Bakteriální genom v populaci buněk • Vztah mezi: - krátkou generační dobou - frekv. mutace - přenos mobil.genet.elementů a plazmidů - vertikálně…horizontálně - i mezi rody…. - množství buněk v populaci Význam pro mikrobiální technologie; Genetické inženýrství... Dělení buněk Růstová křivka populace 1 Nukleoid • Zpravidla cirkulární DNA (lineární – Borrelia, Streptomyces, Coxiella, Paracoccus denitrificans) 2 oddělené chromozomy – Rhodobacter sphaeroides • E. coli – 4,7 . 106 nukleotidů • Průměrná hmotnost: 5 . 10 – 15 g DNA • 0.58 Mbp Mycoplasma genitalium • 4.4 Mbp Mycobacterium tuberculosis, E. coli • Vazba na CM – mezozomy, dělení • G+C obsah (melting point): 28% (Clostridium) - 72% (Sarcina). • Frekvence mutace • NCBI – databáze sekvenovaných genomů A GFP-based bacterial biosensor with chromosomally integrated sensing cassette for quantitative detection of Hg(II) in environment.... 2 • Architektonická organizace: - kondenzace do kompaktní struktury, HLP proteiny asociované s DNA (vazba cca 105 mlk histon-like proteins), napomáhají skládání NK. Vysoce konzervované u eubakterií • Superhelicita = nadšroubovicové vinutí • Relaxovaná podoba DNA – spotřeba ATP závity přitaženy: • negativní s. (fyziologický stav) závity rozvolněny: • pozitivní s. • enzymy topoizomerázy – inhibice kumarinová atb. 3 • Haploidní Páry bazí A-T, C-G: • Neplatí paradox hodnoty C • Replikace předchází dělení buňky • Reprodukce – asexuální = děti jsou klonem rodičů... • Změna sekvence – rekombinací nebo mutacemi 4 První sekvenovaný: Haemophilus influenzae (1995 by The Institute for Genomic Research) Počet genů: 575 – 5500.. High coding densities.... (Člověk 3 mld bp a 23 000 genů) 5 Výjimka v asexuální reprodukci Genom kóduje, ale vyvíjí se, mění se… • Po několika miliardách let evoluce adaptace na všechny niky • Adaptace a) evoluční; b) regulace metabolizmu v daném momentě • Vývoj ochranných látek chránících proteiny a NK (unikátní chem.struktury př: dipikolinová, “histon – like” proteiny HS proteiny…) 6 Genetická informace • Velikost genomu: „specialisté“: ~1,5 MBp, „generalisté“- ~4 – 8 MBp • Složky genomu: Chromozom Plazmidy – F, R, Ti, Col Mobilní elementy: transpozony, inzerční sekvence Profágy • Způsoby přenosu – transformace, konjugace, transdukce Replikony 7 • Místa ori (počátek) a ter (konec) • Prodlužování buňky • Nová replikace ještě před úplným rozdělením buňky.. Replikace 8 Transkripce • RNA-polymeráza – 5 podjednotek 9 • Syntéza 1 mRNA trvá 1 min, nejsou postranskripční úpravy • Různá hladina mRNA = různá hladina proteinů • Evolučně konzervované, podobná eukaryotické (rozdíly ve složení genů, prokaryotická je spojena s translací) 10 Translace • Iniciace translace • Elongace polypeptidového řetězce • Terminace translace Ribozomy • Proteosyntéza • 2 podjednotky – Mg + energie (ATP, GTP) – podmínka funkce rRNA + proteiny • 70S = 30S + 50S (Svedbergovy jednotky) (sedimentaci vedle hmotnosti ovlivňuje i konformace) 30S………..1540 nukleotidů, 21 proteinů 50S………..2900 nukleotidů, 34 proteinů • Selektivní působení ATB pouze na bakteriální ribozomy – jiné cílové místo • Archea – odlišnosti, větší resistence (Kan, Ery) (Proteosyntéza je inhibována anisomycinem ) RNA – Bacteria vs. Archaea !! 