P01
Mikroskopie a kultivace
v lékařské mikrobiologii
Testování citlivosti na
antibiotika
Diagnostika stafylokoků
Bi7170c (podzim 2018)
Osnova
● úvodní pokyny
● rod Staphylococcus
● diferenciální diagnostika rodu Staphylococcus
● praktické úkoly
– mikroskopie a kultivace
– dif. dg. rodu Staphylococcus
– Staphytest 16
– difúzní diskový test
2/60
Bezpečnost práce
v mikrobiologické laboratoři
● postudujte a podepište Provozní řád praktických cvičení
z lékařské mikrobiologie + První pomoc – předepsaný
postup při laboratorních nehodách
3/60
Úvodní pokyny
● šatní skříňky pro studenty jsou 1., 2. a 4. od okna
● nepoužívejte 3. skříňku, i kdyby byla otevřená
(skříňka studentů střední zdravotnické školy)
● klíče od šatních skříněk nechávejte vždy na háčcích
vedle dveří, visí zde i klíček od WC (vracejte na místo
po použití toalety)
● vstup studentů do prostor ústavu za praktikárnou
je zakázán
4/60
Nakládání s odpady
● malé kousky můžete dát do nádobek na svých stolech
● použité zápalky mají své vlastní misečky
● větší odpadky vyhazujte do koše vedle umyvadel
● rozbité sklo patří do žlutého kbelíčku vedle koše
● mikroskopické preparáty připravené přímo vámi
patří po použití do dezinfekce
5/60
Literatura
● protokoly k praktickým cvičením (IS MU) nutné!
● budete potřebovat Lékařskou mikrobiologii obecnou
(2005) a Lékařskou mikrobiologii speciální (2003)
● volitelně:
– Lékařská mikrobiologie
– vyšetřovací metody
– Klinická mikrobiologie
– Mimsova lékařská mikrobiologie
6/60Foto: archiv MÚ
Podmínky zápočtu
● účast v praktiku by měla být pokud možno
stoprocentní (možná jedna neomluvená absence,
další musí být omluvené)
● i přes absenci je nutné doplnit si příslušné
znalosti, vyplnit protokol a kontrolní otázky
● při více omluvených absencích vhodné praktikum
nahradit v jiné skupině (po předchozí domluvě
s daným vyučujícím)
● pro zápočet je také nutno mít vyplněny všechny
kontrolní otázky na IS MU
● zápočtový test (12 otázek, jedna správná odpověď,
alespoň 7/12 dobře)
7/60
Pokyny k vyplňování protokolů
● obrázky opravdu kreslete (nakreslete koky, nepište
„vidím koky“)
● obrázky kreslete barevně, noste pastelky (alespoň
červená a modrá)
● kreslete to, co vidíte (pokud se vám koky
v mikroskopu dotýkají, kreslete je tak, nekreslete jen
obrysy, ale probarvujte)
● pokud nevidíte to, co máte vidět, upozorněte
asistenta (!)
● protokoly jsou kontrolovány u zkoušky a mají vliv
na výslednou známku!
8/60
Přehled identifikačních metod
● přímé metody (mikrob, jeho část, produkty)
– mikroskopie (průkaz ve vzorku i identifikace)
– kultivace (průkaz + identifikace)
– biochemická identifikace (jen identifikace)
– průkaz antigenu (průkaz + identifikace)
– průkaz NK (průkaz ve vzorku)
– pokus na zvířeti (průkaz ve vzorku)
● nepřímé metody (průkaz protilátek)
9/60
Úkol 0a: Tekuté půdy
● pomnožovací:
– nejběžnější a univerzální
– bujón pro aerobní kultivaci a VL-bujón pro anaerobní
kultivaci (VL = viande-levure, obsahuje masokvasničný
extrakt)
● selektivně pomnožovací:
– pomnožení určité bakterie a potlačení množení jiných
– selenitový bujón pro salmonely
● obohacené pomnožovací:
– z kvalitnějších extraktů (např. BHI = mozkosrdcová
infuze), hydrolyzátů (kasein), vitamínů (kvasničný
hydrolyzát) atd. → pro náročnější bakterie (streptokoky,
hemofily, patogenní neisserie)
10/60
Úkol 0a: Pevné půdy
● základní:
– základem je masopeptonový bujon, NaCl a 1,5 %
agaru
– pro málo náročné bakterie
– obohacené: přidávají se další složky jako cukry,
růstové faktory, krev atp.
