P07b
Diagnostika anaerobních
bakterií
Bi7170c (podzim 2018)
Osnova
● rod Clostridium
● přehled nejběžnějších druhů nesporulujících
anaerobů
● diagnostika anaerobů
● anaerobióza
● úkoly
2/41
Rod Clostridium
● G+ tyčky, anaerobní, spóry (oválné či kulaté
endospory vyklenující buňku)
● kvůli správné funkci některých enzymů vyžadují k růstu
nižší redoxní potenciál (snížení cysteinem,
thioglykolátem apod.)
● některé druhy tolerují malá množství kyslíku
(enzymy superoxiddismutáza, peroxidáza, kalatáza)
● saprofyté v půdě (hnilobné procesy) a ve vodě,
součástí normální mikroflóry člověka i živočichů
● k rozšíření napomáhá tvorba vysoce odolných
endospor (přitomny v půdě, vodě, prachu →
kontaminace potravin)
● čím kratší inkubační doba, tím horší prognóza 3/41
Clostridium tetani
● G+ tyčka, anaerobní, rovné,
štíhlé, terminální endospora
(„paličky na buben“)
● saprofyt savců (zejména koní)
● původce tetanu (vstupní branou obvykle hlubší
znečištěné rány, méně často popáleniny, vředy apod.)
● pro klíčení spor nutné anaerobní prostředí (zhmožděné
a ischemické okolí rány, hnisavé procesy, cizí těleso v ráně)
● za projevy infekce zodpovědný tetanický toxin
● závažnost klinických projevů závislá na množství
produkovaného neurotoxinu
● očkování součástí hexavakcíny, přeočkování jednou za
10 – 15 let
4/41
Clostridium tetani (2)
● tetanus – patofyziologie:
– tetanospasmin proniká do neuronu → poškození
exkrečního aparátu neuronů → zábrana
uvolňování inhibičních mediátorů (GABA, glycin) →
zablokována normální inhibice motorických neuronů →
snížení prahu dráždivosti motorických neuronů →
tonické křeče příčně pruhovaného svalstva
● tetanus – klinické příznaky:
– tonické křeče (při plném vědomí) žvýkacích svalů
(trismus), mimických svalů (risus sardonicus), svalů
laryngu a krku, svalů trupu (opistothonus),
dýchacích svalů (vede k udušení)
– zvýšené pocení a teplota, komplikace (zlomeniny, ...)
5/41
Clostridium tetani (3)
6/41
Clostridium botulinum
● G+ tyčka, anaerobní, rovné,
velké, oválná subterminální
endospora
● komenzál ve střevech zvířat → ve vodě, půdě, …
● tvoří botulotoxin → otravy potravinami
kontaminovanými sporami (nedostatečně
sterilizované masové a zeleninové konzervy; 100 °C 10–
15 minut)
● botulotoxin je endopeptidáza → hydrolýza proteinů
zodpovědných za transport vezikul s
acetylcholinem → inhibice uvolňování acetylcholinu
→ paralýza příčně pruhovaných svalů
● využití v kosmetice (botox)
7/41
Clostridium botulinum (2)
8/41
Clostridium botulinum (3)
9/41
Clostridium botulinum (4)
● formy botulismu:
– alimentární botulismus:
● požití toxinu v potravě (mikrob samotný není
v těle přítomen)
● nevolnost, zvracení, bolesti břicha, pokles očního
víčka (ptóza), rozšíření zornic (mydriáza), ztížené
polykání, zácpa, zástava močení, symetrické
sestupné paralýzy, ochrnutí dýchacích svalů
● vědomí a citlivost zůstávají nezměněny
– traumatický botulismus (infekce rány)
– kojenecký botulismus (toxin produkován přímo ve
střevě dítěte)
10/41
Klostridia anaerobních traumatóz
● C. perfringens, C. septicum, C. novyi
● různé klinické projevy (typicky inkefce měkkých
tkání – kůže, podkoží, svaly) od kontaminace ran,
přes hnisavě-nekrotické procesy s lokálním účinkem
toxinů po plynatou sněť (vysoce invazivní nekrotické
procesy s celkovou intoxikací)
● některé kmeny způsobují svými toxiny nekrotizující
enterokolitidy
● celková stabilizace pacienta, chirurgické ošetření
ran, ATB, léčba kyslíkem v hyperbarické komoře
11/41
Plynatá sněť
12/41
Clostridium difficile
● přítomno ve střevech (5 % zdravých dospělých, více u
dělí a kojenců)
● způsobuje lehčí průjmy, ale i pseudomembranózní
kolitidu
● onemocnění často nozokomiálního původu (po
podání antibiotik)
– především klindamycin, širokospektré peniciliny
(amoxicilin+klavulanát) a cefalosporiny (cefoxitin)
– tato ATB eliminují normální střevní mikroflóru →
přemnožení C. difficile (rezistentní)
– léčba metronidazol, vankomycin per os, fekální
transplantace (FMT – fecal microbiota transplantation)
13/41
Clostridium difficile (2)
14/41
Clostridium difficile (3)
