Kultivace buněk Transfekce Izolace DNA Izolace RNA Western blotting * * * EDTA - kyselina ethylendiamintetraoctová * polyaminokarboxylová kyselina, [CH2N(CH2CO2H)2]2 * chelatační činidlo - vytváří komplexní sloučeniny s ionty kovů * využití: * buněčná biologie –rozrušení buněčných spojů vyžadující přítomnost iontů Ca, posílení působení trypsinu * molekulární biologie - součást řady pufrů, například TE pufru pro uchování DNA, ve kterých zajišťuje sekvestraci dvouvazebných iontů, které jsou nezbytné pro funkci DNáz, čímž brání degradaci DNA * medicína – při chelatační terapii, ve které slouží k odstranění těžkých kovů z těla * průmysl – odstraňování tvrdosti vody, bělení, fotografie… * * trypsin * trávicí enzym, který se vyskytuje v dvanáctníku * proteáza, hydroláza - štěpí peptidické vazby bílkovin * u adherentních buněk štěpí proteiny, které jsou důležité pro jejich uchycení k podkladu * trypsinizace se proto úspěšně a rutinně využívá při pasážování těchto buněk * pozor na dodržení času, aby nedošlo k nežádoucímu natrávení i dalších buněčných struktur! * inaktivace působení trypsinu – některé komponenty séra * Pasážování adherentních buněk – důležité reagencie EDTA Hyršlová Vaculová, 2018 * „subculturing“ * v log fázi, než dosáhnou konfluence, před vstupem do stacionární fáze, kdy pak klesá jejich aktivita a kvalita buněčné kultury Pasážování adherentních buněk (Alshammari, 2014) Hyršlová Vaculová, 2018 * linie odvozená z lidských embryonálních ledvinných buněk (1973), transformovaná (adenovirus 5 DNA) * široce používaná – rychlý růst, výborně transfekovatelná – využití pro produkci rekombinantních proteinů * existuje několik variant této buněčné linie, může růst jako adherentní i suspenzní * Příklad buněčné linie - HEK293 (Gibco, 2015; wikipedia.org) adherentní suspenzní Hyršlová Vaculová, 2018 * Plazmidy (i jinou nízkomolekulární DNA) je možné množit pomocí kompetentních bakterií a následně izolovat pomocí kolonkových kitů (mini-, midi- a maxiprep) * * Heat shock kompetentních bakterií E. Coli plazmidem zájmu * Růst bakterií na selekční půdě (antibiotikum) * Izolace rezistentní kolonie a její namnožení v selekčním LB médiu * Izolace nízkomolekulární DNA pomocí kolonkového kitu: * Lyzace bakteriálního peletu a RNA * Precipitace proteinů a genomové DNA * Přenos supernatantu na kolonu a vazba plazmidu na pryskyřičných kuliček (promytí) * Eluce plazmidové DNA a její přečištění – * * * STRUČNÝ POSTUP IZOLACE plazmidové DNA • video návod on line https://is.muni.cz/auth/el/1433/test/s_zakazky/ode15/045-medalova/DNA.mp4.video ke stažení https://is.muni.cz/auth/el/1433/test/s_zakazky/ode15/045-medalova/DNA.mp4 Kontrola kvality DNA/RNA - nanodrop IZOLACE DNA POMOCÍ KOLONKOVÉHO KITU A260 – 1.0 (10x ředit vzorky) RNA: A260/A280 ~ 2.0 DNA: A260/A280 ~ 1,8 A260… nukleové kyseliny A280… příměsi \\ha-bay.ics.muni.cz\homes prihlasovaci jmeno je> UCN\uco (VCETNE UCN\) Vektor pMaxGFP (AMAXA) •Gen pro GFP izolovaný z planktonového korýše Pontellina Plumata, konstitutivně přepisovaný plazmid slouží pro kontrolu účinnosti transfekce Promotor z cytomegaloviru gen zájmu polyA konec z SV40 viru Gen pro rezistenci Počátek replikace Plazmid 368 - M50 Super 8x TOPFlash https://www.addgene.org/12456/ 181170_map Beta-cateninový reportér. 8xTCF/LEF vazebných míst před promotorem pro FF luciferázu Plazmid 345 - pRLtkLuc Výsledek obrázku pro pRLtkLuc https://worldwide.