● diagnostické:
– přidání složek, které různě reagují na různé druhy
metabolismu
– krevní agar, půdy pro biochemické určení
mikrobů, půdy chromogenní a fluorescenční
11/60
Úkol 0a: Pevné půdy (2)
● selektivní:
– látky potlačující růst některých skupin mikrobů,
podporují růst cílových mikroorganismů
– KA s 10 % NaCl pro stafylokoky
– KA s amikacinem pro streptokoky a enterokoky
– KA s azidem sodným pro enterokoky
● selektivně diagnostické:
– kombinace dvou předchozích skupin
– ENDO – selektivní složka fuchsin, diagnostická složka
fuchsin odbarvený siřičitanem a laktóza)
– XLD, MAL – pro detekci salmonel
12/60
Úkol 0a: Půdy pro speciální účely
● MH agar (Müllerův-Hintonové agar):
– in vitro testování citlivosti na antimikrobiální látky
– slouží zároveň ke sledování pigmentů bakterií
– podobný MPA – místo peptonu (brání difuzi
antimikrobiálních látek) kaseinový hydrolyzát a škrob
(detoxikuje některé metabolity mikrobů)
● půdy pro sledování faktorů virulence:
– půda s kongočervení pro detekci stafylokokového biofilmu
– žloutková půda pro histotoxická klostridia
13/60
Úkol 0a: Půdy v klinické
mikrobiologii
14/60
Název Druh Barva Typ Bakterie
bujon tekuté půdy nažloutlá pomno-
žovací
aeroby
VL-bujon anaeroby
selenitový
bujon
selektivně
pomnož.
salmonely
Sabouraudův
agar
pevné půdy
ve
zkumavce
skoro
bezbarvá
selektivní* houby
Löwentein-
Jensen
bílá až velmi
světle
zelená
obohacená mykobakteria
(pův. TBC)
krevní agar pevné půdy
v misce
červená obohacená
diagnostická
většinu bakterií
Endova
půda
růžová selektivně
diagnostická
především
enterobakterie
*pokud je přidáno ATB
Název Druh Barva Typ Bakterie
MH pevné
půdy na
Petriho
miskách
skoro
bezbarvá
speciální atb citlivost
NaCl červená
-hnědá
selektivní stafylokoky
WCHA/VL-agar červená jako KA anaeroby
XLD (a blízký
MAL)
oranžová selektivně
diagnostická
salmonely
čokoládový
agar
hnědá obohacená hemofily,
neisserie
Hemofilový/
Levinthalův
agar
nažloutlá obohacená hemofily
Slanetz-Bartley světlounce
růžová
selektivně
diagnostická
enterokoky
Úkol 0a: Půdy v klinické
mikrobiologii (2)
15/60
Úkol 0b: Nativní preparát
● plastové zkumavky obsahují výtěry rozmíchané v
médiu
● kápněte na sklíčko, kapku překryjete krycím
sklíčkem a pozorujte epitelie, popř. leukocyty, a
mezi nimi mikroby
● výsledky zakreslete a popište
16/60
Úkol 0b: Ukázka nativního
preparátu C. A. T.
