MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE PROKARYOT podzim 2018 TRANSFORMACE Ivana Mašlaňová iva.maslanova@gmail.com Horizontální přenos genů v populaci bakterií A. TRANSFORMACE B. TRANSDUKCE C. KONJUGACE TRANSFORMACE = PŘÍJEM EXOGENNÍ DNA BAKTERIÁLNÍ BUŇKOU 1928: Griffith - Streptococcus pneumoniae Změny virulence nevirulentního kmene po přidání usmrcených buněk virulentního kmene. Avirulentní R typ – netvoří kapsuly Virulentní S typ – tvoří kapsuly Jednosměrný přenos virulentního faktoru z S na R buňky. 1944: Avery, MacLeod, McCarty Důkaz transformující aktivity DNA Streptococcus pneumoniae. Terminologie Transformace • u baktérií: příjem cizorodé exogenní DNA, změna vlastností • u eukaryot: nádorová transformace Transfekce • u bakterií: příjem volné fágové DNA • u eukaryot: příjem volné DNA, buněčné nebo virové HGT transformací – jak vnitrodruhová, tak mezidruhová (determinanty rezistence Neisserie); tvorba hybridních genů (mozaiky – homologní rekombinace) Úspěšnost transformace – ovlivněna aktivitou a. mismatch-reparačních systémů, b. restrikčně-modifikačními systémy, c. přítomností rozpoznávacích sekvencí na DNA; geny kódující tyto systémy = speciační geny (podíl na vzniku nových druhů) Jak odlišíte transformaci od konjugace nebo transdukce? Rozdíl ve schopnosti přirozeně navodit stav kompetence. U přirozené transformace rozdíly v příjmu chromozomové a plazmidové DNA. Přirozená transformace × umělá transformace Přirozená transformace - příklady Obecné rysy přirozené transformace Donorová buňka Transformující DNA (volná) Recipientníbuňka ve stavu kompetence Příjem DNA a její začlenění do genomu 1. Vazba dsDNA na povrch recipientní buňky 2. Pohyb DNA přes buněčnoustěnu a membránu 3. Degradace jednoho řetězce DNA 4. Translokace druhého řetězce DNA do cytoplasmy 5. Stabilnízačlenění jednořetězcového úseku do chromozomu homologní rekombinací (RecA+). Přenos DNA transformací je citlivý k nukleázám. Základní kroky při transformaci DONOR Transformující DNA ve volném stavu Kompetentní buňkyRECIPIENT Vazba dsDNA na povrch buňky Fáze eklipse Rezistence k DNáze Vstup DNA do buňky Začlenění DNA do genomu Exprese Homologní rekombinace Reparační procesy Restrikčně-modifikační systémy Charakteristika transformující DNA DNA: chromozomová, plazmidová, fágová (transfekce) • velikost: 0,5 kb až několikdesítek kbp (zhruba 5-10 genů) • dsDNA, nativní stav • konc. 1-10 mg DNA/ml kompetentních buněk • ze 100-200 molekulDNA se inkorporujejen jedna • u plazmidovéa fágové DNA je nutných 10 000 molekul Počet receptorů na povrchu buněk pro příjem DNA: S. pneumoniae: 80, B. subtilis: 50, H. influenzae: 5 KOMPETENCE • výsledek změn v buněčné stěně - syntéza specifických proteinů • závislost stavu kompetence na fázi růstového cyklu • závislost na hustotě buněk v populaci (tvorba feromonů - quorum sensing) • fyziologickéfaktory - ovlivnění složením media, teplotou a pH Kompetence - stav, kdy je daná bakterie schopna přijmout DNA molekuly z prostředí Přehled faktorů nebo růstových podmínek, které mají stimulační účinek na navození kompetence u S. pneumoniae (Sp), B. subtilis (Bs), H. influenzae (Hi) a V. cholera (Vc), u nichž je regaulace navození