15/41
Přehled klostridií
16/41
C. tetani původce tetanu
C. botulinum producent botulotoxinu
C. perfringens,
C. septicum, C. novyi, aj.
klostridia plynatých snětí
(+ enteropatogenita)
C. difficile enteropatogenní
Přehled nejběžnějších druhů
nesporulujících anaerobů
● text
17/41
Koky Tyčky
G+ Peptococcus
Peptostreptococcus
Propionibacterium***
Eubacterium
G– Veillonella Fusobacterium, Leptotrichia*
Bacteroides, Prevotella,
Porphyromonas**
* tyčky se zašpičatělými konci
** tyčky s rovnými konci
*** není obligátní anaerob
Nesporulující anaerobní G+ koky
● rody Peptococcus a Peptostreptococcus
– běžná mikroflóra GIT a vaginy → infekce
endogenního původu
– zánětlivé procesy v malé pánvi (poporodní
endometritidy, …), periodontitidy, abscesy
(peritonsilární, plicní, ...), sinusitidy, otitidy,
peritonitidy při proniknutí střevního obsahu do dutiny
břišní
18/41
Nesporulující anaerobní G+ tyčky
● rod Propionibacterium
– tyčky kyjovitého tvaru morfologicky podobné rodu
Corynebacterium
– běžná mikroflóra dutiny ústní, GIT, urogen. traktu
– nejvýznamnější Propionibacterium acnes
– produkuje lipázy → vznik a rozvoj akné
– izolován i z hemokultur při endokarditidách a sepsích
● rod Eubacterium
– běžná mikroflóra dutiny ústní, GIT, urogen. traktu
– bakteriální vaginózy, smíšené anaerobní infekce
19/41
Nesporulující anaerobní G– koky
● rod Veillonella
– běžná mikroflóra flóru dutiny ústní (součást
zubního plaku), nosohltanu, GIT a urogen. traktu
– smíšené anaerobní infekce (zejména) ústní dutiny,
výjimečně meningitidy, osteomyelitidy
– Veillonella parvula původcem endokarditidy či
sepse
20/41
Nesporulující anaerobní G– tyčky
● běžná mikroflóra lidského těla (dutina ústní,
nosohltan, GIT, urogen. trakt)
● značně pleomorfní (obyčejně tyčky, ale i koky nebo
vlákna), netvoří spóry, pestrá biochemická aktivita
→ využití v diagnostice
● původci infekcí endogenního původu
● terapie ATB (klindamycin, linkomycin, metronidazol,
chloramfenikol, peniciliny s inhibitory beta-laktamáz)
většinou v kombinaci s chirurgickým výkonem
21/41
Nesporulující anaerobní G– tyčky (2)
● rod Bacteroides
– nejčastěji izolované z infekcí (dutina břišní, malá
pánev, vagina, dutina ústní, …)
– Bacteroides fragilis
● rod Porphyromonas
– infekce dutiny ústní (gingivitidy, gingivostomatitidy)
a urogenitálního traktu
– Porphyromonas gingivalis
● rod Prevotella
– infekce HCD (anginy, sinusitidy)
– Prevotella melaninogenica
22/41
Nesporulující anaerobní G– tyčky (3)
● rod Fusobacterium
– polymorfní, až vřetenovitý tvar
– infekce chirurgických a traumatických ran, komplikují
rány po kousnutí zvířetem, směsné kultury při
pneumonii, hrudním empyému, intraabdominální
infekci a abscesech
– Fusobacterium nucleatum (součást zubního plaku)
– Fusobacterium necrophorum (nekrotizující tonsilitida)
● rod Leptotrichia
– součást ústní mikroflóry
– Leptotrichia buccalis (orodentální infekce)
23/41
„Veillonova flóra“
● název pro skupinu anaerobních G+ a G–
nesporulujících bakterií kolonizujících kůži a
sliznice člověka
● není možné jednoznačně označit hlavního původce
onemocnění
● za původce onemocnění se pokládají rovnoměrně
všechny bakterie, kterých bývá izolován větší počet →
za etiologického původce se pokládá celá tzv. Veillonova
flóra
● součástí např. rody Peptococcus, Peptostreptococcus,
Veillonella, Eubacterium, Propionibacterium,
Fusobacterium , Bacteroides, ...
