MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE PROKARYOT podzim 2018 KONJUGACE Ivana Mašlaňová iva.maslanova@gmail.com KONJUGACE Přenos DNA zprostředkovaný konjugativními plazmidy Pod pojmem konjugace rozumíme přenos DNA z donorové buňky do recipientní, k němuž dochází po jejich přímém kontaktu. Tento přenos je necitlivý k nukleázám. (Exkonjuganti - v rámci téhož druhu, transkonjuganti - v rámci různých druhů) Přenášené typy elementů (DNA): • Samopřenositelné (self-transmissible) plazmidy • Mobilizovatelné plazmidy • Chromozómová DNA • Konjugativní transpozony (+mobilizovatelné transpozony) transkonjugant (konjugant) KONJUGACE - HISTORIE 1947 - Joshua Lederberg, Edward Tatum - konjugace u E. coli, neznali přesnou podstatu konjugace bavlněná zátka tlak a podtlak U-trubice bakterie a b+ bakterie a+b tekuté médium s DNázou Filtrem nemohou procházet bakterie, ale viry a DNA ano Pokus s U-trubicí: důkaz, zda je pro přenos genů nutný kontakt buněk (Davies, 1950) Když se má v novém systému prokázat, že jde o konjugaci, musí se vyloučit alternativní způsoby přenosu, tj. transformace a transdukce. Pro vyloučení transformace se přidá DNáza, pro vyloučení transdukce se k recipientním buňkám přidá filtrát ze suspenze donorových buněk. Proces konjugace se liší u grampozitivních a gramnegativních bakterií. CHARAKTERISTICKÉ RYSY KONJUGACE 1. Jednosměrný přenos plazmidů, jednosměrný/obousměrný přenos chromozómových markerů 2. Je přenášen jen konjugativní plazmid, nebo dochází k mobilizaci dalších elementů (plazmidů, transpozonů, chromozomu) Výskyt konjugace u bakterií G- (enterobakterie) • prototypem je konjugace zprostředkovaná F-plazmidem • řada konjugativních R-plazmidů příbuzných F-plazmidu, mnoho jich má široké rozmezí hostitelů, např. RK2 (RP1, RP4) Další G-: Agrobacterium (Ti-plazmid), Pseudomonas G+ (enterokoky, stafylokoky, streptokoky, streptomycety) • prototypem je konjugace zprostředkovaná pADl • mnoho plazmidů má široké rozmezí hostitelů Konjugace u G- Nejvíce informací bylo získáno studiem přenosu F plazmidu a dalších plazmidů ze skupiny IncF u E. coli. Konjugace u konjugativních plazmidů je zprostředkována geny tra: • tvorba pilusů, na vnější straně buněk, nezbytné pro kontakt donorové a recipientní buňky. Pilusy: flexibilní (ohebné) a neohebné (tuhé) • plazmid tvoří flexibilní pilusy - používá se tekuté medium • neohebné pilusy - používá se pevný podklad • inkubaci přes noc - buňky smyty a přeneseny na selekční medium, kde vyrostou transkonjuganty (exkonjuganty). P donor F- recipient Conjugation F* donor Traniconjugant F* FUNKČNÍ OBLASTI F-PLAZMIDU SURFACE EXCLUSION ft SURFACE EXCLUSION .Q O > O oj pel us assembly 4— c re PILIN TRANSCRIPTľON FACTOR CONTROLLER OF tra J REPRESSION OF tra O TRANSER ORIGIN INSERTION AND EXCISION O CT Q) to to to ORIGIN OF VEGETATIVE REPLICATĚON F DNA REPLICATION INCOMPATIBILITY FinO imertionally inactivated \ IS 3a 3. RepFI - oblas replikace (3 oblasti) Tra> IfJaE Tr.r[ř 5rnE Tnpfl KepA2 TnpA i; R\A TnřůůO OfiT TraA- pilin TraQ- transport pilinu TraS, T - zábrana spojení F+ buněk (povrchové exkluze) TraN, G - stabilizace párů TraY, Z - zlom v oriT TraD - průchod DNA membránou donora Dtr component = DNA transfer and replication (relaxáza a primáza) Mpf component = „mating-pair formation" - většina genů orií ariV Samopřenositelné plasmidy vs. Mobilizovatelné plazmidy Table 5.1 Some F plasmid genes and sites Function Protein, site, or antisense RNA Vegetative replication Origin RepFIA/orfV site (RepCr RepE) Origin RepFIB/oriS site {RepB) Origin RepFIC/inactivated origin [RepA2r RepL, Inc (RNA), RepAl] Regulation of conjugation RnO, FinP (RNA), Tra| Mating pair formation {Mpf component) TraA, TraB, TraC, TraD, TraE, TTaF, TraG, TraH, TraK, TraL, TraN, TraP, Traa TraV, TraW, TraX DNA transfer and replication (Dtr component) onTsite, Tral., TraM, TraU, TraY Plasmid SOS inhibition PsiA, PsiB Surface exclusion TraS, TraT Plasmid partitioning SopA, SopB, sopC site Postsegregational killing SmC (RNA) and SrnB CcdA and CcdB FlmA, FlmC, FlmB(RNA) Exclusion of T7 PifA, PifB Transposon functions IS3a {YaaA, VaaB) Tn 1000 (TnpX, TnpR, TnpA) I Sib (YbfA, YbfB) \S2 (YbhB, YbiA, TbiB) Known function, but unknown relation to conjugation OmpP, Int, ResDr SsB F plazmid 3 počátky replikace: 1. or/V-theta replikace 2. oriS - není nutný pro životaschopnost, přerušen inzercá TnlOOO - stabilizace F plazmidu 3. oriT Oblast tra - dvě komponenty - Dtr a Mpf Dtr: geny pro přenos DNA a replikaci Mpf: geny pro velkou s membránou asociovanou strukturu - pilus TRANSFEROVÁ OBLAST F plazmidu Oblast obsahuje veškerou genetickou informaci nezbytnou pro přenos (33 kb). Asi 60 genů. Geny lze podle funkce rozdělit do 5 skupin: a. Biosyntéza a sestavování F pilusu (traA,B,C,E,F,G,H,L,K,Q,U,V,VV) b. Stabilizace párujících se buněk (traG,N) c. Konjugativní metabolismus (traD,l,M,Y,Z) d. Regulace přenosu (traJ,finO,finP) e. Povrchová exkluze (traS, traT) TraT = vnější membránový protein zabraňující stabilnímu spojení buněk obsahujících plazmidy TraS = protein vnitřní membrány zabraňující vstupu DNA do buňky při náhodném spojení buněk F+ Fenokopie F- = buňky F+, které neexprimují tra geny. Lze je připravit např. hladověním. PRŮBĚH PŘENOSU PLAZMIDOVÉ DNA PŘI KONJUGACI Stádia párování: 1. Donorová buňka naváže kontakt s recipientní pomocí pilusu 2. Následuje přibližování buněk depolymerizací pilusu (retrakce pilusu) 3. Probíhá syntéza plazmidové DNA - chromozom se nereplikuje 4. Dochází k aktivní disagregaci donorových a recipientních buněk Typická buňka F+ má asi 20 pilusu - kontakt jedné donorové buňky s několika recipientními._ PRŮBĚH KONJUGATIVNÍHO PŘENOSU DNA Dochází k jednořetězcovému zlomu v oriT v místě nic Odmotávání DNA ve směru 5 "^3' Přenos jednořetězcové DNA 5' koncem do recipienta V donorové buňce je doreplikován komplementární řetězec replikací otáčivou kružnicí V recipientu je komplementární řetězec dosyntetizován diskontinuálně Cirkularizace DNA v recipientu (v případě přenosu plazmidu) Typy pilusů u G- bakterií Rozlišují se flexibilní (ohebné, např. u F plazmidu) a