1 Základy genetiky prokaryotické buňky Chromozomová (jaderná) DNA  U prokaryot (bakterie, archaea) dvouřetězcová většinou kružnicová  U eukaryot dvouřetězcová lineární  U DNA-virů dvouřetězcová lineární, jednořetězcová lineární nebo jednořetězcová kružnicová  Extrachromozomální DNA - plazmidová, chloroplastová a mitochondriová DNA jsou většinou kružnicové 2 Replikace nukleových kyselin  Replikace – tvorba kopií molekul nukleových kyselin zajišťujících přenos genetické informace z DNA do DNA nebo z RNA do RNA Semidiskontinuální syntéza DNA Replikace chromozómové DNA 3 Replikace plazmidové DNA replikace počátek replikace replikační vidlice rodičovský řetězec dceřinný řetězec replikační vidlice terminace replikace Základní schéma transkripce u DNA-virů, prokaryot, eukaryot Primární transkript - hnRNA heterogenní nukleární RNA, prekurzorová RNA nebo také pre-RNA 4 Dědičnost, proměnlivost a přenos znaků u mikroorganizmů  dědičnost – proces, kterým je v procesu reprodukce předáván genetický materiál na potomstvo (vertikální přenos – mezi generacemi; horizontální přenos – mezi jedinci téže generace – u bakterií)  dědičné znaky – vlastnosti organizmu vzniklé expresí genů (dědí se informace o znaku, ne znak) Genetická informace  Genetická informace je obsažena ve sledu (pořadí) nukleotidů – nukleotidových sekvencích funkčních typů nukleových kyselin 5 Základní pojmy  Gen – informační a funkční genetická jednotka obsahující genetickou informaci Gen obsahuje genetickou informaci o primární struktuře buď * funkční molekuly translačního produktu (polypeptidu, proteinu) * funkční molekuly produktu transkripce (tRNA, rRNA atd.) nepodléhající translaci * nebo má regulační funkci Genetický kód  Systém pravidel determinujících způsob přepisu pořadí nukleotidů do pořadí aminokyselin v peptidickém řetězci 6 Genetický kód  Základní jednotkou genetického kódu je kodon tj. pořadí nukleotidů kódující určitou aminokyselinu v peptidickém řetězci Genetický kód  Genetický kód je tripletový  Je sestaven ze 64 kodonů  Je degenerovaný (jedna aminokyselina je kódována několika kodony)  Aminokyseliny kóduje pouze 61 kodonů  Schopnost kodonu kódovat aminokyselinu se označuje jako smysl kodonu 7 Genetický kód Kodony První nukleotid Druhý nukleotid Třetí nukleotid (5´konec) U C A G (3´konec) U Phe Ser Tyr Cys U Phe Ser Tyr Cys C Leu Ser N N n.Secys A Leu Ser N Trp G C Leu Pro His Arg U Leu Pro His Arg C Leu Pro Gln Arg A Leu Pro Gln Arg G A Ile Thr Asn Ser U Ile Thr Asn Ser C Ile Thr Lys Arg A Met n.I Thr Lys Arg G G Val Ala Asp Gly U Val Ala Asp Gly C Val Ala Glu Gly A Val Ala Glu Gly G N – nesmyslný kodon I – iniciační kodon Genetický kód  Některé kodony jsou nesmyslné * UAA - ochre * UAG - amber signalizují ukončení syntézy polypeptidu (terminační kodony) * UGA - opal je bifunkční - terminační kodon - kodon pro selenocystein 8 Gen  Lokus - umístění genu kódujícího daný enzym metabolické dráhy na různých místech chromozomu (u eukaryot)  Geny na chromozomu jsou seřazeny lineárně, to umožňuje sestavení genetické mapy  Vždy několik kopií životně důležitých genů – na různých chromozomech (eukaryota) nebo na různých místech chromozomu (prokaryota) Genom – souhrn všech genů buňky nebo viru  U eukaryot jsou geny lokalizovány v různých organelách → jádro, mitochondrie nebo chloroplasty (případně plazmidy)  U prokaryot jsou geny lokalizovány na chromozomové DNA a plazmidech 9 Genotyp  Souhrn všech genů představujících genetickou informaci * nesených na chromozomální i extrachromozomální DNA  Projev genotypu (potenciál pro projev v podobě znaků) je závislý na podmínkách vnějšího prostředí Fenotyp  Projev genotypu za daných vnějších podmínek  Znamená to, že daný genotyp se může v různých podmínkách projevit různě 10 Fenotyp  Pokud je změna vnějších podmínek tak intenzivní, že vede k nápadné změně fenotypu, označuje