24/41
Lactobacillus acidophilus
● nejvýznamnější zástupce rodu („Döderleinův bacil“)
● G+ tyčky, často v řetízcích, mikroaerofilní (ne
anaerobní, nicméně rostou v nedokonalé anaerobióze
běžných anaerostatů)
● běžná mikroflóra dutiny ústní, GIT, vaginy
● laktobacily utilizují sacharidy na laktát → snížení
pH → zastavuje množení hnilobných bakterií
(využití i v potravinářství)
● utilizace glykogenu (z rozpadajících se epitelií) ve
vagině → snížení pH brání usídlení patogenů
● může způsobovat endokarditidy, novorozenecké
meningitidy, endometritidy, abscesy, ...
25/41
Vztah bakterií ke kyslíku
* V praxi někdy vyrostou – běžně dosahovaná anaerobióza není dokonalá.
** V praxi někdy nevyrostou – běžně dosahovaná anaerobióza není dokonalá.
Takové bakterie (EOS – Extremely oxygen sensitive) běžně nelze kultivovat.
26/41
Prostředí Normální ↓O2 ↑CO2
Bez O2
Striktní aeroby ano ano ano ne*
Fakultativ. anaeroby ano ano ano ano
Aerotolorantní bakt.
Mikroaerofilní bakt. ne ano (ano) ne*
Kapnofilní bakterie ne (ano) ano ne*
Striktní anaeroby ne ne ne ano**
Diagnostika anaerobů
● mikroskopie: barvíme podle Grama, rozlišujeme na
koky a tyčky, G+ a G–; anaerobní tyčky pleomorfní
(nacházíme i vláknité formy a koky), u spor sledujeme
morfologii a uložení (světlolomné útvary, nikoliv jen
ztluštění tyčky!)
● kultivace: pevné půdy (anaerobióza pomocí anaerostatu
či anaerobního boxu), tekuté půdy přelité parafinem
(VL bujón, VL krevní agar a různé speciální půdy);
většinou prodloužená kultivace na 2 dny až týden
● biochemie: většinou KAT– a OXI–, možné vzájemné
rozlišení biochemicky a analýza plynů chromatografií
● antigenní analýza a nepřímý průkaz se v diagnostice
anaerobů příliš nepoužívají
27/41
Diagnostika anaerobů (2)
● přednost má tekutý vzorek, např. hnis, nejlépe
zaslaný ve stříkačce s krytkou (po odstříknutí
přebytečného vzduchu) – dříve doporučený postup, kdy
se na stříkačce ponechala jehla a zabodla do gumové
zátky se již z bezpečnostních důvodů nedoporučuje
● výtěr zanořen v transportní půdě (např. Amiesova
půda)
● lze domluvit s laboratoří naočkování vzorku přímo na
půdy např. peroperačně
28/41
Kultivace anaerobních bakterií
● rostou často v nepravidelných koloniích, někdy
výběžkaté okraje, někdy pigment
● typický je pro ně značný (hnilobný) zápach
● pro kultivaci anaerobů používáme VL krevní agar
● získávání anaerobiózy:
– mechanicky: VL bujony přelijeme parafinovým
olejem
– fyzikálně: v anaerobním boxu se nahradí vzduch
směsí anaerobních plynů, vháněných z bomby
– chemicky: z organických kyselin tvoří H2 a CO2 →
na palladiovém katalyzátoru reaguje H2 s O2 za
vzniku vody → O2 se spotřebovává
29/41
Anaerobní box
30/41
Mikrobiologický ústav, foto O. Z.
