Laboratorní praktikum z půdní
ekotoxikologie
Doc. RNDr. Jakub Hofman, Ph.D.
Mgr. Jana Vašíčková, Ph.D.
Mgr. Dana Trávníčková
Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí
Masarykova Univerzita, Přírodovědecká fakulta
Brno, Česká Republika
2016
Laboratorní praktikum půdní ekotoxikologie
2
Obsah
1 CÍLE PRAKTIKA ............................................................................................................................ 3
2 BEZPEČNOST PRÁCE V LABORATOŘI ..................................................................................... 4
3 MATERIÁL A POMŮCKY .............................................................................................................. 5
4 ORGANIZACE CVIČENÍ ................................................................................................................ 6
5 PŘÍPRAVA ARTIFICIÁLNÍ PŮDY, PŘÍDAVEK TESTOVANÝCH LÁTEK ................................... 7
5.1 OVĚŘENÍ PH............................................................................................................................. 7
5.2 MĚŘENÍ WHCMAX A OVLHČENÍ PŮDY ........................................................................................... 8
5.3 PŘÍDAVEK KONTAMINANTŮ DO PŮDY .......................................................................................... 8
6 CHOV A TEST S ROUPICÍ ENCHYTRAEUS CRYPTICUS.......................................................... 9
6.1 ZALOŽENÍ CHOVU...................................................................................................................... 9
6.2 POSTUP TESTU......................................................................................................................... 9
6.3 VYHODNOCENÍ TESTU – ZPŮSOB Č.1........................................................................................ 10
6.4 VYHODNOCENÍ TESTU – ZPŮSOB Č.2........................................................................................ 10
7 CHOV A TEST S CHVOSTOSKOKEM FOLSOMIA CANDIDA................................................. 11
7.1 ZALOŽENÍ CHOVU.................................................................................................................... 11
7.2 POSTUP TESTU....................................................................................................................... 11
8 TEST INHIBICE KOŘENE SALÁTU LACTUCA SATIVA.......................................................... 13
8.1 PŘEDKLÍČENÍ SEMÍNEK............................................................................................................ 13
8.2 POSTUP TESTU....................................................................................................................... 13
9 CHOV A TEST S HLÍSTICÍ CAENORHABDITIS ELEGANS...................................................... 14
9.1 ZALOŽENÍ CHOVU.................................................................................................................... 14
9.2 POSTUP TESTU....................................................................................................................... 14
10 VYHODNOCENÍ ZÍSKANÝCH VÝSLEDKŮ, KŘIVKY DÁVKA-ODPOVĚĎ ............................... 15
Laboratorní praktikum půdní ekotoxikologie
3
1 Cíle praktika
Cílem tohoto praktika je naučit vás postupy pěti půdních ekotoxikologických testů, které se
dnes stávají nenahraditelné při hodnocení chemických látek, pesticidů, hnojiv, odpadů, kalů,
kontaminovaných půd a sedimentů. Postupy, s nimiž se seznámíte, vychází z následujících
standardů a reflektují dosavadní zkušenosti výzkumníků centra RECETOX s nimi.
 ISO 11268-1 (1993): Soil quality. Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida) Part
1: Determination of acute toxicity using artificial soil substrate. International
Organization for Standardization, Geneve, Switzerland.
 ISO 11268-2 (1998): Soil quality. Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida) Part
2: Determination of effects on reproduction. International Organization for
Standardization, Geneve, Switzerland.
 OECD Test No. 222 (2004): Earthworm reproduction test (Eisenia fetida/andrei).
OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. Organisation for Economic
Cooperation and Development, Paris, France.
 ISO 11267 (1999): Soil quality. Inhibition of reproduction of Collembola Folsomia
candida) by soil pollutants. International Organization for Standardization, Geneve,
Switzerland.
 ISO 16387 (2004): Soil quality. Effects of pollutants on Enchytraeidae (Enchytraeus
sp.) - Determination of effects on reproduction and survival. International
Organization for Standardization, Geneve, Switzerland.
 OECD Test No. 220 (2004): Enchytraeid reproduction test. OECD Guidelines for the
Testing of Chemicals. Organisation for Economic Cooperation and Development,
Paris, France.