kompletence nejlépe prostudována. Nejčastějšími faktory jsou nedostatek živin (Bs, Hi and Vc) nebo jiné formy stresu (Sp). U Sp, Bs a Vc jsou používány systémy feromony zprostředkovaného quorum sensing, které zasjišťují, že kompetence je navozena při vysoké koncentraci buněk. Stav kompetence - STREPTOKOKY • vyžadováno kompletní medium • dochází k syntéze faktorů kompetence - asi 16 proteinů (bazické proteiny, nízká m.h., podobají se fágovým proteinům a reagují s receptory buněčné membrány pro příjem DNA) • mění se morfologie buněk - dlouhé řetízky • aktivují se autolyziny - částečná lyze buněčné stěny • stav kompetence trvá jen několikminut, ale šíří se v celé populaci • quorum-sensing: koordinovaná exprese genů podle aktuálního lokálního množství bakterií produkujících signální molekuly) – využitíreportérových genů Streptococcus pneumoniae NAVOZENÍ KOMPETENCE U B. SUBTILIS (G+) V populaci B. subtilis je kompetentních asi 10% buněk – bistable state • pozdní stacionární fáze – účast Mg++ k aktivaci specifických nukleáz (17 kD endonukleáza) • zpomalení syntézy DNA (jedna kopie chromozomu) • syntéza nových polypeptidů (analogy proteinů pro sporulaci, stres aj) • exprese genů pro reparaci DNA (SOB) • stav kompetence trvá několikhodin Využití reportérových genů NAVOZENÍ KOMPETENCE U H. INFLUENZAE (G-) • regulováno interně, ve vhodném mediu až 100% buněk ve stavu kompetence • tvorba transformazomů a specifických povrchových proteinů • blokáda buněčného dělení TRANSPORTNÍ A POMOCNÉ PROTEINY K překonání buněčné stěny (fyzikálnía elektrostatická bariéra) je vyžadovánznačný počet proteinů. Několik proteinů má klíčovouúlohu, ostatní jsou pomocné: A) PSCT proteiny: skupina proteinů úzcespjatá s povrchovými aktivitami: pilus, sekrece, kompetence a twitching (trhavý pohyb). Knokaut (Tn) těchto genů vede k dramatickému snížení transformovatelnosti. B) Dalšíproteiny patří mezi Com (Bs) a jsou analogickéu různých druhů: ComEA – vazbaa transport přes stěnu, ComG zvyšuje porozitu, a řada dalších interagujícíchproteinů např. Por (periplazmatický protein u Hi), který je esenciální pro přenos – asi zajišťuje optimálníterciární strukturu některého z faktorů kompetence. Dalšíproteiny fungují analogicky jako SSB proteiny. C) Nukleázy – U Bs a Sp – štěpí navázanou DNA, a nukleáza EndA u Sp štěpí pak jeden řetězec od 5´konce a ta vstupuje 3´koncem do cytoplazmy. D) SSB-proteiny – stabilizace ssDNA,vazba RecA Klíčové kroky transformace u G+ a G- bakterií I. G+ Tvorba pilusu (proteiny ComGC) – přichycení dsDNA, DNA receptor ComEA, transmembránový pór ComEC S. pneumoniae – endonukleáza EndA degraduje jeden z řetězců dsDNA; translokace ssDNA přes ComEC za pomoci ComFA (ATP dependentní) II. GN. gonorrhoeae – PilQ sekreční kanál umožňuje proniknutí dsDNA a PilE (pilus) přes vnější membránu, pro přijetí DNA do buňky ComGA, ComGB). ssDNA je vázána proteinem DprA (DNA processing protein A) Vyhledání homologních míst na chromozomu (RecA), homologní rekombinace. Nehomologní oblasti jsou methylovány a následně rozštěpeny (R-M systémy). Transformace u G+ bakterií B. subtilisG+ ComEA – proteinový receptor pro dsDNA ComG – analog proteinu PilE u Neisseria, pseudopilus EndA – endonukleáza, tvorba ssDNA u S. pneumoniae, u B. subtilis nebyl identifikován analog) ComEC – tvorba transmembránového tunelu pro ssDNA, vyžaduje ATP (ComFA – B. subtilis; PilT – Neisseria) Protein ComP (senzor) kontroluje koncentraci feromonu ComX, po jeho zachycení se sám fosforyluje a přenáší fosfát na ComA (protein- regulátor zprostředkující odpověď) – fosforylovaný CamA-P působí jako transkripční aktivátor několika genů zodpovědných za kompetenci Feromony pro kompetenci = malé peptidy sekretované buňkami, jejichž hladina odpovídá koncentraci buněk v populaci. Jsou vytvářeny jako prekurzory, jako hotové jsou uvolňovány do prostředí a nařeďovány, takže vysoké koncentrace je dosaženo pouze při vysokém počtu buněk. Regulace vývoje stavu kompetence pomocí quorum sensing u B. subtilis N. gonorrhoeaeGU G- musí hydrofilní DNA překonat hydrofóbní vnější membránu před vlastním vstupem do buňky přes cytoplazmatickou membránu. Systém na vnější membráně – 12-14 kopií sekrečních proteinů – PilQ (Neisseria) – přenos dsDNA; ComA – pro přenos ssDNA – degradace nukleázou = pilus systém IV; sekreční systém II. typu – význam v patogenitě Transformazomy – vezikuly vázající dsDNA, přeprava přes vnější membránu do buňky Transformace u G- bakterií Transformazom – povrchové struktury pro příjem DNA u G+ i G- bakterií TRANSFORMAZOMY U H. INFLUENZAE Počet sekvencí na chromozomu= 734+ a 731-; H. influenzae má 62% AT, takže by se statisticky očekávalojen 8 míst, a ne 1465 (sekvenceje bohatá na GC). 61% těchto sekvencíse nachází v ORF, každá zhruba na 1 248 bp. Specifickározpoznávací sekvence na DNA : AAGTGCGGTCA(USS =uptakesignal sequence; DUS= DNA uptakesequence; u N. gonorhoeae: GCCGTCTCAA) Metody studia kinetiky procesu transformace Stáří kultury Počet plak po infekci buněk fágovými částicemise během růstu kulturyvýrazně nemění Zvyšování počtu plak při stejné koncentraci fágové DNA indikuje stav kompetence. Odrážíomezený počet receptorů napovrchu buněk. Stanovení saturační koncentrace DNA Procesy po vstupu DNA do buňky • ssDNA – vysoká citlivost k degradaci, vazba SSB proteinů (DNA replikace) • ssDNA – substrát pro RecA protein – rekombinace transformované DNA • RecA – homologní rekombinace transformované ssDNA s host DNA • Délka ssDNA inkorporované do chromozomu cca 8,5 – 12 kb – ověřeno kotransformací genetických markerů Modely přirozené transformace a. Efektivita příjmu DNA b. Specifita příjmu DNA c. Genetický důkaz příjmu ssDNA Radioaktivně značená DNA Recipientní buňka Působení DNázy v různých časových intervalech Nanesení na filtr, promytí a stanovení radioaktivity DNA v buňkách – DNA, která nebyla přijata, je rozložena DNázou a prochází filtrem Stanovení účinnosti přijmu DNA při transformaci a. Efektivita příjmu DNA b. Specifita příjmu DNA – specifické sekvence pro příjem DNA u H. influenzae, N. gonorrhoeae 1. DNA Arg+ je přidána k recipientním buňkám ArgČasový interval I. 0 min Časový interval II. 2 min. Časový interval III. 15 min 2. V různých časových intervalech je přidána DNAáza DNA v buňce je jednořetězcová a nemůže se vázat na recipientní buňku DNA je začleněna do chromozomu a je dvouřetězcová DNA je extracelulární a je degradována