –předpovědi efektů bez nutnosti experimentálních testování • •Řada přístupů –kvalitativní •přítomnost určité charakteristiky implikuje aktivitu (vlastnost) –dlouhý alifatický řetězec -> afinita k membránám – –kvantitativní (=QSAR – Quantitative SAR) •matematický popis vztahů –jednorozměrné vztahy – korelace, regresní vztahy ... –vícerozměrné modelování (PCA, PLS), neuronové sítě ... 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif SAR, QSAR v ekotoxikologii •Techniky QSAR původně vyvinuty pro design farmak • •Aplikace SAR, QSAR v ekotoxikologii –předpovědi environmentálně významných parametrů látek •logKow •biokoncentrace, bioakumulace •předpovědi biodegradability a metabolismu –odhady rychlosti degradace t1/2, vznikající metabolity – –předpovědi toxicity 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Princip vývoje modelu QSAR •1) Vstupní data – ZNÁMÉ údaje –Skupina podobných látek –Známá (změřená) vlastnost – např. aktivita / toxicita –Známá fyz-chem data (stovky různých parametrů) •2) Hledání modelu ve známých datech –Např. Aktivita = a * parametr1 + b * parametr2 + c –(viz příklady dále) •3) Využití modelu pro předpověď „Aktivity“ neznámé látky –Fyz-chem parametry à dosazení do modelu à výpočet „toxicity“ – • 1 •Příklad – vstupní data pro QSAR •Aktivita Chemická data • • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif SAR, QSAR - příklady •Předpovědi environmentálně významných parametrů chemických látek (viz také úvod přednášek) –Fyzikálně chemické parametry • Log P (log Kow) • Aqueous solubility • Melting point • Boiling point • Vapour pressure • Henry's law constant • ClogP (www.biobyte.com) • KOWWIN (esc.syrres.com) (www.epa.gov/oppt/exposure/docs/episuitedl.htm) • SLIPPER (www.ibmh.msk.su/qsar/molpro) • KlogP (www.multicase.com) • ABSOLV (www.sirius-analytical.com) • ProLogP (www.compudrug.com) • SPARC (ibmlc2.chem.uga.edu/sparc) • IA (www.interactiveanalysis.com) • ACD (www.acdlabs.com) • QikProp (www.schrodinger.com) • AP-Algorithms (www.ap-algorithms.com) • ProPred (www.capec.kt.dtu.dk) • Cerius2 (www.accelrys.com) • QMPRPlus (www.simulations-plus.com) • •Příklady software, různé modely a principy výpočtu 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif SAR, QSAR - příklady –Předpověď biokoncentrace •Modely doporučované TGD (technical guidlines) při registraci nových chemických látek v EU: • •logKow <6 logBCF = 0.85logKow - 0.7 •logKow values 6 – 10 logBCF = -0.2 logKow2 + 2.74logKow - 4.72 –Předpověď biodegradability také někdy: QSBR - jednoduché korelace degradabilita-chemický parametr - sčítání vlivu charakteristických subdomén na degradabilitu ("+" degradace, "-" stabilita) -> suma pro celou molekulu = degradability score - vícerozměrné modelování 1 • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif SAR, QSAR - příklady –Předpovědi toxicity (také označováno – QSTR – Quantitative STRUCTURE-TOXICITY relationships) – 1 •Př 1 – toxicita narkotických látek pro ryby (využívána např. i pro účely REACH) • log (1/LC50) = 0.907 . log Kow - 4.94 •Př 2 – toxicita fenolů pro korýše – vícenásobná regrese •(nepolární narkoza – logP, polární toxicita – pKa) 1 •Př 3 – vícerozměrné modelování: •výsledek analýzy hlavních komponent (PCA) •- výstup : odlišení toxických a netoxických látek 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Moderní výpočetní toxikologie 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Adverse outcome pathways http://u.jimdo.com/www32/o/s09b2938cc0a6d68f/img/idb462b3a2365de42/1314711482/std/toxicokinetic-tox icodynamic-models-and-adverse-outcome-pathways.jpg •Viz také dříve v přednáškách: •Dokážeme z koncentrace látky v prostředí předpovědět (matematicky) účinky ? • •Základem je dokonalé porozumění •1) toxikokinetice (modely PBPK – viz dále) a 2) následně mechanismům (dynamika) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif PBPK modely •PBPK (PBTK) •Physiologically based pharmacokinetic (toxicokinetic) models http://upload.wikimedia.org/wikipedia/en/thumb/2/22/WholeBody_wiki.svg/220px-WholeBody_wiki.svg.png https://encrypted-tbn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcS1Xr-zyM_wH8apSCpkALlZltgIBwQ4IcylkdluXxtRsQN mocsqJw •Vnitřní „rozdělení“ organismu a parametrizace běžících procesů • •à Složitý model : Predikce koncentrací v jednotlivých tkáních 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Kvantitativní mechanistické modelování 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Li (2011) BMC Systems Biology •Koncepční model à ZOOM •EE2 – toxikant •ER, AR atd. – receptory • •VTG – vitellogenin (marker toxicity) • •Každá šipka: zvláštní diferenciální rovnice 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Li (2011) BMC Systems Biology •Výsledek: •Srovnání •MODEL vs. MĚŘENÍ 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Kvantitativní mechanistické modelování •PLoS Comput Biol. 2016 Apr 20;12(4):e1004874. 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Kvantitativní mechanistické modelování http://journals.plos.org/ploscompbiol/article/figure/image?size=large&id=10.1371/journal.pcbi.10048 74.g001 •Fig 1. The HPOL signaling network in rainbow trout as formulated in our model. • • Arrows and symbols on graph follow CellDesigner vs. 4.4 notation (www.celldesigner.org). GnRH is secreted from the hypothalamus into the pituitary stimulating the production of mFSH and mLH, which then leads to formation of FSH and LH, respectively. FSH, which is being continuously secreted from the pituitary, travels to the ovaries to stimulate production of E2. E2 then travels to the liver to bind with E2 receptors (R; translated from mR) to form ER. ER then stimulates the production of mVTG, which produces VTGL. Secreted VTG then travels from the liver to the ovaries via the plasma (VTGP) where it is absorbed by follicles in stages 3 through 6 (the proportion of follicles in these stages are denoted by Sj, j = 3, 4, 5, and 6) during vitellogenesis, the rate of which is affected by FSHP, to promote oocyte growth (OAvg). Oocyte growth then progresses the oocytes through the stages using a Weibull distribution created from OAvg together with OVar. In the later stages LHP stimulates the oocytes to produce DHP. Finally, oocytes undergo final maturation (SFOM) and combined with DHP, determine when the fish ovulates • •PLoS Comput Biol. 2016 Apr 20;12(4):e1004874. 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Kvantitativní mechanistické modelování http://journals.plos.org/ploscompbiol/article/figure/image?size=large&id=10.1371/journal.pcbi.10048 74.g003 •Fig 3. HPOL model predictions for (A) pituitary levels of FSHβ subunit mRNA, (B) pituitary levels of LHβ subunit mRNA, (C) Hepatic levels of E2 receptor mRNA and (D) Hepatic levels of VTG mRNA •Observed data (dark grey circles; mean ±TG mRn = 3) •PLoS Comput Biol. 2016 Apr 20;12(4):e1004874. 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Nano-eko-toxikologie 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif NANOČÁSTICE •„NANO“ – relativně nová oblast, řada praktických využití •ALE: unikátní vlastnosti –Vlastnosti nanočástic (včetně toxicity) nelze odvodit z vlastností částic z téhož materiálu o větších rozměrech a ani z vlastností chemikálie, ze které je materiál tvořen • •Definice –Nanočástice (nanoparticles): alespoň jeden rozměr <100 nm –Nanočástice přírodního původu - „ultrafine particles“ přítomné v přírodních aerosolech nebo jako vedlejší produkt lidské činnosti (prach, dým, kouř apod.) –Vyráběné nanomateriály (manufactured, engineered NM) –Nanoaerosoly: aerosoly jednotlivých volných nanočástic nebo nanostrukturních částic (= aglomerátů nanočástic nebo nanovláken) – přírodního