doc. Mgr. Vítězslav Bryja, Ph.D. Buněčné systémy ve vývoji Nobelova cena za fyziologii a medicínu 2018 Nobelova cena za fyziologii a medicínu 2018 Objev inhibičních mechanismů imunitní odpovědi a jejich využití pro protinádorovou terapii Vlastnosti buněk v průběhu embryonálního vývoje Danio rerio Vlastnosti buněk v průběhu embryonálního vývoje Vlastnosti buněk v průběhu embryonálního vývoje Rychlé buněčné dělení Dynamické změny diferenciačního stavu (cell fate) Intenzivní migrace Změny tvaru a velikosti buňky Schopnost odpovědi na poškození celého embrya Klíčové molekulární komponenty vývoje Co poskytuje buňce tyto informace? a) signály z okolního prostředí b) transkripční program v jádře jednotlivé signální dráhy modulují transkripci a strukturu chromatinu transkripce určuje citlivost buňky k vnějším signálům (např. regulací exprese receptorů či komponent přenosu signálu) Hlavní signální dráhy důležité v embryonálním vývoji Transkripční faktory Klíčové molekulární komponenty vývoje TGF/BMP • TGF – transforming growth factor (transformující růstový faktor) • BMP – bone morphogenetic protein (kostní morfogenetický protein) • patří do TGF nadrodiny 1. TGF1-3 2. BMPs – 20 různých ligandů 3. GDF (growth differentiation factor): 9 ligandů 4. activin/inhibin/nodal TGF nadrodina má následující podrodiny: TGF beta nadrodina: Společným znakem je signalizace přes: - konzervativní rodinu Ser/Thr kinázových receptorů – jsou dvou typů a po vazbě ligandu dimerizují - cytoplazmatická signalizace přes tzv. SMAD proteiny Signální dráha BMP Inhibitory BMP faktorů • noggin • chordin (Chd) • sklerostin Přímá fyzická interakce mezi chordinem a BMP je podstatou inhibičního působení chordinu jsou klíčové pro fyziologické funkce BMP Role BMP inhibitorů v Spemannově organizátoru (Xenopus) • Spemannův organizátor u obojživelníků (= Hensenův nodus u ptáků) – organizační centrum, které umožňuje správný průběh gastrulace Klíčová role BMP inhibitorů produkovaných notochordem při indukci nervové ploténky notochord (= chorda) produkuje faktory, které specifikují ektoderm a vedou ke tvorbě nervové ploténky (neural plate). Jde zejména o následující faktory: noggin, chordin a follistatin (inhibitory BMP a aktivinu). Samotná produkce těchto BMP inhibitorů specifikuje anteriorní (přední) nervovou trubici, v kombinaci s FGF specifikuje posteriorní (zadní) nervovou trubici. Nodal a pravo-levá symetrie gastrulace u myši AVE – anterior visceral endooderm Nodal a pravo-levá symetrie Nodal a pravo-levá symetrie Analýza pomocí hybridizace in situ ukazuje rozdílnou expresi genů určujících levou stranu Vytváření levopravé asymetrie těla - role cilií • asymetrická exprese genů jako lefty1, lefty2, nodal a pitx2 • nodální cilie (9+0, dynein → pohyblivé) během gastrulace vytváří svým rotačním pohybem tzv. nodální proud Vytváření levopravé asymetrie těla role cilií • narušená funkce cilií → vzniká až situs inversus (vnitřní orgány uspořádány obráceně podle střední osy těla) nebo situs ambiguus Yokoyama, 2004 Nodal a pravo-levá symetrie Figure 2. Analysis of situs defects in Gdf1-/- mice. a, Gdf1 +/- and Gdf1 -/- newborn mice with stomachs (arrowheads) on the left and right sides, respectively. Ventral views of tissues from newborn Gdf1 +/- (b,d,f,h) and Gdf1 -/- (c,e,g,i) mice are shown. b,c, Reversal of the orientation of the abdominal organs in Gdf1 -/- mice. Note also the streak-like appearance of the spleen and the abnormally shaped medial lobe of the liver. H, heart; Lv, liver; St, stomach; Sp, spleen; AC, KIF3A/B knockout myši, iv mutanti (nodální proud není vytvářen → lefty exprimován bilaterálně) GDF8 (myostatin) – příklad tzv. master regulátoru konkrétní