se tato změna jako modifikace fenotypu  Modifikace se projevuje u převážné části mikrobiální populace  Modifikace je jev reverzibilní. Po odeznění podmínek vyvolávajících změnu, se vrací populace do “normálního“ stavu Plazmidy  Samostatný replikon tvořený dsDNA (cirkulární nebo lineární)  Některé plazmidy jsou epizomální (v procesu integrace se plazmid stane součástí chromozomu)  Nenese informace o dělení buňky  Nese informace o specifickém fenotypovém projevu plazmid 11 Plazmidy  Každý plazmid obsahuje * lokus ori – počátek replikace * lokus inc – místo pro připojení na biologickou membránu při replikaci Plazmidy  Plazmid je * jednokopiový – pouze jedna kopie DNA v buňce * vícekopiový – několik kopií téhož plazmidu v buňce 12 Plazmidy  Plazmid je * kompatibilní – dva různé plazmidy v jedné buňce mají odlišný lokus inc, mohou se replikovat současně * inkompatibilní – mají stejný lokus inc, nemohou se replikovat současně Plazmidy  Plazmid je * konjugativní – jsou přenášeny konjugací, obsahují geny tra – transferové geny (označované i jako fertilitní faktor) zodpovědné za syntézu sexuálních pilusů, a průběh konjugace * nekonjugativní – neobsahují geny tra, do recipientních buněk mohou být přeneseny transformací nebo transdukcí 13 Plazmidy u bakterií Plazmidy se u bakterií vyskytují velice často – málo druhů bez plazmidů  Plazmidy F a F´ - konjugativní plazmidy u E.coli K12 * F faktor (fertilitní faktor) * Jsou zodpovědné za průběh konjugace * Jsou zodpovědné za syntézu sexuálních pilusů F´ vznikl chybným vyčleněním F z chromozomu R - plazmidy  R faktory jsou zodpovědné za rezistenci k * antibiotikům * těžkým kovům * buněčným toxinům  Objeveny byly v Japonsku v r. 1950 při epidemii dyzenterie  Jeden plazmid může nést informaci o rezistenci k několika látkám – vznik polyrezistentních kmenů 14 R - plazmidy R plazmid Bacteroides fragilis kódující rezistenci ke clindamycinu počátek replikace počátek přenosu Bakteriocinové faktory  Bakteriocin – bílkovina usmrcující citlivé kmeny téhož druhu nebo jiných druhů  Bakteriociny působí na cytoplazmatickou membránu nebo na syntézu bílkovin. Mohou také blokovat vazebná místa na buněčné stěně (receptory)  Col plazmidy – informace o syntéze kolicinů  Ti-plazmidy Agrobacterium tumefaciens – produkty jejich genů vyvolávají tvorbu nádorů u dvouděložných rostlin, vektor pro cílený přenos genů do buněk rostlin – transgenní rostliny 15 Bakteriocin Pyocin R - Pseudomonas aeruginosa Plazmidy kvasinek  Dosud popsány u některých druhů rodu Saccharomyces, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Candida a Zygosaccharomyces  Nejlépe prostudovaným je plazmid označený 2μm Saccharomyces cerevisiae  Vyskytuje se v nukleoplazmě v 60-100 kopiích na diploidní buňku  Plazmid 2μm se používá v genovém inženýrství jako vektor pro klonování  Význam není zatím popsán 16 Plazmid 2μm u Saccharomyces cerevisiae ↑ Překřížení ds cirkulární DNA obvodová délka 2μm 6,3 kb Změna genetické informace  Mutace  Rekombinace 17 Mutace  Kvalitativní nebo kvantitativní změna v genetické informaci organizmu, jeho genotypu  Náhodné a neusměrněné změny genotypu * spontánní – vznikají samovolně a s malou frekvencí (chyba při replikaci DNA nebo skrytý vliv prostředí, frekvence 10-7 – 10-10) * indukované – vznikají po působení fyzikálních nebo chemických faktorů – mutagenů  Molekulový princip spontánních i indukovaných mutací je stejný Mutace  Genové – změny v genetické informaci, které proběhly v rámci genu a nenarušily celistvost stavby chromozomu  Chromozomové – vedou ke zlomům a přestavbám struktury chromozomu  Genomové – změny v počtu chromozomů 18 Mutace genové  Tranzice – výměna purinové baze za purinovou  Transverze – výměna purinové baze za pyrimidinovou  Inzerce – vsunutí nové báze  Delece – ztráta jedné baze Mutace genové  Jednobodové mutace  Vícebodové