 ISO 11269-1 (1993): Soil quality: Determination of the effects of pollutants on soil
flora – Method for the measurement of inhibition of root growth. International
Organization for Standardization, Geneve, Switzerland.
 ASTM Standard E 2172-01 (2001): Standard guide for conducting laboratory soil
toxicity with the nematode Caenorhabditis elegans. Annual Book of ASTM Standards
11:1606 - 1616.
Prostudujte si všechny návody a také pokyny k bezpečné práci v laboratořích před
započetím vlastního praktika. Materiál a metody si před jednotlivými cvičeními projděte.
Během praktika si dělejte poznámky a zapisujte zejména všechny detaily k prováděným
postupům a výsledkům. Kdykoliv něco nevíte, zeptejte se vyučujících a pamatujte na úsloví
„dvakrát měř a jednou řež“. Některé části uvidíte pouze demonstrativně, avšak hlavní část –
vlastní testy toxicity - budete po zaškolení do jednotlivých metod provádět samostatně.
Na konci cvičení odevzdáte protokoly z celého cvičení, na základě nichž a na základě vaší
docházky do praktik dostanete zápočet. Protokoly odevzdá každá skupina (ne jednotlivci) pro
všechny prováděné testy. Protokol musí obsahovat: 1) název, seznam studentů ve skupině,
krátkou úvodní část, 2) stručný popis postupu, kde dát důraz zejména na rozdíly oproti
postupům v těchto návodech, 3) všechny výsledky skupiny přehledně uspořádané do
tabulek, 4) zpracované výsledky (skupiny, či případně i výsledky ostatních skupin) –
průměry, SD, RSD, grafy dávka-odpověď, odhad NOEC, LOEC, LC50 a EC50, 5)
Interpretace výsledků, možné příčiny chyb, odchylek, závěr.
Laboratorní praktikum půdní ekotoxikologie
4
2 Bezpečnost práce v laboratoři
 Následující pokyny nenahrazují pokyny závazné v rámci Univerzity a Fakulty
(http://www.rect.muni.cz/nso/, zejména část věnovaná BOZP a chemickým látkám), jste
povinni si je prostudovat a dodržovat je.
 V laboratoři se smíte pohybovat pouze, jste-li oblečeni v laboratorním oděvu (tj. plášť a při
delším pobytu i laboratorní kalhoty a košile). S půdou, chovnými substráty a chemickými
látkami pracujte pouze v pryžových rukavicích.
 Do laboratoře si nenoste oblečení ani zavazadla, nechte je k tomu určené šatně. V laboratoři
nesmíte konzumovat jídlo, pít nápoje a kouřit.
 Před započetím prací v laboratořích budete seznámeni, kde jsou prostředky první pomoci a
hasicí přístroje. Tato místa si zapamatujte.
 Před vlastní manipulací s chemickými látkami a kontaminovanou půdou budete upozorněni
vyučujícím na případná rizika, způsob manipulace a osobní ochrany zdraví. I přesto si můžete
prostudovat bezpečnostní pokyny k těmto látkám v některé z internetových databází (např.
http://www.sci.muni.cz/php/eurochemnet/; www.atsdr.cdc.gov; www.inchem.org;
www.tera.org/iter; www.piskac.cz/ETD; extoxnet.orst.edu; toxnet.nlm.nih.gov)
 Se všemi chemikáliemi nakládejte tak jak to uvádí pokyny na etiketách látek plus pokyny
vyučujícího a údaje získané z toxikologických databází.
 Studentky v jiném stavu nesmí navštěvovat praktika.
 Při pipetování využívejte mikropipet či skleněných pipet s násadci a nikdy nepipetuje ústy.
 Odpady ze cvičení obsahující chemické látky likvidujte způsobem dle pokynů vyučujícího.
Nikdy je nevylévejte do výlevky a neodhazuje do koše. Kontaminovanou půdu ukládejte do
určených nádob.
 Co nejdříve po práci umyjte veškeré používané sklo náležitým způsobem (např. detergent
lázeň, horká voda, destilovaná voda, sušárna) a vraťte je na své místo. Plasty dle pokynů
vyučujícího buď vyhazujte do odpadů, nebo umývejte. Stejně tak další materiál a pomůcky po
práci vracejte na své místo.
 Při úrazu jste povinni jej nahlásit vyučujícímu.