tkáně whippet Belgian blue Klíčové molekulární komponenty vývoje Notch • Notch=zářez – podle prvního fenotypu octomilky se zářezy na křídlech (T.H. Morgan, 1919) Transmembránové heterodimerické receptory Notch 1-4 Notch ligandy Jagged a Delta – jsou vázány na buněčný povrch Notch Notch dráha - overview • Vazba ligandu Notch receptor aktivuje dvě proteázy (enzymy specificky štěpící protein) • Proteázy jsou z rodiny ADAM a gamma-sekretáz • Štěpení Notch těmito proteázami uvolňuje tzv. NICD (Notch intracellular domain), který se uvolňuje a do cytoplazmy a následně přesouvá do jádra • NICD přímo interaguje s transkripčními faktory CBF1/Mastermind a spouší transkripci Notch a vznik asymetrie Asymmetric divisions segregating P granules into the founder cell of the C. elegans germ line. The micrographs in the upper row show the pattern of cell divisions, with cell nuclei stained blue with a DNAspecific fluorescent dye; below are the same cells stained with an antibody against P granules. These small granules (0.5–1 μm in diameter) are distributed randomly throughout the cytoplasm in the unfertilized egg (not shown). After fertilization, at each cell division up to the 16-cell stage, both they and the intracellular machinery that localizes them asymmetrically are segregated into a single daughter cell. (Courtesy of Susan Strome.) Model: První buněčná dělení na modelu háďátka (Caenorhabditis elegans) Notch a vznik asymetrie Notch a vznik asymetrie Notch a vznik asymetrie • legenda k obrázku: Asymmetric localization of polarity mediators and cell fate determinants in the early embryo. P granules: black discs; cytoplasmic POS-1, MEX-1, and cytoplasmic and nuclear PIE-1: blue; nuclear PAL-1: hatched; MEX-5 and MEX-3: peach; plasma membrane localized GLP-1: black; membrane localized APX-1: green; membrane localized MES-1: red. Although shown discreetly localized for simplicity, the cytoplasmic proteins are present at low levels in the opposite domain before division, and in the sister cell after division. In addition, MEX-5, MEX-3, MEX-1, POS-1 and PIE-1 are also present on P granules. (A) MEX-5, MEX -3, MEX-1, PIE-1, POS-1 and P granules are uniformly present in the cytoplasm just after fertilization, but become asymmetrically localized during the one-cell stage. (B) The anterior and posterior determinants are differentially segregated to AB and P1 as a result of the first asymmetric division. GLP-1 protein first appears in AB at the two-cell stage, and PIE-1 protein enters the nucleus in addition to being cytoplasmic. As the cell cycle proceeds (not shown), posterior determinants become restricted to the posterior half of P1, while MEX-5 appears in the anterior half of P1. (C) In the four-cell embryo, GLP-1 is expressed on membranes of both AB cells, but only ABp is in contact with the P2 cell expressing APX-1. MES-1 is enriched at the cell contact between P2 and EMS; MES-1/SRC-1 signaling in conjunction with Wnt signaling polarizes the EMS cell, such that it will divide asymmetrically. As the cell cycle proceeds, posterior determinants within P2 become asymmetrically localized as in previous P cells. MEX-5 disappears from the AB cells, but is still present in the anterior daughters of each P division. Notch a „segmentační“ hodiny Notch a „segmentační“ hodiny Notch Notch • legenda k obrázku: Klíčové molekulární komponenty vývoje Hedgehog dráha • hedgehog (Hh) u octomilky – název „ježek“ podle fenotypu larvy • u savců jsou tři homology: • sonic hedgehod (Shh) • indian hedgehog (Ihh) • desert hedgehog (Dhh) Sonic the Hedgehog Historie přichází do Brna už tento týden! The hedgehog gene (hh) was first identified in the fruitfly