11 12 13 A - aminoacylové vazebné místo P - peptidylové vazebné místo E – místo exitu tRNA Prostorově i časově regulováno – tato všestrannost zabezpečuje morfologickou potažmo fyziologickou diferenciaci v procesu buněčného cyklu! Transport proteinů a) statická – skupina proteinů precizně lokalizovaná, proměny jen na bázi podjednotek (integrální membr.proteiny…) 14 b) proměnlivá – díky cytoskeletu a pohybu proteinů „diffusion-and-capture“ (Rudner, 2002), sítě dynamických interakcí Buněčná organizace proteinů v buňce: Zvláštnosti genomu některých bakterií 15 Deinococcus radiodurans • Objeven 1956 (Arthur W. Anderson) – maso po radiaci... • Přežil radiaci, která je 3000x silnějš než hodnota, která by usmrtila člověka • Ionizující záření – zlomy obou řetězců NK • Reparace • 2 lineární chromozomy, megaplazmid a malý plazmid 16 Azotobacter vinelandii • Schopen fixace dusíku • Metabolizuje mnoho uhlovodíků, org.kys a alkoholů • Počet chromozomů závisí na fázi buněčného cyklu • Exponenciální fáze: 2-4 kopie • Stacionární fáze – 50-100 17 Buchnera spp. • Vnitrobuněční symbionti mšic (mutualismus) • velikost genomu – 7x menší než genom E. coli !! • 640 kbp • Chromozom + 2 plazmidy • Počet chromozomů však závisí na vývojovém stadiu mšice 18 Agrobacterium tumefaciens • Gramnegativní, pohyblivé • Nádory rostlin • Přírodní genetický inženýr transformující svou DNA do buněk rostlin • 5,7 Mbp • 1 cirkulární + 1 lineární chromozom a 2 plazmidy • Tumor Inducing plasmid – zodpovědný za virulenci 19 Epulopiscium spp. • Střevní symbionti rybek Acanthuridae. • Některé buňky delší než 0,5 mm! • DAPI barvení NK • real-time PCR –tisíce kopií genomu?? • Adaptace vzhledem k velikosti buněk?? 20 Bakteriální cytoskelet • vláknité proteiny tvar buňky polarita buněčné dělení a segregace chromozomů a plazmidů • jsou analogické cytoskeletárním strukturám eukaryotní buňky (3D strukturou, biochemickými vlastnostmi) Yu-Ling Shih and Lawrence Rothfield (2006): The Bacterial Cytoskeleton.Microbiology and Molecular Biology Reviews, p. 729-754, Vol. 70, No. 3 21 • analog tubulinu = FtsZ - protein buněčného dělení (filamentous-temperature sensitive protein Z) - strukt. podobnost – GTP vazebná doména (20% N-konec,nikoli C- konec) - vyžadován pro start časné syntézy PG vedoucí k tvorbě mezivrstev • analog aktinu = MreB - determinace tvaru buňky, prodl.stélky - kokovité buňky - chybí homology MreB genů • analog intermediálním filamentům = Crescentin distribuce MreB genů v říši Bacteria ukazují, že nesférické buňky vlastní jeden nebo více těchto genů L.J.F. Jones, R. Carballido-Lopez and J. Errington, (2001), Cell, 104, 913-922 22 23 • zkoumána podobnost krystalická struktura proteinu MreB (T. maritima) vs. eukaryotický aktin - pomocí MAD (Multi-wavelength anomalous diffraction), EM - strukturálně jsou si podobné, i svou orientací - 2 shod. podjednotky jako u aktinu F. van den Ent, L.A. Amos a J. Löwe (2007): Bacterial Origin of the mreB; IF Thermotoga maritima 24 • další proteiny s vlastnostmi aktinu: ParM (E. coli) MamK (Magnetospirillum magneticum) • podobnost intermediánním filamentům crescentin –(Caulobacter crescentus). 25 • Růst BS při dělení 1) Polymerace tisíců mlk FtsZ 2) Formování prstence 3) Přídatné proteiny – min. 1 - ZipA (gamma-proteobact.) - FtsA (Firmicutes) 4) MinC a MinD proteiny 5) Determinace tvaru buňky - MreB, MreC, MreD, Mbl Bakteriální cytoskelet a proteiny určující tvar buněčné stěny jako MreC spolupracují při lokalizaci komplexů koordinovaně syntetizujících buněčnou stěnu 26 • MreC je podstatný pro prostorovou organizaci složek holoenzymů periplazmy syntetizujících peptidoglykan • MreB řídí řídí lokalizaci prekurzorů peptidoglykanu v cytosolu • Fluorescenční značení dokazuje, že MreB a FtsZ, MreC a RodA působí při syntéze PG. • MreB a FtsZ jsou vyžadovány pro morfogenezi polární stélky.27 • FtsZ reguluje prostorové umístění enzymu MurG produkujícího lipid II (prekurzor peptidoglykanu). Časné umístění FtsZ do kruhové struktury během prodlužování buňky je následováno převedením MurG a přesměrování syntézy prekurzorů peptidoglykanu do středu buňky. Děje se tak před buněčnou konstrikcí s přispěním k elongaci buňky. • Za nepřítomnosti FtsZ se enzym MurG neakumuluje uprostřed buňky a buněčná elongace pokračuje inzercí peptidoglykanu i po okrajích buněčné stěny. Buňka tedy k elongaci využívá systém syntézy buněčné stěny závislý i neávislý na FtsZ; důležitost jednoho nebo druhého režimu závisí na načasování uspořádání FtsZ během elongace buňky. 