17/60
● epiteliální bb. s adherovanými bakteriálními buňkami (malé
tečky); pacientka s bakteriální vaginózou
Stafylokoky
● G+ koky, ve shlucích
(lat. staphyle – hrozen)
● fakultativně anaerobní,
nesporulujicí, nepohyblivé
● kataláza pozitivní,
oxidáza negativní
(kromě S. sciuri),
poměrně odolné proti
vyschnutí, vyšším
koncentracím solí
(diagnostický znak)
18/60
Stafylokoky (2)
● rozdělení podle schopnosti koagulovat plazmu:
– koaguláza pozitivní (S. aureus, S. intermedius)
– koaguláza negativní (S. epidermidis, S. hominis,
S. haemolyticus, S. saprophyticus)
19/60
Staphylococcus aureus
(zlatý stafylokok)
● významný koaguláza pozitivní stafylokok
● u třetiny lidí žije na kůži si sliznicích a nevyvolává potíže
(dokud není porušena obranyschopnost)
● charakteristickým rysem infekcí je tvorba
ohraničených zánětlivých ložisek (abscesů)
– absces = dutina plná hnisu (rozpadající se
leukocyty, bakterie), ohraničená stěnou z fibrinu a
fibroblastů, okolní tkáň je zanícená
– vznik pomocí plazmakoagulázy (volné i vázané, tzv.
clumping faktoru)
● široká škála faktorů virulence (koagulázy, kataláza,
hyaluronidáza, lipázy, nukleázy, ...)
20/60
Faktory virulence S. aureus
● ne všechny kmeny S. aureus disponují všemi faktory
virulence
21/60http://www.ratsteachmicro.com
Vznik abscesu
22/60autovaccine.de
Staphylococcus aureus (2)
● onemocnění:
– pyogenní: pyodermie (impetigo, folliculitis,
furunculus atd.), hnisání ran, abscesy vnitřních
orgánů, osteomyelitidy, bronchopneumonie,
endokarditidy, sepse, …
– infekce spojené s působením toxinů: exfoliativní
dermatitis (SSSS), syndrom toxického šoku,
enterokolitida
– intoxikace: stafylokoková enterotoxikóza
23/60
Staphylococcus aureus – bulózní
impetigo
● velké puchýře, které rychle praskají a zůstávají po nich
červená mokvající ložiska, nejčastěji na obličeji
● buly vznikají štěpením epidermis stafylokokovými
exotoxiny A a B – exfoliatiny (A a B) 24/60.adhb.govt.nz
Staphylococcus aureus – impetigo
25/60pathmicro.med.sc.edu
●
puchýře uložené v epidermis naplněné hnisem,
typicky u dětí
Staphylococcus aureus – otitis
externa s furunklem
26/60merck.com
Staphylococcus aureus – infekce
kůže s krustami
27/60.dermatology.co.uk
Staphylococcus aureus – mozkový
absces
28/60
Koaguláza negativní stafylokoky
● S. epidermidis, S. hominis, S. haemolyticus a asi
čtyřicet dalších druhů a poddruhů
● hlavní součástí běžné bakteriální mikroflóry kůže
● oportunní patogeny, možní původci močových infekcí
(hlavně S. saprophyticus), případně i infekcí ran,
katetrových sepsí aj.
● nález se hodnotí jinak např. ve výtěru v nosu či ve
stolici, jinak v moči a zcela jinak v hemokultuře
29/60
Staphylococcus epidermidis
● nejběžnější koaguláza negativní stafylokok
● oportunní patogen
– nejčastěji neutropenici, imunokompromitovaní (tj.
i novorozenci), intravenózní uživatelé drog (heroin)
– nemocní se zavedenými či implantovanými
pomůckami (intravenózní katetry, umělé srdeční
chlopně, shunty, kardiostimulátory, permanentní
močové katetry, kloubní protézy, šrouby, …)
→ tvorba biofilmových infekcí
● infekce krevního řečiště (bakteriémie), nejčastěji v
souvislosti se zavedenými intravenózními katetry
– může dojít ke katetrové sepsi s příznaky šoku
30/60
Diagnostika rodu Staphylococcus
● mikroskopie: G+ kok
● kultivace: na KA kolonie větší (1-3 mm), ploché,
máslovité konzistence, pigmentované (nejčastěji
bílé, krémové, zvláště po delší kultivaci žluté až
nazlátlé – hlavně u zlatého stafylokoka)
● biochemické testy: kataláza pozitivní, oxidáza
negativní, biochemicky lze rozlišit jednotlivé druhy
(např. STAPHYtest 16)
● antigenní analýza a speciální testy možné
31/60
Dg. rodu Staphylococcus (2)
32/60
Autor: Prof. MVDr. Boris Skalka, DrSc.