Drosophila melanogaster in the classic Heidelberg screens of Christiane Nüsslein-Volhard and Eric Wieschaus, as published in 1980. These screens, which led to them winning the Nobel Prize in 1995 along with developmental geneticist Edward B. Lewis, identified genes that control the segmentation pattern of the Drosophila embryos. Schéma Shh dráhy • Sonic hedgehog (SHH) je modifikován oxysterolem a pro sekreci vyžaduje protein Dispatched (Disp) • Shh váže Patched (PTCH), který je za normálních okolností inhibitorem Smoothened (SMO), po vazbě Shh je tato inhibice přerušena • Uvolnění SMO umožňuje aktivaci transkripčních faktorů z rodiny GLI, které se přesouvají do jádra a spouští transkripci • legenda k obrázku: Sonic hedgehog (SHH) is translated as a ~45kDa precursor and undergoes autocatalytic processing to produce an ~20kDa N-terminal signaling domain (referred to as SHH-N) and a ~25kDa C-terminal domain with no known signaling role (1 on figure 5). During the cleavage, a cholesterol molecule is added to the carboxyl end of the N-terminal domain, which is involved in trafficking, secretion and receptor interaction of the ligand. When SHH reaches its target cell, it binds to the Patched-1 (PTCH1) receptor(3). In the absence of ligand, PTCH1 inhibits Smoothened (SMO), a downstream protein in the pathway(4). It has been suggested that SMO is regulated by a small molecule, the cellular localisation of which is controlled by PTCH. PTCH1 has a sterol sensing domain (SSD), which has been shown to be essential for suppression of Smo activity. A current theory of how PTCH regulates SMO is by removing oxysterols from SMO. PTCH acts like a sterol pump and remove oxysterols that have been created by 7-dehydrocholesterol reductase. Upon binding of a Hh protein or a mutation in the SSD of PTCH the pump is turned off allowing oxysterols to accumulate around SMO.This accumulation of sterols allows SMO to become active or stay on the membrane for a longer period of time. The binding of SHH relieves SMO inhibition, leading to activation of the GLI transcription factors(5): the activators Gli1 and Gli2 and the repressor Gli3. The sequence of molecular events that connect SMO to GLIs is poorly understood. Activated GLI accumulates in the nucleus(6) and controls the transcription of hedgehog target genes(7). Schéma Shh dráhy Shh Shh = jeden z nejlépe popsaných klasických morfogenů (tzv. model francouzské vlajky) – v závislosti na koncentraci morfogenu se spouští odlišné transkripční programy Např. specifikace jednotlivých prstů končetiny Shh Např. specifikace jednotlivých prstů končetiny Shh malíčekpalec Shh Např. specifikace jednotlivých neuronálních typů ve vyvíjející se nervové trubici notochord – zdroj Shh floor plate – nejspodnější část nervové trubice ventralizující faktory produkované notochordem Sonic hedgehog (Shh) Inhibitory BMP (noggin, chordin) BMP Wnts Dorsalizující faktory floor plate – nejspodnější část nervové trubice Elektroporace kuřecí nervové trubice umožnila poznat jakým způsobem buňky během vývoje získávájí a udržují svou identitu Fig. A - A model for early spinal cord development. The neural tube which will form the spinal cord is patterned into specific domains by multiple external signals which include a ventralizing Sonic Hedgehog (Shh) signal from the notochord (N) and floor plate (F), a dorsalizing BMP signal from the roof plate (R), and retinoic acid (RA) signaling from the adjacent somites (S). Cross section of the spinal cord of an embryonic day three chicken embryo stained with fluorescent antibodies. Shown here in red is the motor neuron progenitor domain (pMN), one of many precise domains established