neohebné (tuhé) pilusy (např. plazmid PKM101). Plazmid Collb-P9 - tvorba obou typů pilusů dle prostředí Tip TraN, TraG Stabilizace párování Tra A (pilin) TraB, TraK - tvoří pór, přichycený k membráně prostřednictvím TraV Lipopoly-saccharidei TraT, TraS Povrchová exkluze Inzerce pilinu do membrány, jeho acetylace 5'konec DNA vázán na ty rozin Tral (relaxáza) RELAXOZOM adp.p TraY, TraM, Tral, IHF el i kazová a relaxázová aktivita (hydrolýza ATP) adp + Pí Outer membrane Inner membrane ■C Pre pilin Sestavování pilu na povrchu buňky Propilin transportován do vnitřní membrány - LepB peptidáza - Pilin - tvorba Pilinového komplexu Dcnur Rccipi-:nl rjonorová buňka F+ recipients buňka F" 5CD Mating Pair Format on MPF structure-Formatbn ol mating pairs Coupling protein O F-pilusy donorové buňky F1 navozují kontakt s racipicntnimi buňkami F" a přitahují buňky k soba. Syntéiu konjugačního můstku řídi geny přítomné na F-faktoru, V poíátku replikace F-faktoru je jeden řetězec DMA štěpen. Helicasé Relaxase and heli-nsc make single-strand nick at cvíT Q Jadsn řetězec F-faktoru je mechanizmem otáfiejícl se kružnice přenášen do recipientni buňky. Během přenosu probíhá v obou buňkách 3 Relaxase and helicase translocated Id recipient oell with DNA Coupling protein pumps DHA out of donor cell; relaxase seals nick in recipient cell Donorová buňka vytváří pilus, kterým kontaktuje recipientni buňku. (povaha signálu není známa) Dochází k vytvoření póru mezi oběma buňkami Relaxáza aktivovaná „coupling" proteiny vytvoří zlom v oriT na DNA Relaxáza a DNA přecházejí do recipientni buňky, kde relaxáza cirkularizuje DNA Primáza (kódovaná plazmidem nebo chromozomem) zahájí syntézu komplementárního řetězce (tvorba RNA-primeru) Dochází k separaci donorové buňky a transkonjuganta Dcnur Transconjugant INTERAKCE MÍSTA NICS RELAXAZOU V MÍSTĚ oRiTplazmiduF Oblast oriT (373 bp) -/ AT+ n/C(iobp) í Rozpoznání místa nic relaxázou (místně specifická endonukleáza) ^ ^ Relaxozom DNA + mob-proteiny Relaxačn í kom plex OriT lze vložit do libovolného plazmidu, který je pak přenesen jako F PŮSOBENÍ RELAXÁZY PŘI PŘENOSU PLAZMIDŮ KONJUGACÍ Relapse Tyr-OH—■ Covalent bond between. re-laxast and DNA Relaxace o-p-o- Tyr LvrT Ree ipíent cell 3'oh Release t—j Donor cell Recipient cell Relaxáza vytvoří zlom v místě oriT, 5' fosfát je z DNA přenesen transesterifikační reakcí na -tyrozinový zbytek relaxázy TraM protein se váže na ss zlom a rozšíří mezeru na 200 bp ve směru 5-3. Na tuto mezeru se váže protein Tral (helikáza I), která vytváří další rozmotávání za spotřeby ATP. Tak se rozmotá asi 1200 bp. Jednořetězce jsou stabilizovány vazbou SSB proteinů Relaxáza vstupuje do recipientní buňky a vtahuje do ní i jednořetězcovou DNA od 5'konce (T-řetězec) Zpětnou transesterifikační reakcí je fosfát přenesen na 3'OH konec přenesené DNA, čímž se tato recirkularizuje a relaxáza se uvolní Donor Konjugativní přenos F relaxáza- multifunkční komplex T-řetězec ssb-proteiny Rezipient Donor conjugal DNA synthesis (DCDS) - náhradová syntéza DNA v donorové buňce