 S přístroji zacházejte opatrně a podobně také se sklem - vždy lépe pomalu a promyšleně, než
rychle a bez uvážení.
 Při práci s potenciálními patogenními mikroorganismy (E. coli v kultuře hlístic a hnůj v chovech
žížal - tetanus) věnujte zvýšenou pozornost své ochraně formou rukavic a mytí rukou po práci.
 Při rozsypání nebo rozlití škodlivé látky ihned informujte vyučujícího a okamžitě zajistěte její
zneškodnění.
 Při potřísnění kůže žíravými látkami co nejdřív začněte oplachovat postižené místo dostatkem
teplé vody (asi 30 - 35º C) po dobu 10 – 15 min. Informujte vyučujícího.
 Při zasažení očí chemickými látkami, zejména žíravými, vyplachujte oči 10 – 15 min proudem
vody či fyziologického roztoku. V laboratoři jsou k dispozici oční sprchy pro tento případ
nehody. Informujte vyučujícího.
 Při náhodném požití chemikálií vyvolejte zvracení, vypijte dostatečné množství vody a opět
vyvolejte zvracení (nesmí se použít při požití žíravin či tenzidů). Následně užijte aktivní uhlí
z lékárničky – použijte desetinásobek předpokládaného požitého množství chemikálie.
Informujte vyučujícího.
Laboratorní praktikum půdní ekotoxikologie
5
3 Materiál a pomůcky
 vysušená rašelina (zahradnická tř. 1, vrchovištní, pH 3,5 – 5,0, Agro CS) -
defaunizovaná
 kaolinový jíl s obsahem kaolinitu minimálně 30% (Sigma - Aldrich, Kat. č. 18672)
 křemenný písek s minimálně 50% zrn 0,05 - 0,2 mm (Filtrační písky s.r.o., Chlum)
 hnůj kravský suchý granulovaný (Agro CS) či suchý nekontaminovaný koňský hnůj
 zahradní substrát (Agro CS) - defaunizovaný
 vhodné nádoby na přípravu a uchování artificiální půdy
 válečky s fritou vespod na WHC; fotografická miska
 destilovaná voda; CaCO3; roztok 1M KCl na měření pH a pufry
 CdCl2; nerezové mísy a lžíce na kontaminaci půd; sklenice na kontaminované půdy
 plastové boxy na chovy žížal (10 - 20 litrů); krabičky s víčky na testy s žížalami a na
chovy roupic (500 – 700 ml); plastové petriho misky Ø 10 cm a 8 cm; skleničky
s víčky na testy s roupicemi a chvostoskoky (cca 150 ml); plastové zkušební nádoby
s víčky na testy s rostlinami (plocha minimálně 150 cm2
, výška minimálně 5 cm)
 háček z mikrobiologické kličky; agar (Roth); vločky mleté; Bengálská červeň; etanol;
bílá akrylová barva
 sádra, aktivní uhlí, sušené kvasnice, exhaustor, štěteček, miska s mřížkou na
vyhodnocování testu s chvostoskoky
 LB médium: 10 g trypton + 5 g yeast extrakt + 10 g NaCl + 1 ml 1M NaOH doplnit
vodou do 1 litru a autoklávovat
 NGM agar: 3 g NaCl + 17 g bactoagar + 2,5 g bactopeptone + 1 ml cholesterol (5
mg/ml EtOH) + 975 ml H2O a autoklávovat; následně přidat sterilní roztok solí: 1 ml
1M CaCl2 + 1 ml 1M MgSO4 + 25 ml 1M KH2PO4
 Kultura E. coli OP 50
 kónické zkumavky plastové 50 a 15 ml; platinový drátek; koloidní roztok Ludox©
 sada mikropipet různých objemů; váhy s váživostí do několika kg; přesné analytické
váhy; pH metr; vrtačka s míchadlem; třepačky; inkubační místnost; termostat;
sušárna; binokulární mikroskop; autokláv; flow box; sušárna; kahan
 běžné laboratorní sklo - odměrné baňky, válce a kádinky různých objemů; nálevky;
uzavíratelné sklenice různých objemů; porcelánové pohárky, různě velké Petriho
misky, mikrobiologická hokejka
 filtrační papíry archy a kruhové výseče; laboratorní papírové ubrousky
 běžné laboratorní pomůcky – lžičky, kopistky, pinzety, váženky, alobal, potravinářská
fólie, parafilm, špičky na pipety; pasteurky; fixy, lepící páska, nůžky, střičky s vodou a
