Struktury prokaryotické buňky • Základní - esenciální • Obvyklé – nejsou nutné k přežití buňky, poskytují výhodu 6.10.2015 1 Základní struktury • Cytoplazmatická membrána • Nukleoid • Ribozómy Rozvinutý nukleoid E.coli6.10.2015 2 Obvyklé struktury • Buněčná stěna • Organely pohybu • Fimbrie • Plazmidy • Kapsuly, slizy • Inkluze PHB Síra Beggiatoa . Parasporální inkluze B. thuringiensis karboxyzómy E.coli - fimbrie Streptococcus pneumoniae replikony E.coli - bičíky 6.10.2015 3 Cytoplazmatická membrána • Fluidní vrstva fosfolipidů (jednoduchý řetězec, esterová vazba) Archaea – etherová v. !! • Vnořené bílkoviny – mnoho proti Eucarya • Semipermeabilní – transport G- buňky cytoplazmatická membrána + vnější membrána!! G+ GG- buňky Lipid A (toxin) 6.10.2015 4 Fosfolipid • 1) Fosfátová skupina vázaná na glycerol • 2) 2 mastné kys.vázané na glycerol – 16-18C - nasycené – snižují fluiditu - nenasycené – zvyšují • Hydrofobní složka - nepolární • Negativní náboj 6.10.2015 5 • Lipidy – složení do urč.míry podle výživy a typu prostředí • Proteiny – integrální - hydrofobní vazby, cca 70% periferní – elstat.síly, H-můstky • Lipoproteiny – lipid do periplazmy • Glykoproteiny a glykolipidy – orientovány cukernou složkou vně membrány • Lipopolysacharidy G• Hopanoidy – lipidy u 50% bakt. - obdoba euk. sterolů 6.10.2015 6 • Bílkoviny pevně vázané – enzymy (ATPáza, nukleáza, fosfatázy), transportéry, strukturální. • Volné bílkoviny – fosfatázy • Inducibilní složky membrány existují, dokud existuje spouštěcí faktor syntézy = bílkovinné spektrum proměnlivé • Invaginace Pozn: Membránou obdány i některé typy inkluzí (glykogen, PHB, S, plyn. vakuoly, karboxyzomy) – 1 vrstevná!! 6.10.2015 7 Funkce cytoplazmatické membrány • Bariéra; receptory; antigeny 6.10.2015 8 • Transport – prostá difúze zprostředkovaná difúze aktivní transport 6.10.2015 9 http://faculty.ccbcmd.edu 1) Prostá difúze Plyny (N2, O2, CO2), malé polární molekuly bez náboje (etanol, voda, močovina) Krystalová struktura AqpZ 6.10.2015 10 2)Zprostředkova ná difúze uniporter kanál Msc channels – mechanosensitivní – reagují na zvýšení turgoru buňky zvětšením velikosti póru – adaptace na osmotický stres - MscL – E. coli A) KANÁLY hradlové mají specifitu!! 6.10.2015 12 KANÁLY hradlové • otevřenost je regulována • mají specifitu – pomocí vazebných míst rozpoznávají ionty • část polypeptidického řetězce = uzavíratelé hradlo • hradlo regulováno: - napětím - chemicky - mechanicky • specifické iontové kanály slouží pro rychlý průchod iontů jako Na+, K+ a Cl• Př: K+ pasivně difundují z cytoplasmy do extracelulárního prostoru přes transmembránové proteiny - tetramery řízené el. polem 6.10.2015 13 B) KANÁLY prosté • stále otevřené válcové struktury s centrálním vodním kanálem • neregulovány • př: poriny β vnější membrány - maltoporin umožňující difúzi maltodextrinů Maltoporin v komplexu s maltodextrinem (6 Glu jednotek). Dimer Gramicidinu A tvoří kanálek pro transport Iontu K+6.10.2015 14 Proteinové nosiče, přenašeče • Malá konformační změna přenašeče - následuje návrat do původní konformace Model transportu glukosy6.10.2015 15 • a) pasivní = zprostředkovaná difúze – netřeba energie, nevede k zakoncentrování přenášené látky 3)Aktivní transport • b) aktivní = aktivní transport vede ke kumulaci látky, transport proti koncentračnímu spádu za spotřeby ATP I) primární – zdroj energie nesouvisí s dalším průběhem přenosu ATPázy – přenáší ionty; fosforylovaný enzym = meziprodukt při hydrolýze Proteinové nosiče, přenašeče Fosforylace probíhá na zbytku kys. asparagové  Inhibováno vanadičitanem – zapojuje se namísto P6.10.2015 16 Příklady primárních aktivních nosičů • ABC transportéry – motivy vážící ATP a štěpící jej