Akvatická ekotoxikologie Testování •EXPERIMENTÁLNÍ HODNOCENÍ EKOTOXICITY 1 •Poznání efektů, •které působí přítomnost stresorů na organismy v prostředí • - suborganismální úroveň - laboratorní experimenty studium mechanismů toxicity látek, in vitro biomarkery, odhady míry subletální toxicity specifických typů (dioxinová toxicita, xenoestrogenita ...) - - jednotlivé druhy organismů, jednotlivci - laboratorní experimenty •tradiční ekotoxikologické biotesty s jednotlivými druhy organismů, porovnání citlivosti různých druhů ... •- polní manipulované studie (in situ) studie s jednotlivými druhy - pěstování rostlin na kontaminovaných a kontrolních plochách, klecové experimenty v akvatickém prostředí (měkkýši, ryby) - •Experimentální stanovení ekotoxicity •Poznání efektů, •které působí přítomnost stresorů na organismy v prostředí • - populační efekty -laboratorní testy •dlouhodobější experimenty – celoživotní testy toxicity,testy s časnými vývojovými stadiemi, rostliny – rozmnožování, klíčení ..., bezobratlí – obratlovci – testy reprodukční toxicity • - efekty ve společenstvech -laboratorní mikrokosmy uměle ustavená společenstva organismů různých druhů za definovaných podmínek (producenti – konzumenti – destruenti) - terénní vícedruhové manipulované studie in situ •polní studie, akvatické mezokosmy (tekoucí, stojaté, litorální – příbřežní • •- ekosystémové efekty • - terénní pozorování – hodnocení efektů v populacích a společenstvech v reálné přírodní situaci •Experimentální stanovení ekotoxicity 1 • •laboratoř •Hlavním požadavkem ekotoxikologické studie •je průkaz KAUZALITY mezi expozicí a efektem • • •Praktické stanovení ekotoxicity • • - laboratorní jednodruhové biotesty • • - laboratorní mikrokosmy • • - manipulované a kontrolované mezokosmy • - polní studie • • - reálné ekosystémy •METODY HODNOCENÍ EFEKTŮ •obtížnost průkazu KAUZALITY • • •Pro srovnání toxicity různých látek (vzorků) se užívají odvozené parametry • •1) hodnoty odvozené pro 50% efekt • -odhady v oblasti 50% efektů zatíženy nejmenší chybou, - -nejčastější • LC50 – koncentrace (C) způsobující 50% letalitu (L) • LD50 – dávka (Dose) • EC50 – koncentrace způsobující 50% efekt (E) • IC50 – koncentrace způsobující 50% inhibici (I) •Vztahy Dávka - Odpověď •Srovnání toxicity látek •Problém - různé směrnice křivky Dávka-Odpověď •Pro dobrou interpretaci – uchování celé křivky - - •Příklad: • •Na základě EC50 je toxičtější látka 1 • • ALE • •látka 2 vykazuje efekty ve významně nižších koncentracích •Vztahy Dávka - Odpověď •50% •0% •100% •1 •2 •koncentrace •efekt •Křivka dávka - odpověď • •2) další odvozené parametry • • ECx (x=1,5,10,25,75,90,99 ...) • • LOEC/L Lowest Observable Effect Concentration/L • • NOEC/L No Observable Effect Concentration/Level • • NOAEC/L No Observable Adverse Effect Concentration/Level • • MTC Minimum threshold concentration • • MATC Maximum Acceptable/Allowable Toxicant Concentration • = geometrický průměr NOEC a LOEC • •Vztahy Dávka - Odpověď •Vyjádření KONCENTRACÍ při hodnocení TOXICITY • •(1) čisté látky a definované směsi látek (barvy, produkty chemické výroby ...) • KONCENTRACE – mg/L, mmol/L (=mM) • •(2) extrakty vzorků z prostředí • - KONCENTRACE EXTRAKTU (% ředění ...) • - KONCENTRACE původní matrice • př. sediment – extrakce organickými rozpouštědly - Extrahovatelný Organický Materiál, koncentrace v testu toxicity – mg EOM / mL • • •Vztahy Dávka - Odpověď •Vyjádření KONCENTRACÍ při hodnocení TOXICITY • •(2) vzorky z prostředí - přírodní matrice • • voda, odpadní vody • - koncentrace : % ředění - ev. jen srovnání efektu odpadní voda vs. kontrola • • pevné matrice – sedimenty • - % ředění – existují postupy míchání/ředění • - nejčastěji srovnání efektů s negativní kontrolou (+ / -) • •Vztahy Dávka - Odpověď •Vzorky v prostředí – KOMPLEXNÍ SMĚSI • •- Látky ve směsích mají ve srovnání s čistými – izolovanými – látkami odlišné biologické vlastnosti (vč. toxicity) • - ADITIVITA / SYNERGISMUS / ANTAGONISMUS • • •(1) ADITIVITA • - princip kumulativní toxicity • - základní ADITIVNÍ MODEL •- nejčastější u látek s "nespecifickým" mechanismem toxicity (polární narkoza) • Př. látka 1 vyvolá v koncentraci c1, efekt 25% • látka 2 vyvolá v koncentraci c2, efekt 30% • směsný roztok L1 a L2 v koncentracích c1 a c2 vyvolá efekt 55% (25 + 30) •Vztahy Dávka - Odpověď •Vzorky v prostředí – KOMPLEXNÍ SMĚSI • •(2) SYNERGISMUS • - látky ve směsi se vzájemně potencují • - efekt po působení směsi je vyšší než podle předpovědi aditivního modelu • - u látek se specifickými biologickými-toxikologickými vlastnostmi • •Příklad •Toxicita pro Ryby: současné působení detergentu (snížení povrchového napětí na membránách žaber) a polární látky - inhibitoru mitochondriální respirace (samotný jen obtížně vstupuje do buňky ALE v přítomnosti detergentu -> rychlý vstup, významný toxický efekt) • • •Vztahy Dávka - Odpověď •Vzorky v prostředí – KOMPLEXNÍ SMĚSI • •(3) ANTAGONISMUS • - látky ve směsi vzájemně inhibují toxický efekt • - efekt po působení směsi je menší než podle předpovědi aditivního modelu • - u látek se specifickými biologickými-toxikologickými vlastnostmi • •Příklad •Současné působení neurotoxinů s různým mechanismem (princip "protijedů") – Veratridin (otevření membránových kanálů pro Na+/K+) • - Saxitoxin (inhibice kanálů) • •Vztahy Dávka - Odpověď •AKVATICKÉ PROSTŘEDÍ • •Akvatické testy s bezobratlími jsou velmi běžné, někdy je ekotoxikologie zaměňována s "Daphniovými biotesty" • -uspořádání -kádinky, akutní testy 48 h, prolongované testy 21 d, hodnocení letality, růstu ... -krátkodobé - zpravidla statické •Akvatičtí planktonní korýši - nejčastější •Daphnia magna, Ceriodaphnia dubia •Artemia salina (mořská) • •Další bezobratlí •bentičtí – Gammarus, Hyallela azteca •hmyz – Pakomáři (Chironomus), jepice ... •Ekotoxikologické biotesty – konzumenti - bezobratlí figure4 figure4 •Daphnia magna figure4 •Artemia salina •Ceriodaphnia dubia 1 •Gammarus figure4 •Chironomus riparius •AKVATICKÉ PROSTŘEDÍ • •ALTERNATIVNÍ MIKROBIOTESTY ("toxkity") s bezobratlími •www.microbiotests.be • • •Ekotoxikologické biotesty – konzumenti - bezobratlí •PŮDA + SEDIMENTY • •Alternativní mikrobiotest TOXKIT (www.microbiotest.be) • • •Ekotoxikologické biotesty – konzumenti - bezobratlí Sbírky a kultivace řas algalabsmall algal1 algacult wegerh algae1 alpha_1 sbirka FlaskSeedCulture Selenastrum Scenedesmus scen_acumi Scenedesmus chorell1 chlorella minor_1 microcystis%25202 •Řasy a sinice jako testovací organismy •EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY - PŘÍKLADY – - - KONZUMENTI – OBRATLOVCI – figure4 •AKVATICKÉ PROSTŘEDÍ - RYBÍ biotesty • -uspořádání -akvária - akutní testy 96 h, - prolongované a embryolarvální testy dny až měsíce - hodnocení