Přehled metod pro kvantifikaci biomasy planktonních cyanobakterií (sinic)
Doc. Ing. Blahoslav Maršálek, CSc.
Jakub Gregor, Ph.D.

Biomasa?
oJe např. koncentrace chlorofylu-a parametrem biomasy sinic?
oVztah biomasa vs. obsah fotosynt. pigmentů
oCo vlastně stanovujeme?
oSrovnatelnost?

Hádky mezi odborníky o používání termínu biomasa
Kolísání množství pigmentů v závislosti na okolních podmínkách (světlo, živiny, teplota, stáří
populace)

Kvantifikace fytoplanktonu
oPočty organismů
oMikroskopie
oAnalýza obrazu
oPrůtoková cytometrie
oKoncentrace pigmentů
oSpektrofotometrie
oFluorometrie
oChromatografie
Molekulárně biologické metody

1.  Mikroskopické analýzy
oIdentifikace taxonů
oPočty buněk / ml
P1010020small
Foto: Kubíček (CCT), pózuje Haňulka (CCT)

Mikroskopické analýzy
oVýhody:
oPodrobná identifikace druhů
o
oNevýhody
oNáročnost na čas a lidské zdroje
oStatistická chyba při počítání, variabilita
oPřehlédnutí pikocyanobakterií

Mikroskopické analýzy
oFluorescenční mikroskop
oOdlišení sinic od řas
o… a léta praxe

Analýza obrazu
oSoftwarová analýza mikroskopických snímků
oFluorescence
oObjemová biomasa různých skupin
oKombinace s průtokovou cytometrií – FlowCAM
image-analysis-mensi
Zdroj: Walker et al. (2002) Journal of Microbiological Methods 51, 149–162

Flowcam – průtok částic kolem kamery, snímkování a kategorizace

Průtoková cytometrie
oKategorizace částic podle tvaru, velikosti, fluorescence
oÚroveň rodů a druhů?
oProblém velkých kolonií
oSpeciální průtokové cytometry na fytoplankton
Zdroj: Becker et al. (2002) Cytometry 48, 45–57

In situ aplikace, ponorné flowcytometry s bezdrátovým spojením

Průtoková cytometrie
oKvantifikace koloniálních druhů (Microcystis)
Frequency distribution of field sample containing Microcystis aeruginosa

snímání tvaru kolonie
počty buněk v kolonii – z poměru fluorescence 1 buňky a celé kolonie

2. Kvantifikace pigmentů
Spektrofotometrie
oAbsorbance in vivo
orůstové experimenty, biotesty
oExtrakty
ochlorofyl-a
ofykobiliproteiny

Spektrofotometrie
oChlorofyl-a
oCelkový fytoplankton
oExtrakce org. rozpouštědlem (ethanol, methanol, aceton)
oISO 10260
o
oFykobiliproteiny
oFykocyanin – sinice
oExtrakce fosfátovým pufrem
oObtížná a zdlouhavá extrakce

týká se extraktů:
chl-a – řada metod, ISO není úplně vyhovující, velké rozdíly podle rozpouštědel, interference
dalších pigmentů
fykocyanin – obtížný rozklad buněk sinic, např. opakované zmrazení a zahřátí, enzymatický atak
buněčných stěn (lyzozym), extrakce trvá několik hodin (až 24)

Fluorometrie
oExtrakty
oMéně časté
oChlorofyl-a, fykobiliproteiny
oProces extrakce stejný jako u spektrofotometrie
oFluorescence in vivo
oVhodné pro in situ a on-line aplikace
oPodrobněji v příspěvku J. Gregor & B. Maršálek

In vivo fluorescence řas a sinic
oSinice – fykocyanin
oexcitace 590-630 nm
oemise 640-660 nm
oEukaryotické řasy – chlorofyly, karotenoidy
oexcitace 440-530 nm
oemise 680-690 nm

Ponorné fluorescenční sondy
oPonorné fluorometry + PC
oOn-line data
FP-schema FP-foto

Ponorné fluorescenční sondy
FP-ukazkovy_graf leg
Gregor and Maršálek, 2004, Water Research

Chromatografie
oKomplexní analýza pigmentů
oProblém rozpustnosti chlorofylů a karotenoidů oproti fykobiliproteinům
oRozlišení skupin na základě charakteristických pigmentů, kvantifikace v mg/l chl-a
oCHEMTAX - program určený pro kvantifikaci skupin fytoplanktonu na základě HPLC analýz; definovaný
poměr charakteristických pigmentů a chl-a pro jednotlivé skupiny
o

CHEMTAX –

Chromatografie



Chromatografie
oVhodné pro eukaryotický fytoplankton
oSinice – zeaxanthin (fotoprotektivní karotenoid)

množství zeaxanthinu kolísá podle světelných podmínek, špatné korelace vůči počtům buněk, množství
fykocyaninu nebo fluorescenci.

Dálkový průzkum Země
oAVHRR
nsatelitní snímky
oLIDAR
nLIght Detection And Ranging
nExcitace laserovým paprskem
nSnímání emisního spektra

Dálkový průzkum Země
AtlanticBloom_S2002131_sml lidar


3. Molekulární biologie
o16S rRNA   pro identifikaci kmenů sinic
oDGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) pro stanovení diverzity  a struktury přírodních
populací vodních květů sinic
oDNA-array Technology- lze rozeznat různé genotypy sinic (toxické a netoxické populace)
o
o+  nevyžadují dlouhodobé zkušenosti
o-  vyžadují specielní vybavení

Závěr:
ov praxi se běžně používá parametr chl. a
odále převládají mikroskopické metody
ovelmi perspektivní a prověřená metoda je kvantifikace in situ  pomocí fluorescenčních profilů
oVždy je nutno zvážit účel, čas, variabilitu a celkovou přesnost metody