doc. Mgr. Vítězslav Bryja, Ph.D. Buněčné systémy ve vývoji: Receptorové tyrosin kinázy, hypoxie a Wnt signální dráha Klíčové molekulární komponenty vývoje Transkripční faktory Klíčové molekulární komponenty vývoje Receptorové tyrosin kinázy (RTK) Receptorové tyrosin kinázy Hlavní skupíny receptorových tyrosin kináz 1. ligand se specificky váže na receptor 2. receptor dimerizuje 3. tyrosin-kinázové domény se navzájem fosforylují 4. autofosforylace vede k navázání (recruitment) adaptérových proteinů 5. V závislosti na receptoru se aktivují „downstream“ signální dráhy –např. Ras/Raf1/MEK/MAPK kinázová dráha, 6. která vede k buněčné odpovědi Adaptorové proteiny s SH2 doménou Doména SH2 rozpoznává fosfo-tyrosin Vybrané ligand:RTK receptorové systémy a jejich modelové funkce ve vývoji • VEGF/VEGFR • FGF • ephrin/Eph Vascular endothelial growth factors (VEGF) a jejich receptory (VEGFR) VEGF/VEGFR ve vývoji • reguluje vznik a vývoj cévní soustavy • master regulátor angiogeneze (vývoje cév) • hypoxie (=nedostatek kyslíku) indukuje HIF (hypoxia-induced factor), který reguluje produkci VEGF. • VEGF je schopen regulovat vznik de novo cév v hypoxické části embrya • - podobný mechanismus se uplatňuje i při onkogenezi, kde VEGF podporuje prokrvení nádorů a tím podporuje jejich růst Hypoxie a HIF • Hypoxie: snížený parciální tlak O2 ve tkáni x normoxie • HIF – Hypoxia-Inducible Factor: – Heterodimerický transkripční faktor aktivující geny obsahující v promotorové sekvenci HRE (Hypoxia response element), vlastní transkripce je iniciována pomocí koaktivátorů p300 a CBP (CREBbinding protein) – Prozatím je známo kolem 60 (100) genů regulovaných HIF, řada z nich reguluje odpověď na hypoxii (angiogeneze, proliferace, metabolismus glukózy, migrace, apoptóza, erytropoeza, metabolismus Fe) – Heterodimer sestává ze tří α podjednotek (HIF1α, 2α, 3α) a jedné podjednotky β (HIFβ=ARNT) – α podjednotky jsou při normoxii silně labilní, podjednoteka β je na koncentraci O2 nazávislá HIF při normoxii a hypoxii – význam hydroxylace prolinu http://www.chem.ox.ac.uk/oc/cjschofield/images/new-2.png VHL (von Hippel-Lindau) - tumor supresorový gen Modelové vývojové změny spojené s hypoxií/HIF systémem • embryonální vývoj • angiogenese • růst chrupavek • krvetvorba – aktivace EPO genu Angiogenese • Angiogenese – tvorba nových krevních cév • HIF se váže do oblasti promotoru a iniciuje transkripci receptoru VEGFR 2 i expresi VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor) – hlavní faktor angiogenese • v normálním vývoji ale i během nádorového růstu Jak rostou dlouhé kosti? - klíčová role chrupavky a růstové ploténky resting cartilage bone proliferating cartilage proliferating cartilage age resting cartilage FGF dráha na příkladu regulace růstu kostí růstová ploténka (growth plate) – zaniká v dospělosti Mutace v FGFR3 způsobují skeletální dysplázie Hypochondroplasia Achondroplasia SADDAN Thanatophoric Dysplasia STATURE AC TM TK I II III FGF binds here Achondroplasia healthy TD resting proliferating hypertrophic bone Růstová ploténka v detailu Erk MAP kinase activity is necessary for FGFR3 phenotype in cartilage FGFR3 Ras Raf-1 MEK Erk FRS2 FGF2 Inhibice proliferace chrupavky Eph/ephrin komplex • ephrin – jsou membránově vázané ligandy (podobně jako ligandy Notch dráhy) • ephriny A – na membráně upevněny pomocí tzv. GPI