mutace  Mutace měnící smysl kódu  Mutace měnící čtení kódu  Vzájemná nezávislost mutací – mutace v kterémkoliv bodě genu probíhá nezávisle na mutacích v jiných bodech genu 19 Mutace genové – tranzice a transverze mutace Normální replikace DNA transkripce asparagin Stop kodon tyrozin tyrozin normálnínormálnínekompletnídefektní protein Mutace s chybným smyslem (missense mutation) non sense Nevýznamná (silent mutation) divoký typ Mutace genové – inzerce, delece transkripce inzerce delece kodony Čtecí rámec Použití alkylačních činidel, např. akridinová barviva, změna smyslu, ale i celého čtecího rámce 20 Mutace chromozomové  Dochází ke ztrátám nebo přemístění větších „bloků“genetických informací (odpovídající větším skupinám genů), u eukaryot ABCDE původní stav ABC koncová deficience ABE interkalární delece ABEDC inzerce ABCDEKLM translokace ABCBCDE duplikace ABCCBBCDE triplikace Mutace genomové  Aneuploidie - ztráta nebo nadbytečná přítomnost některých jednotlivých chromozomů * monozomie – ztráta jednoho chromozomu z některého z chromozomových párů * trizomie – přítomnost tří homologických chromozomů namísto párového uspořádání (u člověka trizomie chromozomu 21 – Downova choroba – „mongolizmus“)  Polyploidie – početní změny celistvých chromozomů (využití ve šlechtitelství)  Jen u eukaryot 21 Mutační rychlost  Pro buňku platí konstantní pravděpodobnost, že bude v daném znaku mutovat v daném čase  Předpokladem pro kvantitativní stanovení je, že část ploten bude bez mutantů  Část ploten bez mutantů naznačuje, že v této kultuře nedošlo k mutaci Izolace mutantů – selektivní medium Narostlá kultura v kompletním mediu Medium se streptomycinem Kultivace Narostlé mutanty Izolace spontánních mutantů 22 Izolace mutantů–metoda gradientních ploten MPA + penicilin MPA ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● Izolace mutantů – replika ploten mutanty nerostouvyrostou všechny buňky mutanty nerostou kultivace minimální medium kompletní medium vyrostou všechny buňky přitlačíme misku na samet otiskneme razítko na plotny růst na kompletním mediu sterilní samet gumička dřevěný blok na sametu jsou otisknuté všechny kolonie 23 Mutageny  Změna ve struktuře bazí Kyselina dusitá – oxidativně deaminuje baze (adenin na hypoxantin – párování s cytozinem,cytozin na uracil – párování s adeninem; AT↔GC) Hydroxylamin – reaguje pouze s pyrimidiny; transice pouze ve směru GC→AT Alkylační činidla – do bází inkorporují alkylovou skupinu CH3- , CH3CH2- , …(yperit, dimetyl-, dietylsulfonát, metyl- , etylmetanosulfonát, …) – změněnou bázi DNA polymeráza nerozeznává Vyvolávají změny, i když se DNA nereplikuje Mutageny  Změny vyvolané analogy bazí 5-bromuracil analog tyminu 5-bromdeoxyuridin analog tyminu 2-aminopurin analog adeninu  Vyvolávají (mutace AT↔GC) Vyvolávají změny, když se DNA replikuje 24 Mutageny  Změny vyvolané ionizujícím zářením Ionizující záření (RTG, záření , tok protonů, neutronů a elektronů) vyvolává rupturu chromozomu nebo změny v bazích. V přítomnosti kyslíku se vytvářejí radikály, které zvyšují frekvenci zlomů, zabraňují opětovnému spojování chromozomu  Mutageny  Změny vyvolané UV zářením  Dimerizace dvou sousedních tyminů na stejném řetězci (tyminy jsou spojeny cyklobutanovým kruhem). Dimery jsou stabilní  Pokud není provedena oprava, je změna letální 25 Opravy mutací  Reverze – reverzní mutace (revertanti) Pokud mutant vznikl bodovou mutací, může revertovat na divoký typ tranzicí nebo tranzverzí Mutace z divokého typu na mutantní je obvykle rychlejší Pravděpodobnost, že obě mutace proběhnou ve stejné buňce, je nepatrná (je součinem pravděpodobností obou mutací 10-8 x 10-8 = 10-16)  Fotoreaktivace Fotoreaktivační enzym (fotolyáza) – po aktivizaci intenzivním viditelným světlem štěpí nebo monomerizuje tyminové dimery – reakce probíhá v jediném enzymovém stupni . Vyznačuje se