lihem
 pryžové rukavice – latexové a vinylové; respirátory
Laboratorní praktikum půdní ekotoxikologie
6
4 Organizace cvičení
Filosofií praktika je maximálně samostatná práce studentů. Z povahy a délky jednotlivých
metod vyplývá, že cvičení nemůže probíhat jako pravidelná týdenní výuka. Studentům je
vyučujícím předvedena péče o chovy, za asistence si vlastní chovy hned na začátku
semestru založí a poté se celý semestr o modelové organismy starají sami. Kontaminovaná
půda je připravena vyučujícím, avšak studentům je demonstrativně předvedena jak příprava
artificiální půdy, tak metodika kontaminace půd. Co se týká testů, jsou studentům
demonstrovány všechny klíčové kroky postupů v několikahodinových blocích na začátku
semestru a poté již studenti provedou samostatně všechny testy s připravenou
kontaminovanou půdou. Vyučující pouze kontroluje stěžejní kroky a je během celého
semestru k dispozici při problémech či dotazech. Na konci semestru je hromadný blok
věnovaný vyhodnocení získaných výsledků včetně představení statistických postupů.
Průběh praktika lze tedy shrnout do rámcového plánu:
Enchytraeus
crypticus
Folsomia candida Lactuca sativa
Caenorhabditis
elegans
Blok1
Příprava artificiální půdy a příprava kontaminované půdy (začátek semestru)
o ukázka rašeliny, písku a jílu
o ukázka artificiální půdy suché a mokré, ukázka standardní půdy LUFA 2.2
o ukázka měření WHC a pH
o ukázka přídavku toxické látky do artificiální půdy (Cd jako CdCl2)
Založení chovu (začátek semestru)
o ukázka a pokyny k péči o chovy
o ukázka substrátů a jejich přípravy
o ukázka manipulace s organismy
o studenti si zakládají svůj chov a pečují o něj
během semestru
není není
Bloky1,2,3,4
Předvedení důležitých kroků z postupů testů (začátek semestru)
manipulace s roupicemi
založení testu
co kontrolovat během testu
barvení, Ludox,
fotografování
manipulace
s chvostoskoky
založení testu
co kontrolovat během
testu
flotační metoda
fotografování
založení semínek na
naklíčení
založení testů
podmínky testu
ukončení testu
měření délky kořínků
vyhodnocení výsledk
apod.
manipulace s hlísticemi
založení testu
Ludox extrakce
počítání pod mikroskopem
Samostatnáčást
Realizace testů (nutno začít do poloviny semestru), studenti sami:
o navažují připravenou kontaminovanou půdu do nádob na test
o přidávají organismy a potravu
o během testu kontrolují potravu a úbytek vlhkosti
o do testů s E. fetida a E. crypticus nasazují organismy přímo z chovu, u testu s F. candida je potřeba počítat
s cca 20 dny před testem na synchronizaci
o po 28 dnech od založení testů vyhodnocují mortalitu a reprodukci E. crypticus a F. candida, po 14 dnech
váhové změny a mortalitu u E. fetida
o někdy během semestru provádí test s rostlinami Lactuca sativa
Blok5
Vyhodnocení výsledků u PC (konec semestru)
křivky dávka odpověď, modely a vyhodnocení NOEC, LOEC, LC a EC 50/10
Laboratorní praktikum půdní ekotoxikologie
7
5 Příprava artificiální půdy, přídavek testovaných látek
Artificiální půda dle OECD a ISO norem má složení: 10%
vysušená rašelina přesátá a homogenizovaná přes 2 mm
síto, 20% kaolinový jíl s obsahem kaolinitu minimálně 30%
a 70% křemenný písek s minimálně 50% zrn 0,05 - 0,2
mm. CaCO3 se přidává tak, aby výsledné pH (KCl) bylo 6 ±
0,5. Většinou v množství kolem 0,5%.
 Připravte 20 kg této půdy tak, že do vhodné nádoby
(objem 20 – 40 litrů) navažte 14 kg písku, 4 kg jílu a 2
kg rašeliny.