Transformanty nevznikají Transformanty nevznikají Transformanty Arg+ vznikajíFáze eklipse = časový interval, kdynelze DNA z povrchu buněk odmýt ani ji v buňkách prokázat Genetický test pro ověření stavu DNA při transformaci 3. Extrakce DNA a její přidání k buňkám Argc. Genetický důkaz příjmu ssDNA konstantní poměr Denaturovaná DNA z brzlíku neovlivňuje příjem DNA (PenR), nativníDNA ano a snižujetak výslednýpočet transformantů. Experimentální stanovení způsobu začlenění exogenní DNA do genomu recipientní buňky Těsně vázané markery MaN m,n=citlivost kantibiotiku M, N=rezistence kantibiotiku Recipient Fenotypbudevždy N (alelaNnebudenahrazena) SelekcenaM Fragmenty DNA z donora Stejněčetné fenotypy (n aN) Donoro fenotypu Mn Experimentální důkaz začlenění jednořetězcového úseku donorové DNA do chromozomu recipientní buňky ultracentrifugace Úsek hybridní DNA „těžká „ DNA Sekvence s vysokým stupněm homologie Integrace transformující DNA do homologního regionu recipientní buňky a „mismatch repair“ přenášené alely: a. Zpárování homologních oblastí dvou DNA molekul b. Lokální odvinutí dvouvláknové DNA c. Naštěpení duplexní oblasti endonukleázou. d. Doplnění mezer polymerázou a spojení zlomů ligázou. e. Oprava „mismatch“ na druhém řetězci. mutantní vs. „wild-type“ fenotyp TRANSFORMACE DIMERNÍMI MOLEKULAMI PLAZMIDOVÉ DNA Mapování genů pomocí transformované DNA Dva geny se budou přenášet společně, pokud jsou tak blízkosebe, že mohoubýt na stejném fragmentu DNA = kotransformace Kotransformanty a+b+c+ nebo a+b-c+ nevznikají. Kotransformace genů a, b nebo c s genem x (na jednom fragmentu DNA) není možná= geny nejsou ve vazbě A B A A B A a B vázané A B B A a B nevázané Poklesfrekvencekotransformaceznaků A a B je v obou případech odlišný NaředěnífragmentůDNA sníží pravděpodobnost, žebuňkapřijme současněfragmentA i B. ZŘEĎOVACÍ TEST NA KOTRANSFORMACI Počet transfromant se znaky A a B se po naředění DNA sníží, ale oba znaky přenášeny se stejnou frekvencí. MAPOVÁNÍ GENŮ U B. SUBTILIS S VYUŽITÍM TRANSFORMACE Separace DNA ultracentrifugací v CsCl • replikovaná DNA je hybridní • posun markeru z lehké DNA na hybridní DNA odpovídá jeho vzdálenosti od ori BIOLOGICKÉ FUNKCE PŘÍJMU DNA 1. Regulace genové exprese Např. u neisserií: variace antigenních vlastností - Exprese pilinových genů je regulována intrachromozomovou rekombinací mezi rezidentními silentními pilinovými geny a pilinovým expresním lokusem nebo integrací silentního genu na vstupující donorové extrachromozomové DNA (po autolýze buněk) za tvorby intragenní minikazety. 2. Protekce buněk před bakteriofágy Různé kmeny S. pneumoniae mají RM systémy DpnI a DpnII kodované alternativními kazetami ve stejném lokusu na chromozomu. Oba systémy rozpoznávají stejnou cílovou sekvenci, která se však liší stavem metylace. Fágy propagované na jednom kmeni jsou restringovány na druhém a naopak. Transformací DNA z donorového kmene změní recipientní kmen díky homologní rekombinaci svůj RM systém. 3. DNA reparace Vstupující homologická DNA je použita pro rekombinační reparaci lézí na DNA přítomných na chromozomu recipienta. Transformace vede ke zvýšenému přežívání kompetentních (sexuálních) buněk ve srovnání s nekompetentními (asexuálními) buňkami po ozáření UV světlem. 