letality, růstu, rozmnožování, testy karcinogenity (nádory), testy xenoestrogenity (vývoj oboupohlavníků) •- různá uspořádání (statické, průtočné ...) •Rybí druhy •Pstruh duhový, Živorodka duhová (paví očko), Karas, Kapr, Střevle (Pimephales promelas) • •Specifické testy (endokrinní disrupce, karcinogenita) •Halamčík rýžovištní – Japanese medaka •Ekotoxikologické biotesty - obratlovci figure4 •AKVATICKÉ PROSTŘEDÍ • •FETAX – Frog Embryo Teratogenicity Assay Xenopus • Drápatka (Xenopus laevis) - -uspořádání - toxikologie – experimenty s vajíčky, embryi a larvami - petriho misky - 96 h (dosažení stadia larvy bez žloutk. vaku) • • 1 1 1 1 •Ekotoxikologické biotesty - obratlovci •Byly vypracovány postupy pro hodnocení ekotoxicity ve složitějších – vícedruhových uspořádáních • - simulace přírodních podmínek - model ekologických vztahů mezi organismy (potravní řetězce) - hodnocení nepřímých efektů (likvidace producentů -> další efekty v celém ekosystému) • •Experimentální uspořádání - podle velikosti (nezcela jednoznačné limity) • : mikrokosmy • voda - do 1 m3 stojaté, nebo 1 m tekoucí • : mezokosmy • •- podle umístění – laboratorní kontrolované podmínky vs. přírodní •Vícedruhové hodnocení ekotoxicity 1 •Praktická realizace (principy stejné s biotesty) • •(1) Biologický systém • - Příprava, osazení, aklimatizace • - Kontrolní varianta • - Jedna nebo více (více koncentrací) exponovaných variant • - Definovaný počet opakování (replicates) - nutné – složitější systémy – větší variabilita (! i u kontrol) • •(2) Expozice • - Dávkování • - přímo do vodní fáze (vodní mikrokosmy), postřikem na povrch (simulace přirozené aplikace pesticidů), řada dalších možností, jednorázové opakované ... • - Doba expozice – podle typu mikro/mezokosmu – týdny až roky • •(3) Hodnocení parametrů, srovnání kontroly vs. expozice •Vícedruhové hodnocení ekotoxicity •Příklad – laboratorní akvatický mikrokosmos 1 1 •Příklad – laboratorní akvatický mikrokosmos figure4 1 •Příklad - - požadavky •na laboratorní •mikrokosmos • - model stojatého •(lenitického) ekosystému •Příklad - - jednoduchý •laboratorní •akvatický mikrokosmos • •- simulace tekoucích vod 1 1 1 •Příklad – akvatický mikrokosmos s makrofyty •Příklady – •venkovní plovoucí mikrokosmy 1 1 •Příklady – litorální mezookosmos •Polní studie, biomonitoring • •vzorkování – odběry abiotických vzorků figure4 •Voda figure4 1 •Sediment figure4 figure4 •Eckmanův •drapák figure4 •Polní studie, biomonitoring • •AKVATICKÉ PROSTŘEDÍ •– odběry biotických vzorků - •Planktonní síťky figure4 figure4 figure4 •Periphyton – nárosty, biofilmy figure4 •Polní studie, biomonitoring • •AKVATICKÉ PROSTŘEDÍ •– odběry biotických vzorků - •Bentičtí bezobratlí figure4 figure4 •Ryby figure4 figure4 figure4 Mezokosmy pro ekotoxikologické testování přípravků proti sinicím • P1010075 P1010076 P1010030 P1010028 P1010020 P1010012 •Microcosm experiments - 250 l •Tested substances: •Natutal compounds •Floculants •Fe-chelators •Enzymatic •ROS producers .Mezokosmy s přírodními sedimenty v přírodních podmínkách – 17.000 l J •fotodokumentace P1010149 P1010145 P1010144 Positions of mezocosms plumlov21 •20 •19 •18 •17 •16 •14 •13 •15 •7 •12 •11 •10 •9 •8 •1 •6 •5 •4 •3 •2 •..with natural reinvasion •of Microcystis colonies •from sediments •Příklady – venkovní mezokosmy – tekoucí voda 1 1 •Příklady – venkovní mezokosmy lenitické 1