 Všechny komponenty za sucha důkladně promíchejte,
nejlépe vrtačkou s míchací násadou.
 K jednomu kilogramu směsi přidejte 4 g CaCO3,
zamíchejte, ovlhčete destilovanou vodou na 50%
WHC (jak zjistit WHC půdy viz níže) a opět důkladně
promíchejte.
 Ovlhčenou půdu nechte do druhého dne ustát a
změřte pH půdy postupem níže.
 Pokud je pH nižší než 5,5, přidejte k tomuto kilogramu
další 1 g CaCO3, důkladně zamíchejte, nechte do
druhého dne ustát a opět změřte pH.
 Pokud pH stále nevyhovuje, přidejte další 2 g a
opakujte postup.
 Zjištěný přídavek dostačující na doladění pH(KCl)
mezi 5,5 a 6,5 použijte pro celou várku půdy.
 Ve výjimečných případech je pH s 0,4 % CaCO3 vyšší
než 6,5 a pak nezbývá než postup s jedním
kilogramem opakovat a přidat tentokrát méně CaCO3,
např. pouze 3 g.
5.1 Ověření pH
 Do kónické zkumavky s objemem 50 ml přidejte 5 ml
půdy a doplňte na 30 ml roztokem 1M KCl.
 Suspenzi důkladně třepte po dobu 5 minut.
 Vzorek nechte stát nejméně 2 hodiny a dle návodu pH
metru měřte pH suspenze po důkladném protřepání.
 U pH metru je také kontaktní elektroda přímo na
měření pH vzorku půdy. Můžete změřit pH dostatečně
vlhké půdy pomocí této elektrody. Pozor na to, že
hodnoty pH měřené kontaktní elektrodou jsou o 0,5 –
1 jednotku pH vyšší.
Laboratorní praktikum půdní ekotoxikologie
8
5.2 Měření WHCmax a ovlhčení půdy
Maximální vodní kapilární kapacita půdy (MVK či WHCmax dle angl. Maximum Water Holding
Capacity) je stav, kdy je půda schopna v přirozeném uložení udržet v kapilárních pórech
největší množství vody. Vyjadřuje se v jednotkách objemu vody na gram suché zeminy. Při
takovémto nasycení se vzduch nachází jen v nekapilárních pórech, tedy zemina obsahuje
největší množství vody hygroskopické, obalové a kapilární. Procentuální vyjádření WHC
znamená kolik procent nasycení půdy vodou - maximální WHCmax (100% WHC) - je
požadováno.
 Padesát g suché artificiální půdy umístěte do předem zváženého a vysušeného válečku
s fritou vespod, zeminu poklepte, aby sesedla.
 Válec umístěte do nádoby s vodou tak, aby hladina vody byla asi ve výšce sloupce
vzorku.
 Ve vodní lázni válec ponechte 3 hodiny, poté jej přemístěte na misku s pískem (s
tkaninou na povrchu).
 Miska s pískem a vzorky musí být přikryta, aby se zabránilo vysoušení vzorků.
 Po 3 h zvažte váleček i s půdou. Vážení opakujte po 30 min, a pokud se tato 2 vážení
liší, nechte váleček další hodinu na misce s pískem.
 Vzorek se i s válečkem po zvážení vysušte do konstantní hmotnosti při 105 ± 5 °C a
opět zvažte. WHCmax vypočtěte dle vztahu: WHCmax (ml.g-1
) = (Mvz – Mk – 50) / 50, kde
Mvz je hmotnost nasycené zeminy i s válcem (g) a Mk je hmotnost válce (g).
 Vlhkost artificiální půdy do testů je ideální cca 50 % WHC.
 Vzhledem k tomu, že výchozí artificiální půda je zcela suchá směs stačí WHCmax podělit
dvěmi a vynásobit množstvím ovlhčované půdy v gramech a víte, kolik destilované vody
musíte přidat.
5.3 Přídavek kontaminantů do půdy
Testovaná látka rozpustná ve vodě (v tomto případě kadmium jako CdCl2 . 2H2O) se přidává
do půdy suché jako roztok ve vodě potřebné pro ovlhčení půdy na požadované procento
WHC. Vyučující připraví roztoky o požadované koncentraci a aplikujte je do suché půdy.