při příjmu látky; u bakterií stovky typů pro transport živin, vitamínů Př: (E. coli tak přijímá vit. B12 z prostředí), export toxinů • F0 F1 ATPáza – F0 dává enzymu citlivost, kruh z 12ti C kanálem pro H+ F1 katalytická fce střídajících se podjednotek α a β - syntéza nebo hydrolýza ATP - hydrolyzuje ATP i po izolaci z membrány - u E. coli je z osmi podjednotek (3x α, 3x β, γ, δ) kódováno operonem unc - Mitchellova chemiosmotická teorie 6.10.2015 17 • II) sekundární – proces spojen se změnou koncentrace na membráně - volná E využita pro transport neutrálních molekul proti koncentračnímu spádu (symport, antiport) Na+K ATPáza (sodno-draselná pumpa) – symport Na+ a Glu, zároveň antiport Na+ a K+ 3 Na+ (in) + 2 K+ (out) + ATP + H2O  3 Na+ (out) + 2 K+ (in ) + ADP + Pi 6.10.2015 18 6.10.2015 19 Aktivní transport: ATPázy Antiport Skupinová translokace Symport Skupinová translokace • méně častá • při transportu substrát chemicky modifikován (dostane se do buňky a zůstává v ní) • př: fosfotransferázový systém – fosforylace substrátu; akumulace PEP (přináší do buňky cukry proti koncentračnímu spádu) 6.10.2015 20 Vysokoenergetická fosfátová skupina je z fosfoenolpyruvátu přenesena na glukózu za tvorby glukóza-6-fosfátu Transport s lokální přestavbou membrány • přes membránu transportovány i velké molekuly • přestavbou membrány vzniká váček • málo časté, neprostudované • př: transport NK 6.10.2015 21 Cytoplazmatická membrána archeí Sulfolipidy, glykolipidy, nepolární isoprenoidní lipidy, fosfolipidy, větvené lipidy, mnoho proteinů v membráně FOSFOLIPID: (1) chiralita glycerolu (L-glycerol; dáno enzymy) (2) etherové vazby - glyceroldiether, tetraether = jiné chem.vlastnosti fosfolipidů (3) řetízky větvených isoprenoidů namísto MK Nepřítomnost sterolů jednovrstevná – diglycerol tetraether monolayer rezistentnější k narušení teplem6.10.2015 22 Buněčná stěna • Peptidoglykan Glykan – cukerná složka, NAG, NAM N-acetylglukózamin+N-acetylmuramová k., ß-1,4-glykosidická vazba – kostra = opakování aminocukrů Peptid – tetrapeptid – L-ala – D-glu – R – D-ala R = DAP – pouze v b.s., taxonomický znak u aktinobakterií, LL DAP, meso DAP G+ :R = lysin větš., tetrapeptidy spojeny pentapeptidem G- :vždy DAP a meso-DAP, tetrapeptidy spojeny přímo D-ala na DAP 6.10.2015 23DAP – diaminopimelová kys. Peptidoglykan = uniformní disacharid N-acetylglukózamin + N-acetylmuramová Stěna spory: jiné a unikátní složení peptidoglykanu! Acidorezistentní mykobakteria, nokardie.. nebarvitelné Gramem: N-glykolylmuramová Vztah mezi tvarem buňky a počtem disacharidových jednotek v peptidoglykanu (10 - 65) Tetrapeptid L- a D-AMK Spojení: rozdíl v pozici 3 Inter- pepti- dový můstek u G+ Micrococcaceae – až druhově charakteristická struktura můstku Streptomycety: 3 pozice unikátní L-amino DAP kyselina CHEMOTAXONOMIE: Aminkokyselinové složení tetrapeptidu a můstku!! 6.10.2015 24 Peptidoglykan G- G+ G+ : tetrapeptidy spojeny pentapeptidem G- :tetrapeptidy spojeny přímo D-ala na DAP 6.10.2015 25 • Lysozym – štěpí vazbu mezi aminocukry; = působí na hotovou stěnu • Penicilin – brání spojení tetrapeptidů = působí při syntéze stěny • Bacitracin - cyklický polypeptid blokující defosforylaci fosfolipidu, potřebného pro transportní funkci během výstavby buněčné stěny. Polymer Spojení tetrapeptidů různé u G+ a G- 6.10.2015 26 Taxonomický význam • Barvení buněčné stěny • Chemotaxonomie složek stěny a membrány 6.10.2015 27 • Mykoplazmata - bez b.s. 6.10.2015 28 Patogeny - např: plicní nákaza skotu (pleuropneumonie) • netvoří peptidoglykan http://www.zdravotnickenoviny.cz nejmenší známý mikroorganismus schopný samostatného života Během evoluce se objevily mnohonásobné redukce velikosti genomu a byl pozměněn i genetický kód. Celkové tempo evoluce je necharakteristicky vysoké. Jediným předpokládaným významem redukce velikosti genomu je evoluce Mollicutes na striktní parazity, jejichž velká část metabolické mašinérie zakrněla. 