Diferenciální diagnostika
stafylokoků
● určení do rodu Staphylococcus:
– Gramovo barvení: rozlišení G+/G–, kok/tyčka
– kultivace na selektivní půdě (KA s 10 % NaCl, 6,5 %
NaCl se využívá pro kultivaci enterokoků)
– katalázový test pozitivní (prokázání enzymu
katalázy, 3% H2O2), oxidáza negativní
● rozlišení S. aureus od CoNS (koag. neg. stafylokoky)
– S. aureus má pozitivní koagulázu vázanou (clumping
factor) i volnou a hyaluronidázu
● další rozlišení v rámci rodu pomocí komerčních
testů (např. STAPHYtest 16 atd.)
33/60
Diferenciální diagnostika
stafylokoků (2)
● méně spolehlivá vodítka:
– CoNS produkuji je delta hemolyzin, zlatý stafylokok i
alfa a beta hemolyzin → S. aureus mívá výraznější
hemolýzu na KA
– S. aureus mívá větší průměr kolonií a nazlátlé
zbarvení (hlavně po delší kultivaci)
– S. aureus tvoří větší shluky v mikroskopii
34/60
Diferenciální diagnostika
stafylokoků (3)
35/60
Úkol 1: Mikroskopie infekčního
materiálu
● prohlédněte si mikroskopický preparát hemokultury,
obarvený podle Grama
● nezapomeňte přikápnout imerzní olej, použijte imerzní
objektiv 100×
● pátrejte po grampozitivních kocích ve shlucích a
také po erytrocytech, případně leukocytech
36/60
Foto: O. Z.
Úkol 2: Příprava fixovaného
preparátu, Gramovo barvení
● obarvěte podle Grama čisté kultury předložených
mikrobů, výsledky pozorování zakreslete a zapište
● Gramovo barvení:
– příprava: natřít, nechat uschnout, fixovat plamenem
– barvení: krystalová violeť 30 s, (voda), Lugolův
roztok 30 s, (voda), alkohol 15–20 s (do viditelného
výstupu barviva), voda, safranin 60 s, voda, osušit,
imerzní olej, imerzní objektiv zvětšující 100×
● tři kmeny budou G+ koky, jeden G– tyčka
37/60
Úkol 3: Růst na krevním agaru
● vyplňte tabulku na první straně v řádcích
„Úkol č. 3“
● do „jiných“ napište to zajímavé, co se nevejde jinam
● snažte si povšimnout rozdílů mezi koloniemi
G+ koků a G– tyčky (zvláště pak pigmenty,
konzistence, hemolýza apod.)