mechanismem otáčející se kružnice Repliconation - syntéza komplementárního řetězce v recipientní buňce -diskontinuálnísyntéza Genetická regulace tra-operonu Je řízena dvěma regulačními okruhy: 1. Produkty genů finO a finP regulují expresi genu traJ negativně 2. Produkt genutraJ reguluje expresi genu traM a traYZ operonu pozitivně. U F plazmidu je gen finO inaktivován IS3a. Produkty genů finO a finP reprimují transkripci genů tra. Zatímco gen finO kóduje protein, exprimuje gen finP krátkou RNA (u F má délku 78 b). Gen finP leží v oblasti genu traJ, je však transkribován v opačné orientaci. Přesný mechanismus zábrany exprese troJ není dosud znám. Pravděpodobně finP-RNA zabraňuje transkripci nebo/a translaci genu troJ. Protein FinO působí buď společně s FinP-RNA, nebo nezávisle na ní. K represi jsou však zapotřebí v každém případě oba produkty. A Genetic organizatiori of íro region TraJ = transkripční aktivátor - protein nutný pro RNA syntézu mRNA -f tra>\ finů Anti^ensť RNA E Immediately after entry into coll A oriT ±0 Activates pnar ově vzniklý konjugant přenáší plazmid do dalších buněk s vysokou účinností Pili and transfer funclions I tráT tTflX C After plaamld establishment FinP blocks- translation: no Tra| Po ustavení plazmidu v buňce se exprimují všechny plazmidové geny plazmid se přenáší při nízké frekvenci a ci LTu.VÍ rfui traY F nP :irP FinO :inO s-jbilii€s FinP flnO = negativní regulátor — répresor íinP = negativní regulátor — ^nüsense RNA Í.' F = erd = derspr^?ed mutant pi^nsd Charakter buněk F-, F+ a Hfr buňkaF~ buňkaF+ začleněný F-faktor buňkaHfr autonomní chromozom F-faktor chromozom chromozom ZPŮSOBY ZAČLENĚNÍ F PLAZMIDU DO CHROMOZOMU integrace nezávislá na RecA transpozice F-Faktor ::" Chromosom Transposase I I IS Element ► ori^ V chromozomu přítomnost IS2 a IS3 elementů - možnost homologní rekombinace, frekvence integrace nebo excize 10-4 integrace závislá na RecA homologní rekombinace F-Faktor í- Chromosom RecA-Protein CD IS-Element ^ etiT v chromozomu se objeví nová IS Vznik kmenů Hfr začleněním F plazmidu do různých míst chromozomu E. coli. Začlenění probíhá v místech IS. a Hfr-KmenI Hfr-Kmen II Hfr-Kmen III' Hfr-Kmen IV Obr. 64. Mechanismus vzniku různých typů Hfr-kmenů (viz text) Vznik buňky Hfr (HfrH) začleněním F-plazmidu do chromozomu E. coli F+ = Leu+ StrS F- = Leu- StrR Rekombinanty = Leu+ StrR IZOLACE KMENU HFR 11 in n naredění, Leu+StrS il (háření suspenze buněk F+ UV světlem 2) Přeživšfbuňky půdu v takovén vyrostlo asi SOqkoloni * se vysejí na kompletní ředění, aby na plotně : ůdu se streptomycinem A) Kolonie buněk F+se prerazftkujf ' seňaočkuje čeř ;ivá kultura F"Leu"Strr na pfctnu s nárůstem buněk F" i i) Po 36 hodinách se obě plotny srovnávají Selektivní puda (Minimální půda + streptomycin) Kompletní puda Kolonie buněk Hfr Místa na minimální půdě vyznačující se hustým na'růstem představují rekombinanty Ley*Strr( které vznikly konjugací buněk F"$'buňkami Hfr přenese-'' nými na plotnu-razítkem Křížení kmene F+ a F- DONOR Suspenze buněk F+ ThrWBio"Mer$trs Konjugační