by earlier signaling events. The pMN domain is here labelled through the use of antibodies specific for Olig2, a critical regulator of motor neuron formation. Developing motor neurons emerging from the pMN are shown labelled in green.Tom Jessell Přirozené inhibitory Shh dráhy cyclopamin – teratogenní alkaloid z kýchavice (Veratrum californicum), poprvé identifikován jako látku způsobující cyklopii (= 1 oko) a holoprosencephalii u ovcí Expression of Sonic hedgehog (Shh) protein and the determination of the midline structure in mouse embryo. An SEM micrograph of the frontal view of a mouse embryo (fetal age 7.75 days). Shh protein is green. The dotted line in the micrograph shows the region: Shh antibody reveals Shh. The part that will become the brain (head fold) is followed by the perchordal plate. Shh (in green) that is expressed in the prechordal plate induces midline structure formation. Model mice with Holoprosencephaly due to a Sonic Hedgehog (Shh) deficiency. An SEM micrograph of ten-day old mouse embryos (front view of face). The mouse deficient in Shh gene (right) has no midline structure and only one region (eye position shown in green). Note, too, the lack of nostril separation due to no midline structure. The normal embryo (left), by contrast, has both the eyes and nostrils separated to between the two hemispheres. Hedgehog (Hh) dráha je vázána na primární cilie • Abnormální Hh/Wnt a s nimi spojená onemocnění jsou způsobena defekty ve tvorbě primárních cilií (infertilita, polydaktylie, polycystické ledviny, degenerace retiny). • Hh je přímo vázán na primární cílie. Primary cilia vs. motile (secondary) cilia • struktura 9+2 • pohyblivé • epitely tracheje, vejcovodů, ependym… • struktura 9+0 • nepohyblivé • téměř všechny buňky (www.primary–cilium.co.uk) • solitérní PRIMÁRNÍ SEKUNDÁRNÍ Primární cilie - funkce • délka 2-10µm, průměr 0.25µm • chemo- a osmosenzory • fotoreceptory • mechanoreceptory • komunikace v extracelulární matrix • nodální cilie – pohyblivá – blastocysta – pravolevá souměrnost • model trandukce – receptory iontové kanály, efektorové proteiny, transkripční faktory Intraflagelární transport (IFT) • Poprvé popsali Kozminski et al. 1993 pomocí DIC mikroskopie • Za transport zodpovědný kinesin-II – transport k distálnímu „+“ konci a dynein zodpovědný za transport k „-“ konci. • Kif3A, Kif3B (podjednotky kinesinu) KO buňky netvoří cilie. • IFT je zodpovědný za regulaci signálních drah vázaných na primární cilie Primární cilie a Hh signalizace • Je spojen s primárními ciliemi • Ligand se naváže na patch (Ptc) protein, což způsobí zrušení inhibičního efektu Ptc na protein smoothened (Smo), který transdukuje signál přes glioma transkripční faktory (Gli) do jádra, kde řídí expresi Hh genů. (Gli1, Gli2 a Gli3A jsou aktivátory a Gli3R je represor). Hlavním represorem je SuFu. • IFT hraje klíčovou úlohu ve funkci regulace Hh signální dráhy (spojuje Smo a Gli) • Mutace Kif3A a Kif3B mají podobné fenotypy v důsledku ztráty cilie. Primární cilie a Hh signalizace Primární cilie a Hh signalizace: důkaz Wong et al., Nat. Med. 2009 Ker14-Cre: drives expression to the epidermis SmoM2 (cond): constitutively active Smoothened (activated by Cre) Kif3a Flox: following Cre leads to Kif3a deletion and primary cilia loss Basal cell carcinoma – způsobena aktivací Smoothened Primární cilie a Hh signalizace: důkaz control Shh active, cilia present Shh active, cilia absent Wong et al., Nat. Med. 2009 Ker14-Cre: drives expression to the epidermis SmoM2 (cond): constitutively active Smoothened (activated by Cre) Kif3a Flox: following Cre leads to Kif3a deletion and primary cilia loss Klíčové molekulární komponenty vývoje