28 Inkluze • Zásobní látky • Produkty metabolismu • uložené nepotřebné látky • Bez membrány nebo s membránou ----- není dvojvrstvou fosfolipidů. Membrána jednovrstevná fenaziny 29 V cytoplazmě v podobě granul nebo kapének • Svým charakteristickým vzhledem uvnitř buněk napomáhají identifikaci Produkce rekombinantních proteinů „zabalení“ a stabilizace proteinů nahromadění Funkce a podoba 30 Př: 2 modely formování inkluzí PHA (polyhydroxyalkanoát) 31 Imobilizace molekul v inkluzích granule-associated proteins fusion protein protein of interest Following growth in conditions suitable for PHA synthesis... 32 • Rozvoj využití inkluzí jako katalyzátorů v průmyslu a biotechnologiích „surové inkluze“ • Aktivita enzymů je v nich vysoká! • Inkluze jsou snadno odstranitelné • Výhoda: - vysoký obsah proteinů - možnost agregace i rekombinantních proteinů (enzymů) bez jejich inaktivace 33 Glykogen • 160 – 300 nm, až 50 % sušiny • počet 1-10 • rozpustný polymer glukózy • α-1,4 vazby a α-1,6 větvení na každém 8-10tém monomeru • Může a nemusí mít membránu • Ve světelném mikroskopu není viditelný: Barvení Lugolovým roztokem 34 a) obdané membránou Bakteriální glykogen je silně větvený. Slouží jako pohotová rezerva. Nachází se především v buňkách bacilů a enterobakterií! 35 PHB Bacillus megaterium • kyselina polyhydroxymáselná • až 60% sušiny • viditelná ve světelném mikroskopu • Je to odpadní produkt • Vyskytuje se u aerobů: Bacillus, Pseudomonas Rhodobacter sphaeroides Samuel Kaplan, University of CaliforniaSan Diego 36 Síra • viditelné kapénky amorfní síry chemolitotrofní sirné bakterie oxidace redukovaných sirných sloučenin je tedy pro ně zdrojem energie. Granula elementární síry, Beggiatoa Temné pole, 800x •Oxidace sirovodíku primárně poskytuje elementární síru •síra je následně oxidována na sulfát 37 • Dále u fototrofních sirných bakterií – zelených a purpurových • není zdrojem energie, ale zdrojem elektronů v procesu fotosyntézy. 38 Plynové vakuoly cylindrické aerosomy (45 – 200 nm) • sinice a planktonní bakterie • (cca u 50ti rodů bakterií; • purpurové a zelené sirné a halofilní Archea) • plyny vznikající při metabolismu • u archeí napomáhají pohybu ve vodě • množství plynu závisí na teplotě a viskozitě • Membrána z jedné vrstvy bílkovin Plynové vakuoly , Clark, Walsby 1979 39 Karboxizomy • protáhlé polyhedrické cisterny • usnadňujíci fixaci CO2 • syntéza hexóz • za vhodných podmínek je vyšší počet (1-10) • nedělí se A) Synechococcus karboxyzom B) –II- negativní barvení C) H. neapolitanus karboxyzom D) H. neapolitanus karboxyzom, negativní barvení 40 Chlorobiové váčky • Jen zásobárny pigmentů – bakteriochlorofyl a karotenoidy • Nikoli reakce a vazba světla • Přenášeny do chromatoforů, kde vlastní fotosyntéza • Počet: 2-10 41 Magnetosomy • krystaly oxidu železnato – železitého (Fe3O4) orientace v magnetickém poli = magnetotaxe • vodní organizmy citlivé ke kyslíku • obaleny speciální membránou umožňující precipitaci Fe3O4 42 b) bez membrány Glykogenová granula – 20 – 100 nm, jedna buňka je může mít pouze s nebo bez membrány, v rámci rodu lze obojí zároveň. Krystaly Parasporální (Bioinsekticidy – Bacillus thuringiensis – na moučné červy, i selektivní působení (až na druhy)) 43 Polyfosfátová granula = volutin - při nadbytku ATP • Akumulace z jakého důvodu?? • Je dobře viditelný pod mikroskopem • Až 500 molekul, nerozpustný ve vodě • Nikdy není zdrojem energie • Počet: 1 – mnoho, podle metabolismu. • Vysoký počet je v době před přechodem do klidového stadia • Slouží jako: rezervoár fosforu, alternativní zdroj P (namísto ATP) při fosforylaci cukrů při jejich katabolismu, chelatační činidlo divalentních iontů, jako pufr při alkalickém stresu a jako regulátor při odpovědích na stres 44 Pigmenty • Produkty primárního i sekundár. metabolismu. Produkovány v závislosti na stanovišti • Pokud jsou produktem primárního metabolismu – jsou bezpodmínečné potřeby (bakteriochlorofyl, karotenoidy) • Využívají se při metabolismu nebo mají protektivní účinek či jiný ekologický význam (inhibiční účinky) • Protektivní účinek – absorbuje světlo o určité vlnové délce, jsou syntetizovány až v rámci sekundárního metabolismu. 