Identifikace bakterií
Identifikace
 Identifikace mikroorganismů = stanovení příslušnosti k určité taxonomické skupině
 Je potřebné mít čistou kulturu
Hodnotíme:
 Morfologii (makroskopické znaky - tvar a zbarvení kolonie, mikroskopické – barvení, Gram,
acidorezistence, pouzdra, spory…)
 Fyziologii (vztah ke kyslíku, k NaCl, ATB, teplota růstu, rezistence, typ metabolizmu)
 Biochemii (zdroj C, redukce nitrátů, tvorba indolu…)
 Doplňující testy (molekulární diagnostika – PCR, sekvenace, ribotypizace, obsah G+C v DNA;
serotypizace, imunochemické reakce, chemická analýza buňkové stěny, patogenita)
Standardizované testovací systémy
 Rychlé zpracování velkého množství vzorků
 Odstranění individuálních rozdílů v přípravě, provedení i hodnocení
 API systém
 Mikro-LA-Test – ENTEROtest, STAPHYtest, ANAEROtest - destičky s jamkami kam se kape buněčná
suspenze
 Hodnocení – tabulky či počítačový program
API test STAPHYtest24
Latexová aglutinace
Enterobacteriaceae
 Gramnegativní tyčky
 Fakultativně anaerobní, chemoautotrofní, mezofilní,
 Oxidáza negativní (výjimka Plesiomonas), kataláza pozitivní, glukózu
štěpí za tvorby plynu, redukují nitráty
 Většina žije v trávícím traktu obratlovců - součást mikroflóry
 Klinicky významná skupina, někteří nepatogenní, někteří jsou
původci závažných onemocnění
 Yersinia pestis, Salmonella (serovary Typhi, Paratyphi), E. coli
 Jejich přítomnost ve vodě znamená fekální znečištění
Průkaz enterobakterií
 1. Odlišení G+ a G- (Gramovo barvení, KOH test (+) )
 2. Kataláza (+)
 3. Oxidáza (-)
 4. Využívání cukrů, produkce H2S a plynů (TSI + Hajn) (+)
 4. Štěpení glukózy aerobně (oxidace) (+) a anaerobně (fermentace) (+) (OF test)
 5. ENTEROtest + ONPG test
 Diagnostické půdy: Endo, MacKonkey, Desoxychlolát-citrátový, Salmonella-Shigella, Simonscitrát
agar
KOH test
 Odliší G+ a G- bakterie
 Kapka 3% KOH na sklíčko
 V kapce se kličkou rozmíchá kultura
 U G- se poškodí stěna a vylije se obsah buňky,
teda suspenze bude viskózní, bude se bude
táhnout za kličkou
 U G+ se suspenze netáhne za kličkou
 Enterobakterie +
Katalázový test
 Rozliší bakterie mající enzym katalázu
 Kataláza rozkládá peroxid vodíku na vodu a kyslík
 Na sklíčko s kulturou se kápne 3% peroxid
 Pozitivní kataláza = uvolňují se bublinky kyslíku, šumí to
 Enterobakterie +
Papírkový oxidázový test
 Identifikuje MO, které vytvářejí enzym cytochrom c oxidáza
 Na papírky se kličkou nanese 24h kultura / papírek se přitlačí na kulturu v misce / ponoří se do
tekuté kultury
 Papírek zmodrá do 30 s = pozitivní reakce
 Papírek zmodrá do 2 min = opožděně pozitivní
 Papírek beze změny = negativní
 Enterobakterie –
TSI test (triple-sugar iron) s indikátorem
železa podle Hajny
 Test na utilizaci laktózy, glukózy, sacharózy, produkci H2S a plynů
 Do tuhého média ve zkumavce se vpíchne kultura a vzápětí se naočkuje hádkem na šikmou plochu
 Po 24-48h/37°C sledujeme změny
 Žlutá celá půda = kultura zkvašuje laktózu a sacharózu (nahoře) i glukózu (dole)
 Žlutá horní šikmá plocha a červený spodek = zkvašuje L, ne G
 Všechno zůstane červené = nevyužívá ani L ani G
 Médium zčerná = produkce sirovodíku
 Bublinky = produkce plynu kvašením
 Enterobakterie: cukry +, sirovodík +, plyn +
OF test – test na oxidaci/fermentaci
 Detekce respiračních enzymů, detekce přítomnosti oxidázy
 2 zkumavky s polotuhým médiem a acidobazickým indikátorem (bromthiolová modř) v kyselém
prostředí žlutne, v zásaditém modrá a v neutrálním zelená
 Vpichem se naočkuje kultura
 Jedna zkumavka se kultivuje aerobně, druhá anaerobně (zakápnuta parafinem), odečet po 24h
OF test
 Pozitivní reakce = žlutá barva, negativní =modrá/zelená
 Obě zkumavky žluté = pozitivní oxidace (aerobní štěpení) i fermentace = fakultativní anaerob,
možná enterobakterie
 Aerobní zkumavka pozitivní (žlutá), anaerobní negativní (modrá) = jen aerobní druh,
nefermentující, např. Aeromonas, Vibrio, Pseudomonas (když je vidět pohyb)
 Obě zkumavky negativní (modré) =
glukózu nefermentuje ani aerobně neštěpí
Alcaligenes (ox+), Agrobacterium (ox-)
Enterotest
 Pro identifikaci fermentujících bakterií z čeledi Enterobacteriaceae
 Komerční systém jamkových testů
 16 testů (2 řady po 8), + zkumavkový test na β-galaktozidázu (ONPG)
Testy v jamkách:
 (H2S) produkce sirovodíku
 LYS dekarboxylace lysinu
 IND produkce indolu
 ORN dekarboxylace ornithinu
 URE rozklad močoviny
 PHE deaminace fenylalaninu
 ESC hydrolýza eskulinu
 SCI utilizace citrátu
 MAL utilizace malonátu
 INO produkce kyseliny z inositolu
 ADO produkce kyseliny z adonitu
 CEL produkce kyseliny z celobiózy
 SUC produkce kyseliny z sacharózy
 SOR produkce kyseliny z sorbitolu
 TRE trehalózy
 MAN mannitolu
Enterotest
 Z 24h kultury se připraví 3 ml suspenze buněk ve fyz. roztoku se zákalem 1 podle stupnice
MacFarlanda
 Destička se dá na výšku, odřízne se fólie a napíší se na ní čísla kmenů
 Suspenze se důkladně přetřepe a pipetuje se z ní 100 μl do každé jamky
 Prvních 5 jamek zakápnout parafinem – aby testy mohli probíhat anaerobně (H1, G1, F1, E1, D1)
 Destička se uloží do sáčku a kultivuje se 18-24h/37°C + zkumavkový ONPG test
Papírkový ONPG test
 Důkaz produkce β-galaktozidázy – štěpí laktózu
 Bezbarvý substrát (o-nitrofenyl-β-D-galaktopyranozid) v případe + reakce zežloutne (ortho-
nitrofenol)
 Do zbytku fyziologického roztoku s kulturou se vloží testovací proužek na ONPG test, kultivace
24h/37°C se vyhodnotí zežloutnutí