Růstové cykly bakterií II. Střídání přisedlé a volné (plovoucí) formy života u prokaryot Caulobacter crescentus Sphaerotilus natans Biofilm 1 2 vodní prostředí – mořské i sladkovodní tělní tekutiny – sliny, střeva, krev Přizpůsobení přisedlému způsobu života mechanismy adheze k povrchům: • reverzibilní – van der Waalsovy síly • irreverzibilní – chemická vazba (elektrostatická, kovalentní, vodíková) 3 Růstový cyklus Caulobacter crescentus Caulobacter - je modelovým organismem pro studium diferenciace u prokaryot 4 5 Stádia růstového cyklu 1. bičíkaté, volné stádium (swarmer cell) – nerostoucí, nepodléhá dělení • bičíkatá dceřinná buňka 2. stélkaté přisedlé stádium – reprodukční • „nezkušená buňka“ – ještě se nedělila (inexperienced cell) • „zkušená buňka“ – již „vyprodukovala“ dceřinnou pohyblivou buňku Plovoucí bičíkatá buňka se nereplikuje odhození a nahrazení bičíku a pilusů polární stélkou, která přichytí buňku k podkladu Nezralá stélkatá buňka se prodlužuje přisednutí na místo s vhodným substrátem a diferenciace Poté iniciace replikace DNA. Reproduktivní stélkatá buňka replikuje DNA, vznik dceřinné buňky, syntéza nového bičíku na pólu proti stélce. 6 7 8 Strukturální analogy aktinu (MreB) - předurčení tvaru buněk C. crescentus, Escherichia coli, Bacillus subtilis Protein buněčného dělení FtsZ, je protipólem tubulinu Crescentin – podobný intermediáním filamentům – helixy a zakřivení 9 10 Zvláštnosti růstového cyklu 1. růstová stádia se nutně střídají, žádné není alternativou, která se nemusí realizovat (viz klidová stádia) 2. mateřská buňka je v jistém slova smyslu „nesmrtelnou buňkou“, která produkuje velké množství dceřinných buněk (na rozdíl od konvenčního dělení, kde nelze striktně odlišit mateřskou a dceřinnou buňku) 11 Růstový cyklus Sphaerotilus natans 12 • volné buňky najdou vhodné životní prostředí • přichytí se k podkladu • odhodí bičík • začnou tvořit pochvu • dělí se uvnitř pochvy • z pochvy se uvolňují dceřinné pohyblivé buňky 13 Střídání volného a přisedlého stadia u Actinoplanes • přisedlé stadium – vegetativní mycelium, množící se • volné stadium – bičíkaté spory, které se tvoří ve sporangiu (zoospory) Biofilm …společenství buněk usazených v glykokalyx, přichycených k povrchu nebo okolním buňkám, se změněným fenotypem růstu Biofilm … volně plovoucí (planktonické) buňky usazené (na vhodném povrchu) v matrix z polysacharidů formující „hřibovité“ útvary s dutinkami, kanálky a stopkami. Složky biofilmu: bakteriální buňky a jiné organizmy uvnitř hřibovitých shluků propojených kanálky a póry. Jednodruhový – př: aerob P. aeruginosa – mnohem tenčí biofilm než vícedruhový. Vznik biofilmu 16 Vznik biofilmu – přizpůsobení přisedlému způsobu života Mechanismy adheze: adhesiny, fimbrie – curli, glykokalyx • Reverzibilní – van der Waalsovy síly – slabé vazby • Irreverzibilní – chemická vazba (kovalentní, vodíková) - přítomnost extracelulárních polymerů Změna fenotypu - ustává syntéza bičíků, mukózní látky Spouštěcí podněty: • Osmotický tlak • Snížený obsah kyslíku • Rostoucí hustota poulace - quorum sensing např: acyl-homoserin lakton (G-), malé peptidy (G+) 17 • Po přichycení změna vlastností: - zprvu na úrovni regulace genů - 1/3 bílkovin se produkuje v rozdílném poměru, více tvořeny bílkoviny 1) pórů 2) transportní 3) syntetizující mimobuněčnou hmotu • Po přichycení nutno vytvořit matrici z polysacharidu - př: P. aeruginosa - alginát, již 15 minut po přisednutí 19 buněčné povrchy x povrchy podkladu Buněčný náboj Adheze buňky Prostředí Souvislost mezi cytologickými znaky a proměnlivými formami existence buňky – v závislosti na kontaktu, receptorech, substrátu, prostředí... Fáze vzniku biofilmu: přilnutí k povrchu 20 21 Povrch substrátu Hydrodynamické vlivy Adheze buněk k povrchu je ovlivněna: • hrubostí • chemickým složením • povrchovou úpravou • biofilmy vznikající v pomalu proudící tekutině izotropní struktury • biofilmy vznikající v rychleji a jednosměrně proudící tekutině vláknité zřetelně nasměrované útvary buněk 22 Dostupnost živin 23 Stabilita biofilmu mechanismy vazby buněk - EPS, DNA, bílkoviny, fimbrie, bičíky, fágy disperzi biofilmu ovlivňují: • dostupnost živin • množství kyslíku • pH • přítomnost chemických sloučenin • proudění tekutiny • „surface sensing“; ne všechny buňky na všechny povrchy • Roli hrají: - vhodné receptory a kompatibilita s cílovou molekulou (C. diphtheriae - epitel hrdla; S. salivarius – zub, chlopně...) - hydrofobicita buněčného povrchu • Interakce buňky s povrchem indukuje změnu exprese genů buněčné morfologie, motility a adheze 25 Pseudomonas aeruginosa Signalizace mezi buňkami podmíněná jejich koncentrací. Integrace signálů z prostředí - předávány buněčnými transdukčními