45 Př: absorbce UV záření, pufry při ničení kyslíkatých radikálů – to je důležité např. u patogenů: fagocyty na ně nemohou toliko působit např. peroxidem vodíku! Př: karotenoidy Streptococcus B – závažný původce pneumonií a meningitid u novorozenců; zlatý karotenoid Staphylococcus aureus opět brání proti oxidačním reakcím imunitního systému) 46 • Buňka může produkovat endo- (protektivní) i exopigmenty různých barev • Řada pigmentů vzniká nadprodukcí látek. • Lokalizace (podle své úlohy): v cytoplazmě, v CM u fototrofů, v periplazmatickém prostoru, (v buněčné stěně u kvasinek), jako exopigmenty – ekologický význam (inhibiční agens, ATB). 47 Nejčastěji vyskytující se pigmenty: • karotenoidy – endopigmenty u většiny buněk • bakteriochlorofyly a,b,c,d – anaerobní prostředí • prodigiozin – extracelulární, mikrobicidní účinek – bakterie a plísně • Fenaziny– extracelulární, sek. metab., mikrobicidní účinek – bakterie a plísně (Erwinia) • Melaniny – hnědé, černé, tmavě červené - v závislosti na době kultivace • Antokyany – sek.metab., barva závisí na pH • Př: Micrococcus flavocianus – žlutý endopigment a fialový exopigment. Na MPA jen žlutý endop. Na glukozókvasničním agaru – oba pigmenty pH prostředí? Kultivační medium? Stáří kultury? Endopigment? Exopigment? Mikrobicidní? Protektivní? 48 Úprava a využití bakteriálních pigmentů • Potravinové doplňky – karoteny - retina, antioxidanty (melanin) • Barviva v potravinářství • A jako přírodní barviva textilií – akrylová vlákna, hedvábí, bavlna (vydrží míň), PE (míň), ... – většina syntetických barviv obtížně degradovatelná a toxická! (obsah karcinogenních dioxinů) Testy toxicity! Př: žlutooranžové, červené a růžové pigmenty Chryseobacterium sp., Serratia marceseus, and Chromobacterium violaceum • Některé pigmenty fluoreskují – značení Ab Označení patogenního organismu 49 Struktury vně buňky • Kapsuly – mikro a makro - dobře organizované, rigidní, AMK nebo cukry Bacillus – kyselina glutamová Bacillus anthracis – poly-D-glutamová • Slizy - polysacharidy - lépe odstranitelné, difúzní, neorganizované kapsuly nebo slizy = glykokalyx 50 Kapsula - virulence Negativní barvení - Streptococcus pyogenes TEM (28,000X). Kapsula – kys. hyalurnová- PS Bacillus anthracis poly-D-glutamát Tvorba pouzdra ovlivněna složením media, prostředím Jeden druh až 60 druhů kapsulových antigenů 51 Sliz • Sliz – řídký difúzní neorganizovaný materiál - spojuje více buněk, snadno odstranitelný, nejčastěji polysacharid - může sloužit k pohybu ve vlhkém prostředí. 52 Glykokalyx • netvoří se v laboratorních podmínkách za dostatku živin = síťovina z vláken polysacharidů a glykoproteinů • umožňuje adherenci, která je málo až vysoce specifická • Kationty umožňují spojení stejně nabitých buněk a povrchů 53 54 Pochvy • výhradně z PS • chemické složení a zbarvení druhově specifické • glukóza + kyselina glukuronová (Sphaerotilus) u jiných rodů např. fukóza • Někdy hydroxidy kovů – v malém množství (zbarvení; Fe, Mn, Cu; závisí na druhu) • Př: Sphaerotilus, Leptothrix • Přisedlé MO • Trubkovitý tvar • Až několik mikrometrů • Pohyb 55 Sphaerotilus natans 56 Struktury vně buněčné stěny • ochrana před fagocytózou • před protilátkami • před vysycháním • před detergenty • vazba na povrch předmětů, tvorba biofilmu 57