1 5. Metabolizmus Metabolizmus • Každá živá buňka je otevřený systém, který je charakteristický výměnou s prostředím (hmoty, energie, informace) • Živiny z prostředí do buňky → transformace – tvorba energie, syntéza biomolekul → exkrece metabolitů Tok hmoty, energie a informace buňkou → metabolizmus 2 Metabolizmus • Metabolická aktivita mikroorganizmů je mimořádně různorodá • Metabolizmus buňky (tok hmoty a energie buňkou) tvoří celek, který má dvě protichůdné kategorie katabolizmus anabolizmus Metabolizmus Spřažení katabolizmu (exergonické reakce) a anabolizmu (endergonické reakce) 3 Metabolizmus • Katabolizmus – představuje degradativní procesy vedoucí ke tvorbě energie (-ΔG) • Anabolizmus – vede k syntéze jednotlivých složek buňky a je spojen se spotřebou energie (+ΔG) • Katabolizmus a anabolizmus jsou dva protichůdné procesy, které vedle sebe existují v prostoru a čase a vzájemně se podmiňují Metabolizmus • Proces metabolizmu je souhrn biochemických reakcí, které a/ probíhají posloupně a jsou “seřazeny“ do řad – metabolické dráhy b/ uzavřeny do kruhu – cykly • Výsledný metabolit může vznikat více než jednou metabolickou drahou – alternativní metabolické dráhy 4 Makroergické vazby • Energetický metabolizmus probíhá při spřažení exergonických a endergonických reakcí • Pro uskutečnění syntézy je nutné, aby součet změn volné energie obou spřažených reakcí byl negativní nebo alespoň s nulovou hodnotou • Syntetické reakce probíhají většinou za účasti energeticky bohaté sloučeniny (ATP, látka schopná vytvářet makroergickou vazbu) • Díky vysoké hladině ΔG makroergické vazby, se aktivuje substrát a umožní se tím vlastní reakce Makroergické vazby • Změny ΔGo při hydrolýze některých sloučenin - ΔGo (KJ.mol-1) • ATP + H2O → ADP + Pan 30,9 • ATP + H2O →AMP + pyrofosfát 31,8 • Glu-6P + H2O → Glu + Pan 12,5 • Acetylfosfát + H2O → HAc + Pan 43,9 • P-enolpyruvát + H2O →pyruvát + Pan 54,4 • Acyl-KoA + H2O →HAc + KoASH 32,2 5 ATP • ATP – univerzální přenašeč energie – univerzální donor fosfátu v anabolických reakcích • Soustava ADP ↔ ATP je univerzálním “spřahovačem“ katabolizmu a anabolizmu • Kterákoli exergonická reakce může “pohánět“ jakoukoli endergonickou reakci • Proto je metabolizmus jako celek vysoce spolehlivý ATP Centrální úloha ATP při syntéze biologických makromolekul 6 ATP • Tvorba ATP ☺ na úrovni substrátu ☺ na úrovni membrány * u prokaryot na cytoplazmatické membráně * u eukaryot na vnitřní membráně mitochondrií Tvorba ATP na úrovni membrány •Respirační řetězec • ATP se generuje vytvářením potenciálu na membráně přechodem přes cytochromový řetězec 7 Role NAD(P) v metabolizmu • NAD(P) – univerzální přenašeč vodíku a elektronů • Jeho redukovaná i oxidovaná forma volně cirkuluje v základní cytoplazmě • Molekula NAD(P)+ je redoxním systémem NAD(P)+ + 2 H+ + 2e- ↔ NAD(P)H ++ H+ • NADH2 je určeno především k redukci kyslíku a produkci ATP na úrovni membrány (exergonické reakce) • NADPH2 je určeno především k redukcím v biosyntetických pochodech (endergonické reakce) Role NAD(P) v metabolizmu biosyntetické reakce katabolizmus respirační řetězec ATPADP + Pan NADP+ NADPH+H+ NAD+ NADH+H+ ATP ADP+Pan O2H2O oxidované produktyredukované substráty redukované produkty biosyntézy oxidované metabolity 8 Metabolizmus Rozdělení organizmů ve vztahu ke zdrojům energie • Chemotrofní • Fototrofní Vztah chemotrofů ke kyslíku • Obligátně (striktně) aerobní zisk energie → aerobní respirace • Obligátně (striktně) anaerobní zisk energie → anaerobní respirace → fermentace • Fakultativně anaerobní zisk energie → aerobní respirace → anaerobní respirace → fermentace • Mikroaerofilní • Aerotolerantní 9 Fermentace – úloha pyruvátu pyruvát Streptococcus Lactobacillus kvasinky Propionibacterium Clostridium E.coli Salmonella laktát etanol CO2 propionová k. HAc, CO2, H2 máselná k. butanol aceton izopropyl alkohol CO2 etanol mléčná k. mravenčí k. acetoin CO2 , H2 glykolýza Glykolýza (EMP dráha) glukóza Pglukóza-6- 3-fosfoglycerát P P PPfruktóza-6- fruktóza -1,6- glyceraldehyd-3- 1,3-difosfoglycerát 2-fosfoglycerát fosfoenolpyruvátpyruvát P P P P AT NADH P PP ADP AT ADP 2 2 2 2 22 aldoláza Piglyceraldehyd-3-P dehydrogenáza 2 AT 2 ADP P fosfoglycerokináza enoláza pyruvát kináza 2 ADP P2 AT laktátetanol acetaldehyd+CO2 pyruvátdekarboxyláza NAD+ NADH NAD+ laktát dehydrogenáza alkohol dehydrogenáza dihydroxyaceton fosfát 10 Fermentace • Homofermentativní kvašení – konečným produktem je jedna látka v převažujícím množství (obvykle více než 90 %) homofermentativní mléčné kvašení – Lactobacillus acidophilus → kyselina mléčná (acidofilní mléko) • Heterofermentativní kvašení – konečným produktem je několik metabolitů (některý může převažovat) – máselné kvašení Clostridium → kyselina máselná, butanol, izopropylalkohol, aceton Etanolové kvašení u kvasinek Glukóza fruktóza-diP 2 gly-P 2 trióza-P pyruvát 2 acetaldehyd 2ATP 2ADP 4ATP 4ADP 2CO2 2NAD+ 2NADH+H+ EMP dráha 2CO2 2 etanol Čistý výtěžek : 2 ATP/mol glukózy U bakterií pouze u Sarcina ventriculi 11 Etanolové kvašení u bakterií ketodeoxyglukonátová (Entner-Doudorofova)dráha glukóza glu-6-P glukonát-6-P 2-oxo-3-deoxy-6-P-glukonát pyruvát glyceraldehyd-3-P etanol CO2 etanol CO2 + + -2H+ - H2O + 2H+ +2H+ ATP ADP 2 ADP 2 ATP Čistý výtěžek: 1 ATP/ mol glukózy Organizmus: Zymomonas Homofermentativní mléčné kvašení glukóza EMP 2 pyruvát 2 NAD+ 2 NAD+ 2 NADH+H+ 2 ATP 2 ADP 4 ADP 4 ATP Čistý výtěžek : 2 ATP/mol glukózy 2 laktát 2 CO2 Organizmy : Lactobacillus acidophilus, L.bulgaricus, L.casei, L. leichmannii, Streptococcus lactis 12 Heterofermentativní mléčné kvašení (fosfoketolázová dráha)glukóza glukóza-6-P k.6-P-glukonová ribulóza-5-P Čistý výtěžek : 2 ATP/mol glukózy ATP ADP NAD+ NADH+H+ xylulóza-5-P glyceraldehyd-3-P acetylfosfát Acetyl-KoAk.pyrohroznová acetaldehyd CO2 NAD+ NADH+H NAD+ NADH+H+ 2 ADP 2 ATP NAD+ NADH+H+ laktát fosfoketoláza ADP ATP HSKoA NADH+H+ NAD+HSKoA NADH+H+ NAD+ etanol Organizmy : Lactobacillus brevis, L.delbrueckii, Leuconostoc mesenteroides Máselné kvašení glukóza pyruvát acetyl-koA koAacetaldehyd acetyl-koA butyryl-koA krotonyl-koA β-hydroxybutyryl-koA acetoacetyl-koA acetoacetát butyrylaldehyd acetát acetát acetyl-koA etanol acetát CO2 aceton izopropanol CO2 H2+ butyrát butanol NAD+ NADH+H+ NAD+ NADH+H+ NAD+ NADH+H+ NAD+ NADH+H+ EMP NAD+ NADH+H+ NAD+ NAD+ NADH+H+ NADH+H+ Organizmy: Clostridium butyricum, C.butylicum, C.acetobutylicum, C.saccharoperbutylacetonicum 13 Tvorba energie na úrovni membrány • Aerobní respirace • Anaerobní respirace • Fototrofie Tvorba energie na úrovni membrány • Aerobní respirace neúplná oxidace substrátu primárních alkoholů glukózy úplná oxidace substrátu Krebsův cyklus Cyklus dikarbonových kyselin Cyklus kyseliny glyoxalové Pentózový cyklus (hexózomonofosfátová dráha) 14 Neúplná oxidace alkoholů • Oxidace primárních alkoholů kyseliny • Oxidace sekundárních alkoholů ketony Neúplná oxidace glukózy glukóza glukóza-6-P k.glukonová k.6-P-glukonová ribulóza-5-P k. 2-ketoglukonová k. 5-ketoglukonová Acetobacter melanogenum k. 2,5-diketoglukonová Acetobacter suboxidans fosforylační dráha nefosforylační dráha Gluconobacter 15 Úplná oxidace substrátu Krebsův cyklus ATP respirační řetězec β-oxidace mastných kyselin glykolýza Oxidace biomolekul protein lipid nukleové kys. polysacharidy peptidy aminokyseliny glycerol + mastné kyseliny puriny pyrimidiny kys.močová dihydroxyuracil pentózy monosacharidy pyruvát acetát TCA NH4 + S2- PO4 3CO2 H2O+ + + + 16 Oxidace n-alkanů • Monotereminální oxidace – první uhlík alkohol kyselina β-oxidace • Diterminální oxidace – jsou oxidovány oba terminální uhlíky za vzniku směsi kyselin Anaerobní respirace 17 Anaerobní respirace • Při anaerobní respiraci je organický substrát oxidován přenosem protonů a elektronů na kyslík vázaný v anorganické látce • Elektrony a protony přenášípříslušné cytochromreduktázy • Tímto způsobem získávají energii chemoorganotrofní bakterie, vyjímečně chemolitotrofní • U chemoorganotrofních bakterií je organická látka současně zdrojem energie i uhlíku Anaerobní respirace Procesy anaerobní respirace * redukce dusičnanů na dusitany * denitrifikace * desulfurikace * redukce CO2(metanové kvašení) 18 Nitrate Nitrite Nitric oxide Nitrous oxide Dinitrogen Gases Nitrate reduction (Escherichia coli) Denitrification (Pseudomonas stutzeri) NO3  NO2  NO N2O N2 Nitrate reductase Nitrite reductase Nitric oxide reductase Nitrous oxide reductase Redukce dusičnanů na dusitany • Nitrát reduktáza je membránově vázaný enzym obsahující molybden • Syntéza nitrát reduktázy je striktně blokována molekulovým kyslíkem • Na 1 mol NO3 - - 2 ATP • Hromadění vytvořeného dusitanu potlačuje růst bakterií • Organizmy: E.coli, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus a další fakultativně anaerobní bakterie Nitrát reduktáza Fp - flavoprotein FeS – bílkovina s nehemově vázaným Fe-S 19 Redukce dusičnanů na dusitany • Zdrojem vodíku a elektronů může být jakákoli organická látka CH3COOH + 4NO3 - CO2 + 4NO2 - + 2 H2O nebo C6H12O6 + 12 NO3 - 6 CO2 + 6 H2O + 12 NO2 - Denitrifikace • Denitrifikace – proces redukce dusičnanů na N2 nebo N2O nebo směs obou plynů 2 NO2 - + 4 H+ N2O + H2O + 2 OHN2O + 2 H+ N2 + H2O CH3COOH + 2 NO2 - 2 CO2 + N2O + H2O + 2 OH- 20 Desulfurikace • Donorem elektronů a protonů je organická látka nebo plynný vodík • Jako akceptor vystupuje síran, siřičitan, thiosíran, tetrathionát, …. • Redukci