směs RECIPIENT Suspenze buněk Thr"Leu"Bio+Met+Strr Ro2sev ha minimální Rozsev po 60 minutách Rozsev na minimální syntetickou půdu konjugace na minimální, syntetickou půdu se strepíomycinem syntetickou pudu se se streptomycinem streptomycinem 1 Kolonie řekombinantních transkonjuysntů Thr+Leu+Bio+Met+Strr Za vznik rekombinantu jsou zodpovědné buňky Hfr Křížení kmenů F+x F" buňky F •CD 1. V populaci buněk F+je nízká proporce buněk Hfr, v nichž je F plazmid začleněn do různých míst chromozomu 2. Volný F-plazmid se přenáší do F" buněk za vzniku buněk F+ 3. Z buněk Hfr se přenáší část chromozomu do F" buněk za vzniku rekombinant 4. Dochází k superinfekci rekombinant F plazmidem, v důsledku čehož výsledné rekombinanty obsahují F-plazmid Křížení přerušovanou konjugací 0 9 minu! po zahájení krížwii, 11 minut po lahájeni kříženi. O' 13 mitlu' P°zahájení kiiienl. Charakteristika přenosu: 1. Přenos začíná od oriT na F-plazmidu 2. Chromozomální geny jsou přenášeny v lineárním pořadí od oriT 3. Doba přenosu genů je úměrná jejich vzdálenosti od oriT 4. Pravděpodobnost přenosu genů klesá s jejich vzdáleností od oriT 5. Pravděpodobnost začlenění genů přenesených z donora do chromozomu recipienta je pro všechny přenesené geny stejná Q 25 minul po zahájení kitten I. přenosu rnarkeru dh přer^ ----n™rer!!?íjvaná k., (v: —, strS Po přenosu do recipientní buňky mají všechny geny stejnou pravděpodobnost začlenění do chromozomu (vyjma prvních 1-2') Geny thr a leu přenášené jako první (vysoká pravděpodobnost přenosu) Gen gal a další přenášené později (nízká pravděpodobnost přenosu) | Křivky vycházejí ze sledování průběhu konjugace v populaci gal leu thrl I Geny, které se nezačlení Četnost neselektovaných markerů u rekombinant thr+ strR při přerušované konjugaci jako funkce časového intervalu, v nemz bylo knzeni přerušeno shrnutí výsledků 100 CD . m + 80 60 40 20 azř ŕons • lac+ gaŕ ± 10 20 30 40 50 doba v minutách před přerušením křížení 60 (a) interpretace výsledků počátek přenosu azř tons 9 11 18 25 doba přenosu (minuty) (b) <5 - 90 3= 10 C3 / xyl písB malT str t 80 \ o \ 20 pyrD HfrGľl 1 70 ^ A V* \ x Hfr KL19 HlrB7] f 30 / / / pyrC c5> 60 40 \ 4 \ 50 ^ ár" S íl i'ľ Í a. Přenos genu probíhá v definovaném pořadí, může probíhat v obou směrech, a probíhá konstantnírychlostí45 kb/minutu. Celý chromozom E. co li se přenese za 100 minut. Sledování frekvence rekombinant při _použití různých kmenů Hfr_ Konkrétní přiklad nepřerušované konjugace Křížení: HfrH Leu'Pro+Lac+Gd+Trp+Stť x FLeuPro-LacGalTrp'Sty Selekce jednotlivých kategorií rekombinantů se provede na minimální půdě se streptomycinem a doplněné takto: Donorové a re-cipientní buňky se sm íchaj í, inkubují 60 minut a vysej í na plotny REKOMBINANH PŮda FREKVENCE REKOMBINANTŮ 1. TmrWař : + pro, glu, trp 2. Pro+Strr : + leu, glu, try 3. iMďWtäf : + leu, pro, lak, trp 4. GafStr" : + leu, pro,gal,trp 5. Tip^Str* : + leu, pro, glu 0,20 0,15 0,13 0,078 0,044 FREKVENCE REKOMBINANTŮ = počet rekombinantů daného typu počet buněk Hfr Odvozené pořadí genů na chromozomu