38/60
Úkol 4: Růst bakterií na krevním
agaru s 10 % NaCl
● selektivní půda pro stafylokoky
● zhodnoťte schopnost růstu předložených kmenů na
krevním agaru s 10 % NaCl
● zapište „+“ pokud kmen roste a „–“ pokud neroste
39/60
Úkol 5: Katalázový test
● prokažte přítomnost enzymu katalázy
● setřete kličkou kolonie předložených kmenů a vneste je
do kapky 3% H2O2 na podložním sklíčku
● zaznamenejte reakci u všech kmenů, do tabulky pište
„+“ a „–“
● nelze přeskočit předchozí kroky identifikace, pozitivní
katalázu má spousta bakterií, relativně průkazná je jen
tehdy, víme-li, že náš kmen je G+ kok
40/60
Úkol 6: Testy pro diferenciaci
S. aureus
● 6a) Test na clumping faktor (test vázané
plasmakoagulázy)
● 6b) Plasmakoagulázový test (test volné
plasmakoagulázy)
● 6c) Detekce hyaluronidázy
41/60
Úkol 6a: Test na clumping faktor
(test vázané plasmakoagulázy)
● kolonie se vmíchají do kapky králičí plasmy na
podložním sklíčku
● pozitivita se projeví jako tvorba sraženin či vloček
v kapce plasmy (viz obrázek na další obrazovce)
● nejde vlastně o koagulaci, ale o aglutinaci plasmy
● test není příliš spolehlivý
42/60
43/60
memiserf.medmikro.ruhr-uni-bochum.de
Úkol 6b: Plasmakoagulázový test
(test volné plasmakoagulázy)
● klasický test pro odlišení zlatého stafylokoka (koaguláza
pozitivního stafylokoka)
● kličkou nabrané kolonie vmícháme do králičí
plasmy ve zkumavce
● pokud plasma koaguluje (má konzistenci želé), je
kmen koaguláza pozitivní
● dejte pozor při zakreslování
do protokolu (volná hladina
vs. koagulovaná plazma)
44/60microbiology.scu.edu.tw
Úkol 6c: Detekce hyaluronidázy
● hyaluronidáza produkovaná zlatým stafylokokem
(ne však koaguláza negativními stafylokoky) rozpouští
pouzdro (kapsulu) opouzdřených bakterií
● používá se druh Streptococcus equii, pro člověka
nepatogenní
● ztráta pouzdra se projeví změnou vzhledu streptokoka
(ztráta mukózního vzhledu v blízkosti S. aureus)
● velmi levný a spolehlivý test (na rozdíl od clumping
faktoru)
● najděte pozitivní kmen, který ve svém okolí
rozpustil slizový obal streptokoka
45/60
Úkol 6c: Detekce hyaluronidázy (2)
46/60
Úkol 6c: Detekce hyaluronidázy (3)
47/60
Úkol 6: Komerční testy
● v praktiku je neprovádíme z důvodu finanční náročnosti
● provedením připomínají clumping factor
● jsou spolehlivější než volná koaguláza
48/60www.microbes-edu.org
Úkol 6: Komerční testy (Staphaurex)
49/60www.microbes-edu.orghttp://www.pathologyinpractice.com
Úkol 7: Bližší určení stafylokoků
pomocí biochemického mikrotestu
(STAPHYtest 16)
● za normálních okolností zlaté stafylokoky
STHAPHYtestem neurčujeme, stačí nám testy z úkolů
6a, b a c, popřípadě komerční testy
● test tedy slouží k diagnostice koaguláza
negativních stafylokoků
50/60
Úkol 7: Bližší určení stafylokoků
pomocí biochemického mikrotestu
(STAPHYtest 16) (2)
● STAPHYtest 16, zahrnuje ve skutečnosti 17 reakcí
● jako první se odečítá test VPT ve zkumavce,
červená tekutina ve zkumavce = pozitivní VPT,
bezbarvá tekutina = negativní
● první řádek STAPHYtestu = 2. – 9. reakce
● druhý řádek STAPHYtestu = 10. – 17. reakce
● vypočítejte kód a porovnejte s kódovníkem
● kód je šestimístný (prvních pět číslic je ze trojic testů,
šestá číslice je z dvojice)
51/60
Úkol 7: Bližší určení stafylokoků
pomocí biochemického mikrotestu
(STAPHYtest 16) (3)