kotvy • ephriny B – transmembránové ligandy, které samy jsou schopny signálovat do buňky • Eph/ephrin systém je zapojen zejména do „navigace“ buněk (např. buněk cév) či jejich částí (např. navádění axonů v nervové soustavě), a do „contact-mediated cell sorting“ ve vyvíjejícím se embryu. Jde o obecný mechanismus regulující migraci buněk. Eph/ephrin komplex Jedinečná vlasnost ephrinů: reverse signalling – tj. nesignáluje jen receptor, ale i ligand Eph/ephrin komplex • legenda k obrázku: Eph/ephrin komplex Supporting Information Movie 2. Ephrin-B2 induces extremely rapid growth cone collapse and axon retraction in VT RGCs. Movie depicts VT growth cones treated with ephrinB2. Frames were captured at 30-second intervals for 45 minutes, replayed at 15 frames per second. 0.5 μg/ml pre-clustered ephrin-B2 was added after 15 minutes (2 second interval in movie). Supporting Information Movie 4. Inhibiting Rho kinase strongly diminishes axon retraction but does not affect growth cone collapse. Movie depicts VT growth cones pre-treated the Rho kinase inhibitor Y-27632 for 1 hour, followed by treatment with ephrin-B2. Frames were captured at 30-second intervals for 45 minutes, replayed at 15 frames per second. 0.5 μg/ml pre-clustered ephrin-B2 was added after 15 minutes (2 second interval in movie). videa z Petros et al., Dev. Neurobiol. 2010 Klíčové molekulární komponenty vývoje Wnt (Wingless/Int) - rodina ligandů - 19 genů pro proteiny Wnt u člověka a u myši - extracelulární proteiny modifikované glykosylací a palmitoylací - působí na krátké vzdálenosti, váží se k extracelulární matrix - pouze u mnohobuněčných živočichů kanonická dráha /závislá na β-kateninu/ (např. Wnt-1 or Wnt-3a) nekanonická dráha /na β-kateninu nezávislá/ (např. Wnt-5a) Wnt/β-kateninová dráha (= kanonická dráha) - indukuje duplikaci tělní osy u Xenopus - indukuje transformaci buněčné linie odvozené od lidských prsních epiteliálních buněk C57mg - signál přenášen přes translokaci -kateninu do jádra Speciální buněčný aparát pro sekrece Wnt proteinů Kanonická signální dráha Wnt Kanonická signální dráha Wnt - legenda k obrázku: Frizzled – klíčový receptor signálních drah Wnt Lrp5/6 – stěžejní ko-receptor kanonické signální dráhy Wnt Destrukční komplex pro beta-katenin Destrukční komplex A working model for the destruction complex. (1) Initially, the destruction complex contains Axin, GSK3, CK1 and APC (with the 15 aa and 20 aa repeat regions shown). The complex contains other components such as PP2A, which are not shown here. (2) Catenin enters the complex by binding Axin and potentially the APC 15 aa repeats. This positions the N-terminus of -catenin near CK1 and GSK3. (3) CK1 phosphorylates catenin at Ser45. (4) GSK3 phosphorylates -catenin at, successively, Thr41, Ser37 and Ser33. (5) The 20 aa repeats, particularly repeat 3, are phosphorylated by a CK1 (and possibly GSK3) which greatly increases their affinity for -catenin. The binding of a phosphorylated 20 aa repeat to -catenin displaces Axin from -catenin. (6) -TRCP1 binds the phosphorylated N-terminus of -catenin, causing the ubiquitination of -catenin by an E2 ligase. APC is then either desphosphorylated within the complex, allowing the ubiquitinated -catenin to leave the complex, or the ubiquitinated -catenin bound to APC leaves the complex and is separated from APC at