mechanismy. • Koordinace genové exprese v závislosti na místní hustotě populace • Podobně činí některé sociální druhy hmyzu, kde používají quorum sensing ke kolektivním rozhodnutím, např. kde vybudovat hnízdo. Fáze vzniku biofilmu: Quorum – sensing 26 Quorum - sensing • Soustava malých organických molekul, které jsou buňkou tvořeny v závislosti na koncentraci jich samotných v prostředí • Buňka tak reaguje na hustotu populace • Kaskáda reakcí po vazbě na receptor spouští syntézu sekundárních metabolitů a komunikaci v rámci bakt. společenstva • Vnitrodruhová organizace komunity 27 28 • U planktonních bakteriálních populací může upozorňovat na stres a jako ochranu zahájit tvorbu biofilmu, který je vůči němu odolnější. • Může kontrolovat velikost a hustotu biofilmu a případně podněcovat disperzi nebo rozklad buněčných subpopulací. • Může působit na chování buněk v biofilmu a indukovat nebo potlačovat např. sekreci EPS a adhezinů či pohyblivost jednotlivých skupin buněk, což ovlivňuje strukturu biofilmu. 29 G+ 30 G- Quorum – sensing - regulace luminiscence u Vibrio fischeri 31 LuxI produkuje autoinduktor N-(3-oxohexanoyl)-homoserinelactone • Načasování rozmístění faktorů virulence v hostiteli je kritický bod – patogen se může hromadit bez vykazování faktorů virulence • Více než 4% z téměř 6 000 genů P. aeruginosa regulováno pomocí quorum-sensing • Dva QS systémy – Las (indukce Rhl) Rhl (indukce genů virulence) 32 Quorum – sensing - regulace luminiscence u Pseudomonas aeruginosa Rezistence k ATB Vnitřní mechanismy rezistence: omezená difuze antibiotik biofilmem metabolická aktivita bakterií v biofilmu perzistentní buňky Omezená difuze antibiotik biofilmem Metabolická aktivita bakterií v biofilmu 35 Perzistentní buňky Podle teorie perzistentních buněk („perzisters“) přežívá malá subpopulace bakterií i radikální léčbu antibiotiky poté, co tyto buňky přechází do dormantního stádia podobného sporám. Početná populace…. • Přenos genů - až 1000x úspěšněji než u buněk planktonických • Fenotyp buněk - rytmicky se mění - po odplavení si zachovají urč. dobu vlatnosti jako v biofilmu (R) • Odplavení - aktivace genu pro syntézu enzymu štěpícího matrici 36 Studium biofilmu • Jsme na čipu/v mikrotitračních destičkách schopni napodobit podmínky přirozeného prostředí biofilmu pro studovanou populaci buněk? (průtok; živiny; chem. Složení; množství kyslíku • Vykazují buňky vůči sobě stejné interakce jako v přirozeném prostředí? (poté indukce genů...ovlivnění složení/chování populace buněk...) • Druhové zastoupení? V prostředí vyšší selekce – více vnějších faktorů... • Sbírkové kmeny? Z prostředí? 37 Studium struktury – větš. u G• polysacharidová glykokalyx • mikroskopie: - světelný mikroskop: obtížné - elektronový: nepracuje se živými buňkami - konfokální: - plochy ve zvolené hloubce - z řezů skládána struktura - řádkovací elektronoptická technika… Studium složení - studium přítomnosti genů/látek souvisejících s tvorbou biofilmu - mikrotitrační destičky, mikročipy, sondy, PCR, hmotnostní spektrometrie.... Studium biofilmu 38 Shewanella biofilm – konf.mikr. Horniny a bakterie - koevoluce • Složení minerálů ovlivňuje počet a diverzitu mikrobů • Síru oxidující bakterie silně okyselují prostředí a tvoří póry • Závisí tvorba biofilmu hornin na jejich složení? 39 Zubní povlak Střevní sliznice Biofilm v lidském těle 40 Chronické infekce – dýchací cesty - ušní infekce - močové cesty - chronický zánět prostaty Infekce – sliznice nebo uvnitř tkáně - endokarditida - rány; bércové vředy; spáleniny Biofilm skloviny 700 kmenů z 18ti rodů Mezibuněčný kontakt – role adhezinů (lektiny) a receptorů (sacharidy) Kontak s povrchem zubu – pelikula proteinů, lektiny... (Rickert et al. 2003) 41 Morfologické struktury orálního biofilmu “corncobs” – koky koagregující s vláknitými bakteriemi 42 “rosette” - 1 kok koagregující s koky jiného typu Cévky – arteriální, žilní Močové katetry Dýchací a dializační přístroje Umělé chlopně Kontaktní čočky Děložní tělísko Biofilm a medicína Bakterie jsou unášeny proudem krve a mohou začít infekční proces na odlehlém místě…. Vytrvalá syntéza a uvolňování toxinů… Nemusí být kontakt s vnějškem! - kovové náhrady kloubů 44 Výhody přisedých stadií: • lepší dostupnost a využitelnost substrátu - adsorpce makromolekul a malých hydrofobních molekul na povrch - lepší využitelnost koncentrovaných živin • ochrana před inhibičními účinky antibakteriálních látek (antibiotika, chlor, těžké kovy) • ochrana před bakteriofágy a parazitickými bakteriemi Nevýhody přisedých stadií: • sedimentace, vyčerpání živin a neschopnost kolonizovat nové, vhodnější prostředí • konzumace substrátu (částic) zooplanktonem • vznik gradientů – živiny, kyslík 45