● 1. kmen: 703 651 = S. aureus, 99,8 %, Tin=1,00
52/60
Úkol 7: Bližší určení stafylokoků
pomocí biochemického mikrotestu
(STAPHYtest 16) (4)
● 2. kmen 703 241 = S. epidermidis, 97,95 %,Tin=1,00
53/60
Testování citlivosti na ATB
● diagnostiku uzavírá testování citlivosti na antibiotika,
zpravidla difusním diskovým testem
● konkrétní provedení může být různé
54/60
kvalitativní testy
kvantitativní testy
ATB terapie
● u stafylokoků je lékem volby oxacilin
● u močových infekcí cefalosporiny první generace
● makrolidy jen u alergických osob
● linkosamidy mají význam u infekcí pohybové soustavy
(dobrý průnik do kostní dřeně)
● aminoglykosidy raději jen v kombinaci
● glykopeptidová antibiotika (vankomycin a
teikoplanin) jsou rezervní
– u kmenů rezistentních na oxacilin, takzvaných MRSA
a MRSKN
– v případě rezistence nebo přílišné toxicity, lze také
použít linezolid a další nové látky
55/60
Detekce MRSA
● meticilin rezistentní stafylokoky (MRSA) jsou
epidemiologicky závažné kmeny, často způsobující
nozokomiální infekce
● příčinou je změna tzv. penicillin binding proteins (PBP)
– transpeptidázy účastnící se výstavby buněčné stěny
– kódovány genem mecA (PBP2a)
– beta-laktamy inhibují jejich účinek
● na problém upozorní malá zóna u oxacilinu (může být
způsobena i jinými vlivy)
● za průkazné se považuje, je-li malá zóna nejen u
oxacilinu, ale i u cefoxitinu
● speciální kultivační půdy
56/60
Úkol 8a: Citlivost stafylokoků k
antibiotikům
● odečtěte difusní diskový test – změřte zóny a
porovnejte s referenčními zónami
● máte k dispozici šestici antibiotik (FOX = cefoxitin, DA =
klindmycin, E = erythromycin, SXT = ko-trimoxazol, TE
= tetracyklin, C = chloramfenikol; v praxi se používají
dvě šestice, označované S1 a S2, my máme test S1)
● každý set je proveden na kmen STKN (koaguláza
negativního stafylokoka) a STAU (zlatého stafylokoka).
57/60
Úkol 8a: Citlivost stafylokoků k
antibiotikům – zóny citlivosti
58/60
Antibiotikum Zkr. „C“ je-li ≥
než (mm)
„I“ je-li
mezi
(mm)
„R“ je-li <
než (mm)
Cefoxitin (cefalosporin);
interpretace: oxacilin a další
CXT ≥
22/25*
22/25*
*
Erythromycin (macrolid) E ≥ 21 18–20 < 18
Clindamycin
(linkosamid)
DA ≥ 22 19–21 < 19
Ko-trimoxazol (směs) SXT ≥ 17 15–16 < 15
Tetracyklin (tetracyklin) TE ≥ 22 19–21 < 19
Chloramphenikol C ≥ 18 < 18
*CXT: 22 mm S. aureus, 25 mm koagulázanegativní stafylokoky
Úkol 8b: Demonstrace
screeningové půdy na MRSA
● máte několik kmenů na speciální screeningové půdě pro
MRSA (opakování z jarního semestru)
● modré kolonie jsou kolonie kmenů MRSA
● jiné (růžové či bílé kolonie) jsou methicilin rezistentní
kolonie jiných stafylokoků, než je S. aureus
● žádné kolonie znamenají, že jde o methicilin-citlivý
kmen
59/60
Po tomto cvičení byste měli umět:
● použít mikroskopii naivního a fixovaného preparátu
barveného Gramovým barvením v diagnostice
● vhodně použít různé kultivační půdy pro diagnostiku
mikroorganismů
● popsat základní vlastnosti rodu Staphylococcus
● jmenovat nejdůležitější druhy rodu, včetně nejčastějších
infekcí, které způsobují
● popsat diagnostický proces, který vede k určení izolátů
až na úroveň druhu
● popsat vztah virulenčních faktorů stafylokoků a nemocí,
popř. průběhu nemocí (např. vztah koagulázy a abscesů
atp.) a využití těchto vlastností při diagnostice
60/60