těchto látek uskutečňují především anaerobní bakterie – zástupci rodů Desulfovibrio, Desulfotomaculum, Desulfosarcina, Desulfonema a některé Archaea Desulfonema sp. Desulfurikace Při procesu desulfurikace vznikají energeticky bohaté sloučeniny APS - adenozin 5´-fosfosulfát a PAPS – fosfoadenozin-5´-fosfosulfát Využíván v disimilačním metabolizmu Využíván v asimilačním metabolizmu 21 Redukce CO2 a CO • Konečným produktem je metan • Organizmy jsou striktní anaerobové (jsou podstatně citlivější ke kyslíku než denitrifikační nebo desulfurikační bakterie) • Jsou dvě skupiny organizmů využívajících jako akceptor protonů a elektronů CO2 metanogenní homoacetogenní • Jako zdroj vodíku a elektronů nikdy nevyužívají cukry a aminokyseliny • Jako substrát slouží H2, nižší mastné kyseliny, primární alkoholy, izoalkoholy. 22 Redukce CO2 - donor metanol metanogeneze Corr – protein obsahující korrinoid CODH – karbonmonooxid dehydrogenáza metanogeneze biosyntéza Tvorba acetyl-koA pro biosyntézu Využití redukční síly k redukci metanolu na metan Tvorba redukční síly oxidací metanolu na CO2 Co dehydrogenáza Redukce CO CO + H2O CO2 + H2 CO2 + 4 H2 CH4 + H2O Sumárně CO + 3 H2 CH4 + H2O Organizmus: Methanobacterium formicum 23 Některé alternativní akceptory elektronů v anaerobní respiraci • Desulfotomaculum auripigmentum redukuje arsenát po redukci síranů – As2S3 – je vytvářen intracelulárně i extracelulárně. Produkce “minerálů“ se označuje jako biomineralizace. As2S3 Tvorba As2S3 v prostředí je součástí detoxifikačních procesů v prostředí Chemolitotrofní bakterie 24 Energetický metabolizmus chemolitotrofních bakterií • Chemolitotrofní bakterie získávají energii procesy aerobní respirace • Zdrojem energie je redukovaná anorganická látka • Konečným akceptorem vodíku a elektronů je molekulový kyslík • Zdrojem uhlíku je CO2 • Bakterie jsou striktně aerobní Energetický metabolizmus chemolitotrofních bakterií Podle povahy substrátu Oxidace amoniaku (nitrifikace) Oxidace sloučenin síry (sulfurikace) Oxidace sloučenin železa Oxidace vodíku Oxidace metanu 25 Fototrofní bakterie Energetický metabolizmus fototrofních bakterií • Fotofosforylace - proces transformace energie světelného kvanta do energie makroergické vazby • Fototrofní mikroorganizmy purpurové nesirné bakterie heliobakterie zelené sirné bakterie purpurové sirné bakterie cyanobakterie halobakterie (bez bakteriochlorofylu) 26 Bakteriochlorofyl a – purpurové (805, 830-890nm) b – purpurové (835-850, 1020- 1040nm) c – zelené sirné (745-755nm) cs – zelené nesirné (740nm) d – zelené sirné (705-740nm) e – zelené sirné (719-726nm) g – halobakterie (670, 788nm) Bakteriochlorofyl Cyklická fosforylace přenašeč elektronů energie pro tvorbu ATP Elektrontransportní řetězec exitované elektrony (2e-) světlo 27 Necyklická fosforylace H2S S H++H+ energie pro tvorbu ATP Elektrontransportní řetězec exitované elektrony (2e-) světlo Fotosyntéza u sinic • na povrchu thylakoidálního váčku se nachází tzv. fykobilizómy • jsou to drobné útvary (které obsahují specifická barviva, zvaná fykobiliny (fykobiliproteiny) • v membráně