the proteasome. The complex then returns to Step 1 - legenda k obrázku destrukčního komplexu: Kanonická signální Wnt dráha - video Beta-catenin se v buňkách vyskytuje ve dvou hlavních „poolech“ – biochemických komplexech 1. Jako součást Wnt signalizace 2. V komplexu s E-cadherin jako součást „adherens junctions“ Epithelio-mesenchymální transice a role βkateninu v tomto procesu Epiteliálně-mezenchymální tranzice (EMT) v nádorech Příklady vývojových procesů regulovaných kanonickou Wnt dráhou Příklady vývojových procesů regulovaných kanonickou Wnt dráhou Maternální Wnt/-kateninová dráha determinuje dorsální (horní) pól vyvíjející se zygoty a embrya u obojživelníků Maternální Wnt/β-cateninová dráha determinuje dorsální (horní) pól vyvíjející se zygoty a embrya Wnt/-cateninová dráha určuje anterioroposteriorní (AP, předo-zadní) osu těla během gastrulace – podporuje vznik zadních a blokuje vznik předních částí těla Wnt/β-cateninová dráha určuje zadní část embrya Uncx4.1/Mesogenin myší embryo po gastrulaci (E8.5): Cílové geny Wnt/-cateninové dráhy jsou exprimovány v zadní části těla. Deplece Wnt/β-kateninové dráhy při gastrulaci = ztráta zadních částí těla wild type Wnt-3a knockout Deplece inhibitorů Wnt/-kateninové dráhy při gastrulaci = ztráta předních částí těla wild type vs. Dkk1 knockout ... Wnt signální dráha určuje předozadní osu i při regeneraci u ploštěnky Příklady vývojových procesů regulovaných kanonickou Wnt dráhou Wnt/β-cateninová dráha reguluje vývoj neurální lišty (neural crest) Nervová lišta (neural crest) - populace buněk, vzniká z dorsální (= horní) strany nervové trubice procesem delaminace a migruje několika hlavními cestami do jiných částí embrya Co všechno z NC vzniká? - podíl na vzniku cca 40 různých tkání a orgánů Oblast trupu: • Neurony a gliální buňky senzorického, sympatického a parasympatického systému • Buňky dřeně nadledvin • Pigmentové buňky epidermis • Svalové buňky některých cév Vývoj neurální lišty: - neurální lišta je zdrojem periferního nervového systému, melanocytů, obličejových kostí a svalů, částí srdce a dalších Wnt-3a Co všechno z NC vzniká? Wnt1/3aDKO Nekanonická Wnt dráha - indukovaná např. ligandem Wnt5a - neindukuje duplikaci tělní osy u Xenopus - neindukuje transformaci buněčné linie odvozené od lidských prsních epiteliálních buněk C57mg - signál NENÍ přenášen přes translokaci -kateninu do jádra Wnts (Wingless/Int) Drosophila – planární buněčná polarita (planar cell polarity, PCP) Molekulární mechanismus ustavení PCP Seifert and Mlodzik, Nature Reviews in Genetics, 2007 Molekulární mechanismus ustavení PCP Seifert and Mlodzik, Nature Reviews in Genetics, 2007 Molekulární mechanismus ustavení PCP Seifert and Mlodzik, Nature Reviews in Genetics, 2007 - legenda k obrázku: Poruchy v nekanonické signální dráze Wnt u savců Poruchy v nekanonické signální dráze Wnt u savců Nekanonická dráha/dráha PCP: fenotypy u myši Orientace stereocilií vláskových buněk ve vnitřním uchu Actin Qian et al., 2007, Dev. Biol. Nekanonická dráha/dráha PCP při konvergentní extenzi u myši (a člověka) Konvergentní extenze – migrace buněk směrem ke středu těla – vede k prodlužování tělní osy Konvergentní extenze - video Důsledky narušené konvergentní extenze (CE) Důsledky narušené konvergentní extenze (CE) Exencefalie: Hamblet et al., 2002, Development Otevřená nervová trubice: