Taxe bakteriálních buněk Chemotaxe je jednou z nejprozkoumanějších signálních drah Bakterie vyhodnocují změnu gradientu koncentrace v prostoru i v čase Vláknité útvary na povrchu buňky Bakterie detekují 2% změnu koncentrace 122.10.2015 Důvody pohybu bakterií • nejčastější – pohyb ke zdroji živin • reakce na repelent • shlukování buněk za účelem vytvoření plodnice – Myxobacteria • Intenzita odpovědi závisí i na teplotě 222.10.2015 Signalizace rozpoznání významných a nevýznamných signálů = sítě pro regulaci přepisu genů nebo pro přenos signálů - monitoring environmentálních a vnitrobuněčných dějů a následná odpověď - evoluce senzorů, receptorů a přenašečů signálu – pro maximální citlivost a zároveň inhibice neustálé stimulace - adaptace: na atraktant/repelent kovalentními modifikacemi struktur receptorů - design chemoreceptorů konzervovaný Nature. 2004 Apr 1;428(6982):574-8. From molecular noise to behavioural variability in a single bacterium. Korobkova E1, Emonet T, Vilar JM, Shimizu TS, Cluzel P. 3 senzory chemoreceptor přenašeče signálu22.10.2015 22.10.2015 4 dvoukomponentní systém (two component system, TCS) Organizace signálních drah (i) Pestrá struktura signálních proteinů (ii) Tok informace od N-konce senzoru k C-doméně přenašeče (N-to-C flow) (iii) Různé receptory se shodují v senzorických sektorech (iv) Jeden signál může spouštět více úrovní/drah odpovědi (v) Posel signální dráhy cAMP (aktivátor proteinkináz) a cyklický diguanylát (vi) Souhra signálních drah. Experimenty: 3D a 4D struktury domén, charakterizace domén receptorů 522.10.2015 Signalizace a chemotaxe • Výzkum v oblasti chemotaxe od.r 1880 • Síť chemotaktických drah komplexní, adaptabilní, paměť... • Analýza rušivých elementů spolu s analýzou podstatných signálů • Spočívá v samotné struktuře a interakcích proteinů sítě drah • Chemoreceptory s proměnlivými senzory (5 typů) Regulace chemotaxe 6 Senzory rozeznávají serin, aspartát, ribózu, galaktózu, dipeptidy a redoxní reakce 22.10.2015 Tsr, Tar receptor Prostorová organizace senzorů Proteiny chemotaxe a pohybu rozmístěné do klastrů. Kryoelektronová mikroskopie Receptory fungují jako signalizující di- nebo trimery; amplifikují a integrují chemotaktické signály. Chudé medium – vysoká hladina exprese receptorů a jiných chemotaktických proteinů. Zvyšuje hustotu a kooperaci receptorů. Regulace preference ligandu. 722.10.2015 22.10.2015 8 „Bakteriální nanomozek“ Chemotaxe – strukturně-funkční vztahy Vysoce konzervované chemoreceptory – Bacteria, Archaea • Studie: E. coli a salmonela - multimer na jednom nebo obou pólech buňky • Tisíce regulačních proteinů a proteinů pro přenos signálu • Objevena diverzita od modelových MO - velikost a topologie chemoreceptorů - modus signálu - přítomnost přídatných proteinů přenášejících signál 922.10.2015 22.10.2015 Mechanismus chemotaxe E. coli Regulace pomocí MCP systému MCP = „methyl accepting chemotactic protein“ váží se na něj proteiny CheA a CheW – enzymy cytosolu CheA = autofosforylující membránová kinasa ( CheA-P) CheA-P přenáší fosfát na CheY CheY-P = pohyb bičíku CW CheZ – fosfatása, desfosforyluje CheY-P = pohyb bičíku CCW 1122.10.2015 22.10.2015 12 Prokaryota vs eukaryota • rotace bičíku kolem vlastní osy – pouze u prokaryot • poháněn proton motive force (pmf) – pohyb protonů přes cytoplazmatickou membránu 1322.10.2015 • počet bičíků • lokalizace bičíků • dostatek redukčních ekvivalentů 1422.10.2015 Vnitřní faktory ovlivňující pohyb 1522.10.2015 1622.10.2015 Přítomnost/nepřítomnost atraktantu Bakteriální bičík • semirigidní vláknitá struktura 1 – 4 proteiny – flagelin • podobná stavba u všech dosud zkoumaných druhů bakterií • tloušťka 13 – 20 nm • 1 – 100 µm/s • atraktant – faktor motility test medium (polotuhé medium) G- 1722.10.2015 Komponenty bičíku: • vždy bazální tělísko – G- 3 kruhy (CM, PG a VM) G+ 2 kruhy • háček (hook) • vlastní vlákno • Bazální tělísko zůstává po odstranění bičíkového vlákna, to je do 20 až 30 min dosyntetizováno 1822.10.2015 • B.S. ne tak pevná, navíc vnější membrána = víc disků L pruh - vnější membrána P pruh – PG buněčné stěny 19 G- typ B.S. 22.10.2015 2022.10.2015 • G+ : bazální tělísko - 2 disky spodní disk - v CM horní disk – v B.S. - kluzné ložisko tam se otáčí osa, háček pro ohyb 2122.10.2015 Tvorba: • Samouspořádávání – „self-assembly“ • molekuly flagelinu jsou středem vlákna transportovány na konec, vazba na konci bez enzymů, dosyntetizuje se vždy do stejné délky. 2222.10.2015 Selfassembly.... 2322.10.2015 • supramolekulární komplex • molekul.hmotnost flagelinu větší než pilinu • flagelární antigen • začíná v CM (oproti fimbriím) • délka bičíku několikanásobně větší než délka buňky • bičíky lze snadno odstranit sklem 2422.10.2015 Ultrastruktura bičíku 2522.10.2015 uspořádání: taxonomický znak 2622.10.2015 Pseudomona s Spirillum Proteus vulgaris 2722.10.2015 Pozorování pohybu bičíku – visutá kapka - důležitý dostatek kyslíku v temném poli a intenzivním světle Pozorování bičíků samotných – světelný mikroskop po spec. barvení (obalení bičíku vrstvou mořidla, znásobení a zviditelnění jeho průměru) – elektronový mikroskop – negativní barvení otiskové preparáty po rychlém zmražení na -150 C 28 Agrobacterium Spirillum volutans 22.10.2015 Pohyb bakteriální buňky spojeno s pohybem po tkáních/sliznicích • swimming motility – pohyb bičíky, plavání • swarming motility – plazivý pohyb kolonií, bičíky, Proteus • twitching motility – trhavý, skákavý pohyb – př. Neisseria gonorrheae, Legionella pneumophila • gliding motility – klouzavý pohyb 29 Motility medium Terasovitý růst – střídání fází Proteus 22.10.2015 twitching motility Legionella pneumophila Plazivý pohyb kolonií (swarming) • Proteus, Vibrio • pohyb indukovaný kontaktem s tuhým médiem • delší buňky, více bičíků • oblak, roj buněk, který se pohybuje koordinovaným pohybem • má schopnost přerůstat i vyvýšené útvary na médiu 3022.10.2015 3122.10.2015 Klouzavý pohyb (Gliding motility) • na pevných površích • mechanismus nejasný • pmf patrně zahrnuty • přizpůsobení – slizy, surfaktanty, specif. membránové komponenty, které tvoří reverzibilní vazbu se substrátem, actine-like systém • Makoto Miyata, profesor Osaka City University zkoumal klouzavý pohyb Mycoplasma mobile • Za pomoci cytoskeletárních filament udržují nesférický tvar. („They look like schmoos that are pulled along by their heads. How they are able to glide is a mystery“.) 32 Miyata, M., Ryu, W.S., and Berg, H.C. "Force and velocity of Mycoplasma mobile gliding." J. Bacteriol. 184, 1827-1831 (2002).22.10.2015 33 Klouzavý pohyb - tvorba plodnice myxobakterií 22.10.2015 Bičíky archebaktérií - strukturní a funkční podobnost bakteriálním bičíkům Rozdíly - pohon ATP (mechanismus neznámý) - bičík nemá centrální dutiny – nemožnost dorůstání od konce - koordinovaný pohyb více filament 3422.10.2015 PILI - fimbrie • Různě velké, typicky u G• struktura B.S, stovky • duté, vždy nepohyblivá trubička - 3, 4 nebo 5 vláken stočených do spirály – protein pilin • kratší než bičík - Ø2-8 nm, délka 0,1 – několik nm, 3-5 molekul • Fce: přenos DNA konjugací, přichycení fágů Pohyb (twitching motility); adheze k nenabitým povrchům 3522.10.2015 3622.10.2015 I. • kódované chromozomálně • specifická kolonizace u symbiontů, parazitů a patogenů Př: Vibrio cholerae O1, E.coli – uropatogenní P pilus, adherentnce fimbrie + enterotoxin E. coli) II. • sex fimbrie - kódované konjugativním plazmidem u donora DNA, můstek pro plazmid (F pilus u E.coli, konjugativní plazmidy salmonel) barvení : - kys.fosfowolframová - kys. osmičelová PILI – fimbrie - typy 3722.10.2015 Curli • Proteinové komponenty Enterobacteriaceae • forma amyloidních vláken (strukturou); • Objeveny 1980 • Adheze na povrchy, agregace buněk, formování biofilmu, invaze do hostitele • Indukují zánět 38http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1670433922.10.2015 Vláknité útvary na povrchu buňky • bičík • fimbrie, pili • curli 3922.10.2015 22.10.2015 40 Fototaxe RC - photosynthetic reaction center ETC - electron transfer chain SRI, SRII - photoreceptors HtrI, HtrII - signal transducers PYP - photoactive yellow protein (negativní fototaxe - Halorhodospirum halophila) Vnější struktury bakteriálních buněk vs. buňky hostitele – adheze, invaze a remodelace hostitelských buněk Jak jsou indukovány změny některých struktur bakteriální buňky, a jak tyto struktury působí na přestavbu buňky eukaryotické 4122.10.2015 Eukaryotický cytoskelet a jeho modifikace vlivem patogenů Tendence – vždy vhodná nika pro přežití Ovlivněn viry i bakteriálními patogeny Cytoskelet hostitele slouží k: - přilnutí, vstup do buněk, pohyb uvnitř a mezi buňkami, formování vakuol a remodelace 4222.10.2015 Enterotoxigenní E. coli (ETEC) 22.10.2015 43 4 typy fimbriálních struktur: • Fimbrie sensu stricto • Fibrily • Fimbrie typu 4 • curli Enteropatogenní E. coli (EPEC) 22.10.2015 44 22.10.2015 45 Enteroagregativní E. coli 22.10.2015 46 • plazmid pAA s molekulovou hmotností 60 MDa až 65 MDa, který kóduje fimbrie agregativní adherence 22.10.2015 47 Extraintestinální E. coli 22.10.2015 48 22.10.2015 49 22.10.2015 50 22.10.2015 51 22.10.2015 52 22.10.2015 53