thylakoidu jsou obsaženy chlorofyl a, - i karoten a xantofyly (echinenon, myxoxanthofyl, zeaxantin) allofykocyaniny (namodralé barvy) 28 Fotosyntéza bez chlorofylu halobakterie • Pokud halobakterie rostou při nízké tenzi kyslíku, mohou syntetizovat “červené“ skvrny v cytoplazmatické membráně - bakteriorodopsin • Skvrny obsahují 7 bílkovinných molekul (α helix). Na jednu molekulu je připojen retinal • Bakteriorodopsin (aldehyd vitaminu A) maximálně absorbuje při 570 nm Fotosyntéza bez chlorofylu halobakterie • Bakteriorodopsin absorbuje maximální množství energie ze záření • Mimo bakteriorodopsinu halobakterie neobsahují další “foto“ pigment • Tvorba energie není doprovázena tokem elektronů, ale tokem protonů 29 ANABOLIZMUS BIOSYNTÉZA ANABOLIZMUS - BIOSYNTÉZA • Při anabolizmu je ke tvorbě molekulových komplexů a struktur z malých molekul využívána volná energie získaná v procesech katabolizmu • Procesy biosyntézy jsou regulovány tak, aby byla co nejefektivněji využíváno energie a stavebního materiálu • Katabolické a anabolické dráhy mají odlišné enzymy, kofaktory,donory vodíku a elektronů, regulaci, lokalizaci v buňce, … • Avšak řada enzymů se podílí na průběhu katabolických i biosyntetických drah 30 ANABOLIZMUS - BIOSYNTÉZA • Fosfor ve formě fosfátu může být asimilován přímo • Anorganický dusík a síra musí být většinou před inkorporací do buněčného materiálu redukován • Autotrofové využívají v biosyntetických pochodech ATP a NADPH z fototrofie nebo oxidace anorganických látek pro redukci a inkorporaci CO2 do organického materiálu Fixace CO2 při metabolizmu mikroorganizmů NADPH2-dependentní izocitrát malát Feredoxin-dependentní pyruvát ATP karbamyl-P PEP oxalacetát 2-oxoglutarát enzym+biotin+CO2 Komplex metylmalonyl-koA malonyl-koA oxalacetát Fixace redukcí Fixace aktivní CO2 31 Calvinův cyklus 6 ribulóza-1,5-diP 12 fosfoglycerová k. 12 1,3di fosfoglycerová k. 12 3-P glyceraldehyd glukóza-6P 2 fruktóza-1,6diP 2 xylulóza-5P 2 erytróza-4P2 sedoheptulóza-1,7diP 2 ribulóza-5P 2 xylulóza-5P 6 ribulóza-5P 242 2 2 6 CO2 6 H2O 12 ATP 12ADP 12NADPH 12 NADP+ 12 Pi Nová dráha autotrofní fixace CO2 citrátoxalacetát malát fumarát sukcinát α-ketoglutarát izocitrát 2 H+ malát dehydrogenáza H2O sukcinyl-koA 2 H+ fumarát reduktáza fumaráza ATP ADP koA 2H+ koA 2H+ akonitáza ATP citrát lyáza ATP ADP koA acetyl-koA Chlorobium limicola, Hydrogenobacter thermophilus, Desulfobacter hydrogenopohilus CO2 CO2 32 Fixace CO2 heterotrofy • Doplňování intermediátů Krebsova cyklu (anaplerotické reakce) fosfoenolpyruvát + CO2 oxalacetát + Pi pyruvát + CO2 + ATP oxalacetát + ADP + Pi pyruvát + CO2 + NADH+H+ malát + NAD+ PEP-karboxyláza pyruvát karboxaláza biotin jablečný enzym Asimilace dusíku NH4 NH4 + NO3 - N2 glutamát glutamin glutamát 2-oxoglutarát aminokyseliny pyruvát 2-oxoglutarát glutamát aminokyseliny alanin aminokyseliny + 2 [H+] + 2 [H+] + 2 [H+] ADP ATP redukce 33 Syntéza monosacharidů • Glukoneogeneze je využívána většinou mikroorganizmů • Jde o obrácenou glykolýzu (modré šipky naznačují průběh glykolýzy) Syntéza monosacharidů • Reduktivní cyklus trikarbonových kyselin CO2 CO2