MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE PROKARYOT - cvičení
podzim 2018
GTA, Transdukce
Ivana Mašlaňová
iva.maslanova@gmail.com
GTA
Bakteriální kmeny:
Donor: Rhodobacter capsulatus DE442 (Rif rezistentní, producent GTA)
Recipient: Rhodobacter capsulatus B10 (Rif citlivý)
•1 ml buněk (12 000g/2 min), kontrola absorbance supernatantu spektrometrem
pro vlnové délky 750-950 nm, jako blank použít YPS medium. Při indukci GTA by měli
být vidět dva píky (absorbance intracelulárních pigmentů, které jsou uvolňovány při
buněčné lyzi indukované GTA)
• filtrace supernatantu bakteriologickými filtry 0,8 μm nebo 0,4 μm do normálních a
následně filtrem 0,22 μm do sterilních zkumavek.
•centrifugovat 28 h. recipientní kulturu (6000 g/ 4 min) a resuspendovat v ½
objemu sterilního G pufru (pro 20 ml tedy v objemu 10 ml)
•do skleněné zkumavky přidat 0,4 ml G pufru, 0,2 ml kultury a 0,1 ml filtrátu z
Rhodobacter capsulatus DE442 (Rif rezistentní, producent GTA).
KONTROLY:
1. Kontrola spontánních mutant -0,5 ml G pufru, 0,2 ml recipientní kultury
2. Kontrola kontaminace filtrátu – 0,6 G pufru, 0,1 ml filtrátu
3. Kontrola životaschopnosti buněk – 0,5 ml G pufru, 0,2 ml recipientní
kultury (vyset na YPS misky bez rifampicinu)
4. Pozitivní kontrola – 0,4 ml G pufru, 0,2 ml recipientní kultury, 0,1 ml
filtrátu s GTA (provedeno pracovníky LMDM)
•inkubovat směs 1 h. / 35°C / 150 rpm
•k směsi přidat 0,9 ml RCV media a inkubovat další 3 hodiny.
•centrifugovat 4 min. / 6000g ve 2 ml Eppendorf zkumavkách, pellet
resuspendovat ve zbytku sepernatantu a vysét na YPS petriho misky s
rifampicinem (výsl. koncentrace 100 µg/ml)
•inkubovat ve 35°C/ 2 – 3 dny
Transdukce
Bakteriofágem zprostředkovaný HGT.
Generalizovaná transdukce – defektní
fágová částice sbaluje náhodnou část
bakteriálního chromozomu.
Specializovaná transdukce – SaPI
Lyzogenní konverze – bakteriofág se
integruje do chromozomu
hostitelského kmene a poskytuje
hostiteli nějakou „novou vlastnost“ –
gen virulence apod.
Úloha transdukce
Indukce fága
transdukce
donorový kmen
Jevons B
recipientní kmen
RN4220
recipientní kmen
RN4220
a) selekce na MPA s kadmiem
koncentrace Cd: 2,5×10-4 M
b) selekce na MPA s tetracyclinem
koncentrace tetracyclinu: 5ug/ml
ϕJB
Materiál:
• Připravený fágový lyzát JB (cca 500ml), recipientní kmen RN4220.
• MPA, soft agar, roztoky tetracyklinu, kadmia, citrátu sodného a roztok
CaCl2.
• Sterilní odměrný válec, kónické zkumavky (50ml), petriho misky, sada
pipet, špičky, epinky, vodní třepací lázeň
Donorový kmen Jevons B – v genomu dva různé plazmidy, tetracyclinový plazmid
(pT181; 4,4 kb) a β-laktamázový plazmid s rezistencí ke kadmiu (28 kb)
Bakteriofág фJB – fág sérologické skupiny B, morfotyp B1, dlouhý, nekontraktilní bičík
Recipientní kmen – S. aureus RN4220, restrikčně-deficientní laboratorní kmen, citlivý
k ATB, bezplazmidový
Postup transdukce
1ml recipientní
kmen RN4220
1ml
transdukující
fág фJB
Inkubace 37°C/ 25 min.
+ CaCl2 do transdukční směsi
(1/10 celkového objemu)
+ 0,03M citrát sodný (1:1 k
celkového objemu)
Centrifugace 3000 rpm/10min./4°C.
Pelet resuspendovat v 0,017M citrátu sodném
a) misky s Cd
b) misky s tet