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-l ines/prl-renilla-luciferase-control-reporter-vectors/?catNum=E2231 Konstitutitvní exprese Renilla luciferázy poskytuje vnitřní kontrolu, na kterou se může přepočítat exprese FF luciferázy, protože oba vektory se transfekují se stejnou účinností. PEI (polyetylenimin) DNA:PEI = 1:4 * Kationické polymery jsou hydrofilické, a proto jsou rozpustné ve vodě * Jsou schopné velmi efektivně kondenzovat DNA (záporný náboj) * Komplexy DNA/PEI musí být malé (< 100 nm) * Internalizace endocytózou * Akumulace v endosomecha a lyzosomech kolem jádra * Jen malé množství komplexů z těchto organel unikne a dostane se do jádra Cationic polymers differ from cationic lipids in that they do not contain a hydrophobic moiety and are completely soluble in water. Given their polymeric nature, cationic polymers can be synthesized in different lengths, with different geometry (linear versus branched). The most striking difference between cationic lipids and cationic polymers is the ability of the cationic polymers to more efficiently condense DNA. There are three general types of cationic polymers used in transfections: Linear (histone, spermine, and polylysine) Branched Spherical Cationic polymers include polyethyleneimine (PEI) and dendrimers www.nano-lifescience.com http://www.nano-lifescience.com/research/gene-delivery.html SDS-PAGE - Western blotting – „work flow“ https://www.bosterbio.com Membrane Stain (Optional) Hyršlová Vaculová, 2018 * izolace buněčných proteinů – lyze buněk, specifické pufry, centrifugace * lyzáty celobuněčné, nebo různé frakce – cytoplazmatická, mitochondriální, jaderná, membránová * pro uchování proteinů nutno k lyzátům přidat inhibitory proteáz a fosfatáz * stanovení koncentrace proteinů v jednotlivých vzorcích, naředit vzorky na stejnou koncentraci * ke vzorku proteinů se přidává: * Tris pufr – zajištění optimálního pH * SDS, beta-mercaptoetanol, DTT – denaturace proteinů * glycerol – zvýšení hustoty vzorku, lépe se udrží v jamce v gelu * bromfenolová modř – vizualizace pohybu proteinů v gelu * * * * • * * Příprava vzorků www.wikipedia.org Hyršlová Vaculová, 2018 * Laemmliho (Tris-glycinový) diskontinuální systém pufrů - dva pufry o různém pH pro přípravu zaostřovacího a rozdělovacího gelu a jeden pufr tvořící elektrolyt * denaturované proteiny jsou laboratorní injekční stříkačkou nebo pipetou vnesené do jamek polyakrylamidového gelu, které jsou vyplněné vhodným pufrem * následně je do gelu vpuštěn elektrický proud, díky kterému proteiny záporně nabité pomocí SDS migrují skrz gel směrem k anodě * na základě jejich velikosti se každý protein pohybuje gelem rozdílnou rychlostí * menší proteiny pronikají póry v gelu snadněji než větší, které se střetávají s větším odporem * proteiny se rozdělí podle své molekulové hmotnosti * menší proteiny postoupí dále než větší, které jsou blíže počátku, kam byly proteiny aplikovány – * * * • * * Vlastní SDS PAGE (Laemmli) https://ww2.chemistry.gatech.edu/~lw26/course_Information/4581/techniques/gel_elect/gel.jpg Hyršlová Vaculová, 2018 * proteiny jako blokovací látky * inhibují nespecifické interakce mezi proteiny a membránou a mezi proteiny navzájem * permanentní blokační agens, fyzikální interakce s membránou * mají mít větší afinitu k membráně než následně použité protilátky * účinně blokují volná místa na membráně a současně nenarušují vazebné interakce mezi proteiny, které byly již na membránu přeblotovány * každý pár Ab:Ag je unikátní a vyžaduje vhodnou volbu blokačního agens, nutno experimentálně určit jeho typ a množství * nedostatek blokovacího agens - vysoké pozadí při následné imunodetekci, protilátka se váže i na membránu, nelze rozlišit specifická versus nespecifická vazba protilátky * nadbytek blokovacího agens – zastínění specifického signálu protilátky při následné imunodetekci, specifický signál zaniká » * nejčastěji používané: * odtučnělé mléko (5%) + Tween 20 (0,1%), velmi běžné, levné; pozor – nepoužít v případě, že bude následovat imunodetekce s využitím biotinylovaných Ab (mléko obsahuje také biotin, interference!) * BSA (bovine serum albumine) – 0,3-5%, možno i s Tweenem 20, velmi časté * rybí želatina - obvykle 2%, pro některé specifické detekce, méně častá, vhodnější než savčí (méně nespecifických reakcí, menší pozadí), pozor – obsahuje biotin, relativně drahá * sérum – obvykle 10%, použití s azidem sodným, drahé, obsah některých imunoglobulinů – potenciální cross-reaktivita * * – * * • * * Imunodetekce – blokování membrány Amersham Biosciences Hyršlová Vaculová, 2018 * detekce a identifikace proteinů přenesených na membránu s využitím specifických protilátek * několik základních kroků: * odmytí blokačního agens * přidání primární protilátky * odmytí nadbytečné primární protilátky * přidání sekundární protilátky * odmytí nadbytečné sekundární protilátky * detekce signálu – intenzita úměrná množství detekovaného proteinu (různé možnosti) – * – * * • * * Vlastní imunodetekce – hlavní fáze http://www.bio-rad.com http://www.merckmillipore.com/ https://www.cusabio.comg Hyršlová Vaculová, 2018 * nejčastější způsob imunodetekce po western blottingu * široká škála detekčních kitů založených na chemiluminiscenční reakci * princip reakce: * cílový protein – neznačená primární Ab - sekundární Ab je konjugovaná s HRP (peroxidáza) – sem se přidá luminol * HRP katalyzuje oxidaci luminolu - vícekroková reakce, při které je emitováno chemiluminiscenční světlo (428 nm) * jeho množství je úměrné množství HRP (tj. množství sAb, pAb a cílového proteinu) * intenzitu reakce je možné zesílit (až 1000x) přidáním modifikovaných fenolů (p-iodofenol), které stimulují transfer elektronů mezi luminolem a HRP * účinnější detekce signálu, zvýšení citlivosti detekce * enhanced chemiluminescence (ECL) – řada komerčně dostupných kitů • Chemiluminescence http://www.abnewswire.com/uploads/b294aa9327f379773b0b49445841e6e8.png (Geschwender et al., 2013) luminol Hyršlová Vaculová, 2018 qRT-PCR * dynamická regulace hladiny mRNA – detekce změn je zásadní pro studium změn exprese specifických genů; • * Kvantifikace exprese proteinů podle množství molekul mRNA využívající reverzní transkripci a PCR • * Reverzní transkripce převede mRNA na cDNA –Primery oligoT, náhodné hexa-nona oligonukleotidy, specifické primery pro konkrétní RNA * * Kvantifikace je umožněna použitím fluorescenčně značených molekul – nárůst fluorescence po každém cyklu * * Po každém cyklu je provedena detekce přírůstku = odpadá nutnost kvantifikace pomocí elektroforézy * Výsledek obrázku pro q real time PCR Hodnocení kvantitativní real time PCR * Určení Ct (Cp) – manuálně nebo pomocí maxima 2. derivace - bod, kde dochází k strmému stoupání amplifikační křivky vzorku * Čím vyšší Ct, tím méně molekul mRNA bylo ve vzorku – Model PCR plot Výsledek obrázku pro q real time PCR https://www.ncbi.nlm.nih.gov/probe/docs/techqpcr/ Výsledek obrázku pro q real time PCR Křivka tání (melting curve) * Na konci reakce proběhne postupné zahřívání celé reakce, po dosažení bodu tání Tm dojde k degradaci DNA (pokles fluorescence) * Specifitu reakce ilustruje křivka tání (melting curve) – • musí mít jen jeden vrchol = jeden produkt * http://labguide.cz/metody/real-time-pcr/ Více info: https://theses.cz/id/go0fw3/Bakalarska_praceEliska_Ruzickova.pdf Počítání * Koncentrace bez přepočtu jednotek –SS 40 mM a a potřebujeme 100 ul WS: 20 uM –Trojčlenka: 20 uM…..100 ul – 40 mM…. x ul – x/100=0,02/40… 0,0005.100=x –Ředěním I: 40 mM…. 100 ul – 20 mM…. 50 ul – 20 uM……50 nl = 0,05 ul –Ředěním II: 40 mM/0,02 mM = 2000 x ředěné – 100/2000 –Vzorečkem: c1.V1=c2.V2 (pozor! Nutné stejné jednotky) – 40x=0,02.100 ul – * Koncentrace s přepočtem jednotek • SS: 40 mg/ml a potřebujeme 100 ul WS: 20 uM • Nutné znát Mr látky (např 80) • 1 M … 80 mg/ml • 0,5 M … 40 mg/ml • * Ředění buněk • Spočítáme si, že máme 0,35x10*6/ml = 0,7x10*6 b v 2 ml • A) chceme mít 1x10*6/1ml • zjistíme, kolik máme buněk celkem (0,7x10*6), Centrifugace a pak to doředíme 0,7 ml pufru • B) chceme odebrat 2x10*5 buněk = 0,2x10*6 buněk • 0,2/0,35=0,57 ml vezmeme z původní suspenze