6.10.2015 29 6.10.2015 30 M. hominis vyvolává např. lidskou primární atypickou pneumonii (PAP), meningitidu, … M. pneumoniae je nejvýznamnějším patogenem lidského respiračního systému (faryngitis, tracheobronchitis, bronchitis, bronchiolitis, pneumoniae, pneumonitis, otitis acuta, bulózní hemorrhagická myringitis) M. genitalium, M. urealyticum Acidoresistentní bakterie nebarvitelné Gramem Buněčná stěna: • Obsah lipidických látek – hl.mykolové kyseliny (3-OH mastné kyseliny s dlouhým C řetězcem na pozici 2). - Délka řetězce specifická. • Př: mykobakterie, nokardioformní aktinomycety, korynebakterie • Mykolyl-arabinogalaktan tvoří lipidickou bariéru – brání penetraci kyseliny • B.s. acidorezistentních bakterií se neodbarvují kyselým alkoholem (1. stupeň acidorezistence) a 1% HCl (2. stupeň acidorezistence) po obarvení karbolfuchsinem 6.10.2015 31 6.10.2015 32 (DAP - kyselina diaminopimelová) Mycobacterium • Hydrofobní buněčná stěna - problém s transportem Fe siderofory – chelatizují Fe - exocheliny – extracelulární - mykobaktiny – uvnitř buňky • Pomalý růst – 3-9 týdnů - zpomalení transportu přes hydrofobní povrch - RNA-pol – nižší reakční rychlost (pomalejší syntéza RNA) - nízký poměr RNA/DNA – pomalejší syntéza proteinů 6.10.2015 33 acidorezistence 1.stupně – po 1.obarvení bazickým barvivem (fuchsin) se již neodbarví kyselinou ani alkoholem Mycobacterium tuberculosis – patogen člověka Mycobacterium africanum – patogen člověka Mycobacterium bovis - patogen skotu i člověka • Interakce s povrchy – biotickými i abiotickými • Bakterie evolučně úspěšné – kolonizují všechny niky... • Research topic (pubmed 120-200 publikací/rok) • Jeden z faktorů virulence Adheze bakterií 6.10.2015 34 6.10.2015 35 Adheze – poskytuje mikroorganizmům výhodu v přežití • lepší dostupnost a využitelnost substrátu • adsorpce makromolekul a malých hydrofobních molekul na povrch • lepší využitelnost koncentrovaných živin • ochrana před inhibičními účinky antibakteriálních látek (antibiotika, chlor, těžké kovy) • ochrana před bakteriofágy a parazitickými bakteriemi Má však i nevýhody – př. potlačení pohyblivosti Vsuvka: Cytologie buňky a virulence • Patogenita – schopnost organizmu způsobovat onemocnění • Virulence – stupeň patogenity – míra schopnosti organizmu infikovat makroorganizmus a způsobovat onemocnění • Faktory virulence = struktury/složky buňky - faktory adheze - extracelulární enzymy – invazivní faktory (hyaluronidáza, kolagenáza, koaguláza, kinázy, keratináza, mucináza) - faktory zabraňující fagocytóze (kapsuly, produkty metabolizmu) - toxiny (exo- a endotoxiny) Exotoxin - botulotoxin Endotoxiny ve VM Endotoxin = LPS A 6.10.2015 36 Adheze bakterií a indukce cytologických změn • „surface sensing“; ne všechny buňky na všechny povrchy • Roli hrají: - vhodné receptory a kompatibilita s cílovou molekulou (C. diphtheriae epitel hrdla; S. salivarius – zub, chlopně...) - hydrofobicita buněčného povrchu (hydrofobní MO formují biofilmy) 6.10.2015 37 Interakce buňky s povrchem indukuje změnu exprese genů buněčné morfologie, motility a adheze - souvislost mezi cytologickými znaky a proměnlivými formami existence buňky . 