původu nebo vyráběných 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Základní charakteristiky vyráběných NM •tvar a struktura částic – –Kulovité nebo nepravidelné částice, trubičky,vlákna, destičky – –Homogenní částice (chemická individua) –Kompozitní nanomateriály(jádro a obal) –Nanočástice 3. a 4. generace (budoucnost: různé komponenty se specializovanými funkcemi („nanodevices“) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Základní charakteristiky vyráběných NM 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklady - nanočástice https://encrypted-tbn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcR52Y7PdqKN5Z97ZhIFGfyoY41Qv9l41niNcuE3T-F9sWy IjSKMpA http://nano.anl.gov/images/bifunctional_nanoparticle.jpg https://encrypted-tbn1.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcR9LiHxdv4f1xLBnJm7j0ey82mAIkrqpx6dVbyiFdDTwcR n5G35 https://encrypted-tbn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcTRyUwtGdjXOTAe8emSb0Ngkn0R-l8krCeEyFVPeK8-f5Y rg322ug https://encrypted-tbn3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcS1YFciG79F0BpdYj74qJmGI-zgvfT7pAazIR4bDRuhmll hzbqG https://encrypted-tbn2.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcQzw3I5Xb7Vq_3twyU5AzgXl6TZPl1WvVm-RGpTGUQSGNu BdlDu 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Nanočástice v prostředí 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif (Eko)toxicita nanočástic – specifické vlastnosti http://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S0165993611003748-gr1.jpg •(Neznámé) parametry částic, které mohou •mít vliv na toxicitu • •Složení (chemické) •Povrch (velikost, tvar) •Náboj •Stabilita •Agregace částic •Interakce s chemikáliemi •Interakce s ionty • •Vliv na osud látek •Přímá toxicita 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif (Eko)toxicita nanočástic – příklad RECETOX •Toxicita – srovnání - 4 „stejné“ částice (jeden výrobce – 4 různé šarže) •(zerovalent iron – ZVI – Fe0) •Opakovaně pozorována toxicita u částic H16 –příčina neznámá (žádné změny pH, rozpouštění železa či dalších příměsí …) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Nanočástice à mechanické vlivy = toxicita 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Novinky … stresová biologie 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Koljušky (ryby), které byly •v době kladení vajíček ve stresu (predátor) • à Snížená schopnost učení u potomků • •! Transgenerační přenos 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Barevnější samci sýkor à Atraktivnější pro samice … à Lepší kvalita spermatu (karotenoidy brání proti oxidativnímu stresu) https://encrypted-tbn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcQbhIkN6LbSYHEyRM5L5f20X9xjp7wEr-XtnuPAK_otW_c gy7vt 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Ekotoxicita pesticidů – nové poznatky •Pesticidy – registrace před použitím •Povinné testy účinků na včely à Odvození bezpečného dávkování pro použití • •Nově zjistěné problémy à Jak se projeví „bezpečné koncentrace“ více pesticidů, pokud budou působit současně ? à Jak se projeví u jiných druhů opylovačů než u včel ? • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Čmeláci a pesticidy –Velice významní opylovači –Specifická biologie oproti včelám • kolonie s velmi malým počtem jedinců –Současné aplikace různých pesticidů na sousedních polích •V praxi není koordinace mezi farmáři: koexpozice 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Vliv pesticidů na čmeláky – polní studie: aplikovány povolené dávky - 2 individuální látky „I“ a „LC“ - současná expozice „M“ (mixed) •Celkové ztráty •dělnic v •průběhu experimentu 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Vliv pesticidů na čmeláky – polní studie: aplikovány povolené dávky - 2 individuální látky „I“ a „LC“ - současná expozice „M“ (mixed)