kmene HfrH: O-Ieu-pro-lac-gal-trp Bakteriální chromo2óm f ReKombinace Excae Typu í F p'azfnid typ i F'plazmid Denafurace Renaíurace s F Mereroduplex se substiiucní smyčkou F plasmíd Excize iypuíl Vznik plazmidu F' typ I (IA n. IB) - plazmid obsahuje distální nebo proximální část bakteriálního chromozomu typ II - plazmid obsahuje proximální i distální část bakteriálního chromozomu Podíl chromozómové DNA v F'plazmidu může činit až 30% Beferoduplex s delecnf smyčkou Vznik plazmidů F' A B it C D Typ IA Typ IB TypII O IS-Element ► oriT TypIA ]| 11 TyplB Jf A l Typ 11 J B C v chromozomu zůstává část F plazmidu sfa = Sex factor affinity VZNIK F'PLAZMIDÜ HOMOLOGNÍ REKOMBINACÍ MEZI IDENTICKÝMI IS ELEMENTY E coli chromosome IS 7 \S2 V E. coli chromosome IS2 is; Různá konstituce a velikost F'plazmidö F' factor carrying chromosomal genes SELEKCE F'PLAZMIDU NA ZÁKLADĚ ČASNÉHO PŘENOSU pozdního MARKERU A. Kmen Hfr přenášející gen pro jako pozdní m arker. Při křížen í s kmenem F- bude gen pro přenášen zhruba po 60 m in utách. B. Vznik F'plazmidu se začleněným genem pro. Při křížení s kmenem F-bude F'pro přenesen během 5 minut. Výsledný zdánlivě rekombinantní kmen bude schopen gen pro dále přenášet při vysoké frekvenci Pro Parciální diploid Další možnost: použití recipienta recA" pparent recombinant Citliví k fágu M13 VZNIK DRUHOTNÝCH KMENŮ F' Prvotní kmen F' Přenos F'Iac do F- Přechod do stavu Hfr (vysoká frekvence) Chová se jako Hfr Druhotný kmen F' je diploidní pro HeterogenotF-iac/iac alelu přenesenou Intermediární donor F'plazmideľTI V recipientu dochází s vysokou frekvencí k začleňování F'Iac do chromozomu a nebo výměně alely nesené F' (pak záměna alel) Přenos chromozomu MOBILIZACE Clone pieces randomly into a ran mobilii able-cloning vBctor Donor R-::ipicni onT Transform inlo cells containing a setf-transmissible plasmid (Amp' Cam^V QO) Amp' Cam' Malewilh recipient; only orrT-oontaining plasmids are mobiliied (Cam' o c ic::L A"f' transoonjugants. Amp' O J O/iT ntifikace Části plazmidů klonovány do nepřenositelného vektoru s vhodným selekčním markerem (Amp). (1IH_) c 5el1-lransmissible plasm id encodes lne MpF system, including a coupling protein Coupling protein signals lo relaitase of mobilizabHe plasmid Nick made at oriTof mobilizable plasmid 3 Mobilizable plasmid transfened Donorová buňka obsahuje dva plazmidy. F plazmid s tra geny -kontakt a přenos; a mobilizovatelný plazmid (modře). mob geny - jednořetězový zlom v oriT Přenos obou plazmidů. Mobilizable plasmid is replicated in the recipient (O o) (o ) MOBILIZACE NEKONJUGATIVNÍCH PLAZMIDŮ DONACÍ Nedochází k fyzickému kontaktu plazmidů Col nic tra mob nic = bom basis of mobility 90% C01+/F+ 5% C0I+/F- Mobilizace prostřednictvím příbuzných plazmidů Delece ori T nic pBR322 > PBR327 Mobilizace plazmidů kondukcí -docházík fyzickému kontaktu obou plazmidů chromozom Přenos kointegrátu Kointegrát DONOR Tvorba konjugačního páru RECIPIENT Rozklad kointegrátu (pX obsahuje transpozon) •. ■; Dpnon ■■. . Recipient pX = plazmid nemobilizovatelný donací Salmonella: mají řadu svých plazmidů, často fin+. Po jejich odstranění se do salmonely vnesly F plazmidy. U 5. typhimurium se F včleňuje jen do jednoho místa (místo sfa, jehož původ není znám) Pseudomonas: divergentní skupina druhů a kmenů, má řadu konjugačních systémů, samopřenositelných nebo mobilizovatelných. Plazmid FP2 může mobilizovat chromozom v jednom směru z jediného chromozómového místa. Byly popsány jiné plazmidy, mobilizující od jiných míst. Mechanismus mobilizace není znám. KONJUGACE U G+ BAKTERIÍ Konjugační přenos je znám u mnoha rodů: Bacillus, Enterocococus, Lactococcus, Staphylococcus a Streptomyces. Podobně jako u G- bakterií mohou být plazmidy přenášeny i mezi rody a druhy. Plazmidy stejně jako u G- kódují vlastní relaxázu a oriT. Plazmidy kódují geny pro postsegregační usmrcování buněk a partitioning. Kódují virulentní determinanty a geny pro ATB rezistenci, obsahují transpozony. Poskytují selekční výhodu hostitelským buňkám. Hlavní rozdíl v Mpf systému (chybějící vnější membrána u G+). Recipientní buňky produkují feromonům podobné látky - kontakt s donorovou buňkou. FEROMONY = malé peptidy stimulující párování buněk, expresy tra genů Zisk plazmidu vede k zastavení exprese genů pro FEROMONY. ROLE FEROMONŮ V PŘENOSU PLAZMIDŮ C Donor-induced B Donor-unindu-ĽKl A. Feromony lokalizované na chromozomu recipienta. Pro-feromony ^ Feromony B. Plazmid donora exprimuje Tra A - represor tra genů kromě traC TraC - povrchový protein citlivý k feromonům Recplent cell C. Vazba feromonu na TraC -indukce -feromon se váže na represor Tra A A. Recipientní buňka tvoří feromony: geny pro feromony jsou umístěny na chromozomu. Feromony vznikají odštěpením signálních sekvencí z proferomonů (Pro-cADl) při jejich exportu z buňky. „Quorum sensing". Na povrchu se vytváří binding substance (BS). B. Donorová buňka: nese plazmid exprimující protein Tra A (represor), který reprimuje transkripci tra genů vyjma traC, který kóduje povrchový protein TraC (receptor) zachytávající feromon. C. Indukce párování. Feromon se váže na TraC na povrchu donora a vstupuje do buňky, kde se váže na represor TraA, tím jej inaktivuje a navozuje tvorbu TraE, který pak aktivuje expresi tra genů včetně genu asa kódujícího agregační substanci (Asa) Asa - faktor virulence D. Přenos plazmidu. Donorová a recipientní buňka navážou kontakt a plazmid se přenese za vzniku transkonjuganta. E. V recipientní buňce (transkonjugantu) se přestává vytvářet zralý feromon. Inhibitorový peptid iADl se váže na TraC a zabraňuje párování dvou donorových buněk. TraB je inhibitorový protein, který brání exkreci feromonu. Mechanismy zábrany příjmu homologního plazmidu: Tvorba povrchových proteinů -exkluze vstupu Tvorba peptidů (iADl) zabraňujících vazbě feromonu Tvorba proteinů (TraB) -zábrana úpravy proferomonů a jeho exkrece Model konjugativního přenosu plazmidů u Streptoocccus faecalis Enterococcus (Streptococcus) faecalis Donorová buňka cOB1 Vazebná substance ndhezin Vazba na recipientní buňku Geny kódující sex-feromony Regulátorový gen, jehož produkt