6.10.2015 38 Blízkost bakteríí k povrchu vyvolává změny v ph, osmolalitě a rotaci bičíků 6.10.2015 39 Buňka - pilli, povrchové proteiny, kapsuly a slizy Prostředí – náboj, hydrofobicita, topografie povrchu, vystavené různé chemické skupiny reagují s fyzikálně chemickými vlastnostmi buňky • Bioenergetika, technologie (fermentory), znečištění, bioremediace, biofilm, infekce • Budoucí výzkum: ovlivněním buněčné adheze modulací hydrofobicity buněk; vývoj nepřilnavých materiálů Adheze bakterií - význam 6.10.2015 40 Zubní povlak – A. van Leewenhoek Střevní sliznice Infekce – sliznice nebo uvnitř tkáně; - endokarditida - trvalý biofilm na chlopních (hl. strepto- a stafylokoky; nebezpečí krvácivých dásní..) - rány; bércové vředy; spáleniny Bakterie a hostitelský makroorganizmus adheze bakterií biofilm 6.10.2015 41 Cévky – arteriální, žilní Močové katetry Dýchací a dializační přístroje Umělé chlopně Kontaktní čočky Děložní tělísko Nemusí být kontakt s vnějškem! - kovové náhrady kloubů Biofilm a medicína Stafylokoky – fibronektin-binding protein.. pseudomonády, E. coli, streptokoky, aktinomycety… Bakterie jsou unášeny proudem krve a mohou začít infekční proces na odlehlém místě…. Vytrvalá syntéza a uvolňování toxinů… 6.10.2015 42 Biofilm skloviny 700 kmenů z 18ti rodů Mezibuněčný kontakt – role adhezinů (lektiny) a receptorů (sacharidy) Kontak s povrchem zubu – pelikula proteinů, lektiny... (Rickert et al. 2003)6.10.2015 43 Adheze: Střevní mikroflóra • Střevní mikroflora: 10 14 CFU/ml • Proměna s věkem, dietou (polysacharidy; prebiotika..), imunitou, hygienou a ATB léčbou • Poměr populací – „přínosná mikroflora“ vs. anaerobní mikroflora jako clostridia... • Alterovaná střevní mikroflora – obezita, cukrovka, záněty, metabolické poruchy 6.10.2015 44 Střevní mikroflora a probiotika • Funkční potraviny: bakterie mléčného kvašení • Fce: metabolizmus, produkce vitamínů, zábrana adheze patogenů, modulace imunity – alergie, bakteriociny • probiotický efekt – kmenově specifický (genetické inženýrství – konstrukce vhodných kmenů...) • živé vektory a nosiče vakcín – protektivních antigenů: (LABVAC – evrop. projekt – Lactococcus lactis, Streptococcus gordonii, Lactobacillus spp.) 6.10.2015 45 6.10.2015 46 Lactobacillus Bifidobacterium jiné mléčné bakterie ostatní L. acidophilus B. adolescentis Enterococcus faecium E. coli L. delbrueckii subsp. bulgaricus B. animalis subsp. animalis Streptococcus thermophilus Saccharomyces cerevisiae L. delbrueckii subsp. lactis B. animalis subsp. lactis Leuconostoc mesenteroides Saccharomyces boulardii L. amylovorus B. longum subsp. infantis Pediococcus acidilactici L. casei B. breve Lactococcus lactis L. crispatus B. longum subsp. longum L. fermentum B. bifidum L. gasseri L. plantarum L. reuteri L. rhamnosus mikroorganismy používané jako probiotika 6.10.2015 47 (1) competition for dietary ingredients as growth substrates, (2) bioconversion of, for example, sugars into fermentation products with inhibitory properties, (3) production of growth substrates, for example, EPS or vitamins, for other bacteria, (4) direct antagonism by bacteriocins, (5) competitive exclusion for binding sites, (6) improved barrier function, (7) reduction of inflammation, thus altering intestinal properties for colonization and persistence within, and (8) stimulation of innate immune response (by unknown mechanisms). IEC: epithelial cells, DC: dendritic cells, T:T-cells. www.customprobiotics.com Příjem probiotik • Mléčné produkty • Fermentované cereálie, ovoce a zelenina (severské země; intolerance laktózy) Nejběžnější probiotické kultury v doplňcích a léčivech Nejběžnější Probiotické kultury v potravinách Forma: potraviny, doplňky, léčiva.... Spotřeba mléčných produktů 6.10.2015 48 Další funkce probiotik • Produkce bakteriocinů – x patogenům • Produkce EPS – biofilm – quorum sensing • Produkce biosurfaktantů – antimikrobní aktivita proti pg, snížení adheze pg • Produkce antioxidantů – vychytávají volné radikály (superoxidové anionty, hydroxylové radikály) 6.10.2015 49