vysokou specifitou – působí pouze na pyrimidinové dimery K fotoreaktivaci dochází také na RNA, která byla poškozena UV světlem Opravy mutací 26 Opravy mutací Fotoreaktivace Fotoreaktivační enzym + viditelné světlo tyminový dimer T T ^ cyklobutanový kruh Opravy mutací  Excizní oprava poškozená báze DNA glykozyláza AP poloha endonukleáza excizní exonukleáza DNA polymeráza I DNA ligáza nová DNA Probíhá i ve tmě, multienzymový komplex AP – DNA glykozyláza odstraní poškozenou bázi excizní exonukleáza odstraní několik nukleotidů 27 Opravy mutací  Postreplikační rekombinační oprava + + ● ● ● ● Dvoušroubovice obsahuje dimer (●) Dceřiné řetězce obsahující mezery proti dimerům v rodičovských řetězcích Rekombinantní dvoušrobovice s dimery v jedné šroubovici a mezerami v druhé opravená dvoušrouboivice opravná syntéza DNA / DNA ligáza Vyloučí se z dalšího procesu Probíhá u bakterií, které ztratily schopnost fotoreaktivace a excizní opravy Mutace z hlediska jejich fenotypového projevu  Morfologické mutanty – změněný tvar buňky kolonií (M→S→R)  Fyziologické mutanty – rezistence k antibiotikům, dezinfekčním látkám, bakteriofágům, ztráta schopnosti konjugace, sporulace, ts-mutanty, …  Biochemické mutanty – jediným fenotypovým projevem je změna metabolizmu - mutanty se změnou strukturního genu – změna enzymaticky aktivní bílkoviny - regulační mutanty – změněná regulace metabolizmu (mutace regulátorového genu, promotoru, operátoru, inzerce transpozonu, ..) 28 Změna genetické informace  Mutace  Přenos znaků (rekombinace) * u prokaryot * u eukaryot Přenos znaků u prokaryot  Rekombinace * transformace – přenos izolované DNA do recipientní buňky * transdukce – přenos DNA z donorové buňky do recipientní pomocí bakteriofága * konjugace - přenos DNA z donorové buňky do recipientní konjugačním můstkem 29 Transformace Donorová buňka Recipientní buňka Kompetentní recipientní buňka (živá) Transformovaná rekombinovaná buňka Fragmenty DNA z donorové buňky degradace buňky volná DNA (chromozomální, plazmidová) Transformace – vznik rekombinantního transformanta fragmenty DNA chromozom recipientní buňky vazba a přenos chromozomální DNA degradace DNAintegrace DNA stabilní transformant neúspěšná transformace nebo 30 Transformace – vznik plazmidového transformanta plazmidová DNA chromozom recipietní buňky absorbce a přenos plazmidové DNA plazmidový transformant Transdukce přenos DNA donorové buňky do recipientní bakteriofágem fágová DNA nebo transdukující fágová částice plazmid donorové buňky fragment chromozomu donorové buňky “normální“, netransdukující, lyticky aktivní fágový virion 31 Transdukce  Pro transdukci je používán pouze temperovaný bakteriofág  Transdukce nespecifická – je přenášen jakýkoliv úsek DNA hostitelské buňky (fragment chromozomu nebo plazmid)  Transdukce specifická – je přenášen určitý úsek DNA hostitelské buňky (fág λ E.coli přenáší pouze gen gal nebo bio) Konjugace  Tvorbu sexuálního pilusu kóduje gen nesený na plazmidu F (buňky F+) – fertilitní faktor – gen tra konjugativní plazmid  Výsledkem konjugace je * plazmidový transkonjugant * rekombinantní transkonjugant 32 Vznik plazmidového transkonjuganta bakteriální chromozom F plazmid pilus F+ buňka F- buňkazkrácení pilusu rozštěpení jednoho řetězce plazmidu přenos jednoho řetězce do recipientní buňky syntéza komplementárních řetězců v obou buňkách dokončení přenosu a syntézy - oddělení buněk F+ buňka F+ buňka Vznik rekombinantního transkonjuganta Vznik buněk Hfr Hfr buňky vznikají inzercí plazmidu F do chromozomu donorové buňky Hfr buňkyF+ buňky integrovaný faktor F inzerce faktoru F Rekombinace mezi F faktorem a chromozomem buňky 33 Mapování chromozomu–přerušovaná konjugace HfrFKruhový chromozom E.coli Důkaz kruhového chromozomu E.coli Konjugací různých kmenů Hfr s buňkami F- byl prokázán kruhový chromozom a měl „délku“ asi 100 minut