zdroj anaerobních
plynů
prostor pro
vkládání misek
vstupy pro ruce
personálu
Anaerostat
31/41
vzduchotěsné víčko
palladiový katalyzátor
(pod víčkem)
konstrukce pro
ukládání Petriho misek
generátor anaerobiózy
(sáček s chemikáliemi)
tlakový
ventil
šroubovací
uzávěr
Úkol 1: Mikroskopie klinického
vzorku a mikroskopie kmene
● úkol 1a: Prohlídka klinického vzorku (popište směs
patogenů, leukocyty, epitelie, atd.)
● úkol 1b: Mikroskopie podezřelých kmenů (rozlište
G+ a G– koky a tyčky, pokuste se najít spóry)
32/41
Úkol 2: Anaerostat a anaerobní box
● popište anaerostat a anaerobní box podle
obrázku z prezentace
33/41
Úkol 3: Kultivace na agarových
půdách
● popište kultivační výsledky daných kmenů na
aerobních i anaerobních půdách
● popište morfologii kolonií
34/41
Úkol 4: Druhová diagnostika
anaerobů biochemickými testy
● odečtěte ANAEROtest 23
● výsledky sloupců „B“ a „A“ se při výpočtu kódu
nezapočítávají, získáte tedy šestimístný kód za
sloupce H až C
● u druhého z kmenů vyjdou dvě možnosti výsledku
● předpokládejte, že tento kmen byl již testován na
citlivost na penicilin a byl shledán citlivým → nejde
tedy o zástupce (primárně na penicilin resistentního)
rodu Bacteroides
35/41
Úkol 5: Citlivost anaerobů na
antibiotika
● lékem volby u většiny anaerobů penicilin
● rezistentní je však rod Bacteroides (v užším slova
smyslu – rody Prevotella a Porphyromonas, které se
z něj kdysi odštěpily, jsou citlivé)
● antibiotická citlivost se u anaerobů dříve prováděla
difusním diskovým testem (nikoli na MH, ale na VL
krevním agaru)
● nyní se ale zpravidla používá E-test
● odečtěte hodnotu MIC a určete, zda je daný kmen
citlivý nebo rezistetní (odečítá se v místě, kde se
kříží okraj zóny s testovacím proužkem)
36/41
Úkol 6a: Průkaz toxinu (lecitinázy)
Clostridium perfringens
● Clostridium perfringens tvoří specifickou lecitinázu,
jež je možno neutralizovat specifickou protilátkou
● polovina misky je potřena protilátkou (anti-lecitinázou),
druhá potřena není
● toxický efekt lecitinázy spatříte jako oblast
precipitace kolem kmene na žloutkovém agaru
● pravý toxin je
neutralizován
antitoxinem,
jiné lecitinázy
neutralizovány
nejsou
37/41
Úkol 6a: Průkaz toxinu (lecitinázy)
Clostridium perfringens
● pravý toxin je neutralizován antitoxinem, jiné
lecitinázy neutralizovány nejsou
● „Negativní I“ vůbec neprodukuje lecitinázu
● „Negativní II“ produkuje, ale nějakou jinou, než
nás zajímá
38/41
Úkol 6b: Průkaz toxinu Clostridium
tetani
● průkaz toxinu Clostridium tetani se prování
očkováním tetanické myš
● typická je pozice ocásku a končetin (zakreslete)
39/41
microvet.arizona.edu Obrázek Petra Ondrovčíka (graficky upraveno)
Úkol 6c: Detekce A a B toxinů
Clostridium difficile
● odečtěte imunochromatografické testy tří
pacientů
40/41
test
přítomnosti
klostridiového
antigenu
test toxinů
A a B
kontrola
Po tomto cvičení byste měli umět:
● popsat hlavní zástupce rodu Clostridium, včetně testů,
které slouží pro jejich identifikaci, popř. identifikaci
jejich toxinů
● popsat nejběžnější druhy nesporulujících anaerobů,
jejich diagnostiku a obvyklou léčbu
● popsat základy anaerobní kultivace a možnosti získání
anaerobiózy
41/41