inaktivuje endogen Regulátorovy gen, jehož produkt řídí tvorbu agregační substance >cAD1 f FEROMON Recipientní buňka Feromony = hydrofobní okta- nebo heptapeptidy odvozené úpravami signálních sekvencí Iipoproteinových prekurzorů (7-8 aa z C-konce) sex-feromony streptokoků Plazmid Velikost (kb) Feromon pADl 59,6 CAD1 pOQl 1 71 C081 PPD1 54 CPD1 pAMyl \ 60 cAH-yl pAtty2 ~ 60 cAH-y2 pAHy3 - 60 cAHy3 pAH373 36 CAH373 pCFlO 54 CCF10 * Jeden kmen může tvořit více druhů feromonů a získávat tak různé plazmidy. * Plazmidy nesou geny pro tvorbu virulenčních faktorů, bakteriocinů a rezistence k antibiotikům * Plazmidy mohou být přenášeny do jiných druhů bakterií (Staphylococcus) Struktura plazmidu pAD1 (-60 kb) 39.6/0 m 30 KONJUGACE U STREPTOMYCET B Development of a streptomycete colony including plasmid mediated conjugation. (A) Streptomycete spores. The chromosome is shown by gold lines. The chromosomes are linear, but the ends may be held together (see Box 1.1). The small dots indicate a conjugative plasmid such as the multicopy pl|101. (B) Germinating spore. Hyphae begin to form when spores germinate. (C) A growing colony. Growing branching hyphae form so-called "substrate" mycelia. Growing hyphae contain very few cross walls, and so chromosomes (not shown) are not separated into individual compartments. During the transition from panel B to panel C, hyphal fusions may have occurred, allowing an opportunity for recombination between chromosomes from different parents. (D) Sporulat-ing mycelia. The vertically directed "aerial" hyphae have differentiated, forming chains of spores. As shown in panel D', the spores are haploid. A small percentage of the genomes will be recombinant, composed of segments of the different parental chromosomes (recombinants not shown). SPECIFICKÉ RYSY KONJUGATIVNIHO PŘENOSU U STREPTOMYCET D Konjugace nevyžaduje plazmidově-kódované geny pro kontakt buněk (hyf) D Není známo, zda přenos plazmidů nebo chromozómové DNA vyžaduje jednořetězcový zlom, a zda se přenáší jednořetězec D Chromozomy se přenášejí obousměrně, aniž v nich je plazmid začleněn: není pozorován gradient přenosu chromozómových genů D Plazmid pIJlOl kóduje jen jeden Tra-protein, který asi napomáhá přenosu DNA mezi hyfy Po přenosu se plazmid velmi rychle v hyfech šíří. Letální zygoza - inhibice růstu recipientních buněk, do nichž byl konjugací přenesen plazmid - v okolí kolonie tvořené donorovou buňkou vznikají na nárůstu recipientních buněk poky (pocks) Závěry, které vyplynuly z prvních experimentů 1. Počet rekombinant přibývá s dobou trvání konjugace, lineárně až po dosažení vrcholu. 2. Různé markery jsou jsou přenášeny s různou frekvencí, když byly srovnány stejné doby trvání konjugace. Přenos z Hfr do F- probíhal řízeným způsobem (geny měly své přesné pořadí a přesný čas přenosu). Přenos chromozomu probíhal od pevného místa (ori) orientované. Závěr: pokud probíhá přenos chromozomu konstantní rychlostí, je doba přenosu genů úměrná vzdálenosti mezi nimi. To umožnilo použít minuty jako jednotky genové mapy.