4. Zdroj živin a energie (rozklad DNA extracelulárními nukleázami, příjem složek DNA, např. nukleotidů specifickými dráhami) – Rozklad jen jednoho řetězce. Interbacterial predation as a strategy for DNA acquisition in naturally competent bacteria Jan-Willem Veening and Melanie Blokesch 2017 Vibrio cholerae S. pneumoniae Stav kompetence a transformace DNA v laboratorních podmínkách UMĚLE NAVOZENÁ TRANSFORMACE A) Transformace u E. coli: Ovlivnění propustnosti buněčné stěny divalentními ionty (Ca, Mg, Rb) a dimetylsulfoxidem - změna integrity a organizace lipopolysacharidové vrstvy, vystavení buněk nízké teplotě, hladovění. Vstupující plazmidy zřejmě nejdříve interagují se specifickými kanály v povrchu stěny buněk (počet kanálů10 do 200). Teplotní šok 42- 45°C indukuje faktory zvyšující kompetenci. Přijímání DNA je neselektivní, do buněk mohou vstupovat i zcela nepříbuzné plazmidy. Účinnost transformace plazmidů je vysoká, chromozomové DNA nízká (mutace podjednotky D RecBCD-nukleázy zyvšuje účinnost příjmu lineární chromozomové dsDNA). Tato nukleáza degraduje lineární DNA od jejích konců. Alternativně lze použít „recombineering“, což jsou rekombinační systémy fágů. DNA se vnese do buněk exprimujících tento systém, jehož složkou je protein, který inhibuje RecBCD. B) Transformace zprostředkovaná PEGem. Postup pro G+, které nemají přirozenou kompetenci. Bakterie zbaveny enzymaticky peptidoglykanové vrstvy, přeneseny do osmoticky stabilního média, přídavek PEG – fúze membrán, precipitace DNA. Regenerace buněk. C) Elektroporace D) Biolistická metoda Přenos plazmidových vektorů do hostitelských buněk Transformace: • bakterie uvedeny do stavu kompetence (u E.coli působeních chloridu vápenatého za nízké teploty) • po přidání DNA a krátkém zahřátí na 42 oC) přechází transformující DNA do buněk Elektroporace: • buňky jsou vystaveny krátkému elektrickému impulsu o vysokém napětí – v buněčné stěně vznikají póry, kterými exogenní DNA vstupuje do buněk Transformace bakteriálních buněk • závislá na stavu kompetence buněk • u některých bakterií se stav kompetence objevuje přirozeně (S. pneumoniae) • u E.coli se připravuje uměle - promytím buněk ledovým CaCl2 - přidání DNA - mírný teplotní „šok“ (2 min, 42oC) - krátká inkubace v růstovém médiu (zotavení bakterií, exprese selekčního markeru) 46 Transformace tepelným šokem s využitím CaCl2 Transformace bakterií elektroporací • Promytí buněk vodou (odmytí elektrolytů z růstového média) • krátký elektrický puls o vysokém napětí • dočasné otvory v buněčném obalu • vstup DNA do buňky Transformace elektroporací Transfekce fágovou DNA Do buněk je přenášena fágová DNA nebo RNA Detekce úspěšné transfekce se provádí na nárůstu buněk citlivých k fágu, k nimž byly přidány transfekované buňky pokud došlo k transfekci, tyto buňky uvolňují fágové částice infikující buňky na misce. U určitých fágů transfekce nevede k reprodukci fágů, neboť k úspěšné reprodukci jsou zapotřebí některé proteiny přítomné uvnitř fágových kapsidů, které jsou při normální infekci injikovány spolu s DNA do cílových buněk: RNA-polymeráza pro transkripci fágových genů; RNA replikáza u RNA fágů.