MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE PROKARYOT - cvičení
podzim 2018
Bakteriální RNA
Adéla Indráková
indrakova.a@gmail.com
Časový pořad
1. Organizace cvičení
2. Odběry Infikované kultury
3. Izolace RNA
4. Ošetření DNázou
5. Izolace plazmidů – dokončení experimentu
6. PFGE štěpení
7. Přepis do cDNA
8. PCR
Izolace plazmidové DNA tetracyklin
kadmium
buňky S. aureus promýváme v PBS
lyze
Precipitace
Vyčeření lyzátu
Vazba na kolonku
promývání
Eluce
Elektroforetická mobilita od nejnižší po nejvyšší:
• Štěpená, otevřená cirkulární forma (nicked): štěpena v jednom z řetězců DNA - NEJPOMALEJŠÍ
• Lineární forma (linear): linearizovaná forma, vznik rozštěpením obou řetězců.
• Uvolněná cirkulární forma (relax circular): oba řetězce DNA jsou neštěpené, k relaxaci dochází enzymaticky
• Superspiralizovaná forma (supercoiled): jedná se o spiralizovanou kružnicovou molekula - NEJRYCHLEJŠÍ
Detekce sestřihu endolyzinu Zásady práce s RNA:
• pracujeme v rukavicích
• pracujeme v prostředí bez RNáz;
inhibitory RNáz, RNase free plastic
• sada pipet na práci s RNA,
oddělené pracovní místo a ELFO
pro práci s RNA
• DEPC voda
1. Infekce bakteriální kultury fágem
2. Odběry v čase 0; 5; 10; 15 a 20 min
3. Izolace RNA TRIzolem
4. Odstranění genomové DNA
5. Přepis do cDNA
pracujeme s reagenciemi „Rnase free“
gel složení: 50×TAE, 60% formamid, DEPC
voda, 1,2% agarózy, 1/10 EtBr
pufr složení: 10×TAE
vzorek: denaturace RNA 65-70 °C/15 min.
Ověření kvality RNA
Elektroforéza RIN
Reverzní transkripce, RT-PCR
Jednokroková versus dvoukroková RT-PCR
Primery pro RT
Jaké potřebujeme kontroly pro reverzní transkripci?
Primery Výhody Nevýhody
Oligo-dT Celá cDNA z polyA Jen polyA mRNA, bias 3‘ konců
Náhodné hexamery Všechny druhy RNA, sekundární
struktury nevadí
Může snížit podíl mRNA signálu,
zkrácené cDNA
Sekvenčně specifické Specifické, vyšší sensitivita, lze
použít reverse PCR primer
Jen gen zájmu
intron
F
R1 R2
Sestřižená RNA
723 bp
1600 bp
1062 bp
Nesestřižená RNA
F
R2
intron
amplikony
amplikony
Design primeru pro detekci sestřihu
1. Primer nasedá za oblast intronu
Design primeru pro detekci sestřihu
1. Primer nasedá za oblast intronu
2. Primer překlene hranici exon-intron-exon
intron
F
R
Sestřižená RNA
Nesestřižená RNA
F
R
intron
amplikony
amplikony
NO
Využití RT-PCR
1. Analýza genové exprese
2. Validace RNAi
3. Diagnostika patogenů
4. Diagnostika genetických onemocnění
5. Výzkum nemocí