Následně půdu s roztoky důkladně promíchá. Připraveno je 2 kg čerstvé váhy pro každou z
8 koncentrací – 32, 63, 125, 250, 500, 1000, 2000, 4000 mg Cd/kgsuš. Dostatečné množství
nekontaminované artificiální půdy je ovlhčeno na požadované procento WHC destilovanou
vodou a slouží jako kontrola. Každá skupina studentů testuje dvě koncentrace a kontrolu,
vše ve třech opakování pro každý test. Na konci cvičení si skupiny navzájem vymění
výsledky.
Laboratorní praktikum půdní ekotoxikologie
9
6 Chov a test s roupicí Enchytraeus
crypticus
6.1 Založení chovu
Roupice druhu Enchytraeus crypticus chováme na 1%
agaru v plastových Petriho miskách (před založením testu
jsou roupice přemísťovány pro aklimatizaci do artificiální
půdy).
 Roupice přeneste háčkem ze původního chovu na
nově připravený agar.
 Misky uchovávejte v termostatu nebo v
klimatizované inkubační místnosti při 18 ± 2 °C.
 Každý týden roupice zkontrolujte a přidejte špetku
potravy na povrch agaru.
6.2 Postup testu
 Do každé testovací skleničky navažte 20 g půdy a
přimíchejte potravu - pomleté autoklávované
ovesné vločky.
 Na daný objem půdy stačí malá kopistka ovesných
vloček. Potravu vmíchejte do půdy.
 Před založením testu byly roupice aklimatizovány
v artificiální půdě. Naberte část artificiální půdy
kovovou lžičku a přeneste ji do skleněné Petriho
misky naplněné vodou.
 Artificiální půdu jemně rozmíchejte ve vodě a
pomocí háčku vyberte dospělé roupice (velcí
červíci s opaskem - bílá ztluštěnina ve střední části
jejich těla).
 Do každé skleničky dejte 10 dospělců.
 Poté skleničky uzavřete a zvažte (hmotnost
zaznamenejte na nádobku či do laboratorního
deníku).
 Skleničky umístěte do inkubační místnosti do 18 ±
2 °C.
 Každý týden do skleniček přidejte špetku namletých
vloček. Pokud jsou patrné zbytky předchozí
potravy, musí být nejprve odstraněny háčkem.
 Po 28 dnech expozice ukončete test.
 Do každé testovací nádoby přidejte 5 ml etanolu a
vodovodní vodu tak, aby dosahovala cca 3 cm nad
povrch půdy.
 Poté přidejte 200 – 300 µl roztoku Bengálské
červeně (0,01 g v 1 ml etanolu).
 Skleničky zavřete víčky a směs několik vteřin
protřepejte. Skleničky se vzniklou suspenzí nechte
do druhého dne stát při laboratorní teplotě.
Laboratorní praktikum půdní ekotoxikologie
10
Další den vyhodnoťte počet roupic v testovacích
skleničkách. Po obarvení jsou dospělé roupice
červené, jednoznačně větší než velké množství
přítomných juvenilů a mají viditelný opasek.
Všechny nalezené roupice jsou považovány za
přeživší, mrtvé organismy se rychle rozkládají.
6.3 Vyhodnocení testu – způsob č.1
 Nachystejte si velkou skleněnou Petriho misku, do
které slijte trochu obarvené tekutiny ze skleničky.
 Na dně jsou vidět obarvené roupice. Pomocí
plastového kapátka nabírejte roupice, dávejte je
bokem a zaznamenávejte jejich počet.
 Po odebrání všech roupic přilijte další část
suspenze ze testovací skleničky.
Zvlášť hodnoťte počet přežívajících dospělců, kteří
byli na začátku nasazeni do testu, a počet
narozených mláďat – poznáte je dle velikosti.
6.4 Vyhodnocení testu – způsob č.2
 Do skleničky si vymačkejte trochu bílé akrylové
barvy (velikosti oříšku) a přilijte vodu
 Míchejte tak dlouho, dokud nevznikne mléčně bílý
roztok.
 Do 400 ml kádinky si nalijte koloidní roztok Ludox©
,
přilijte část (30 ml) bílého roztoku a opět pečlivě
zamíchejte.
 Do plastové misky přilijte obsah skleniček
s obarvenými roupicemi a poté přilijte asi 50 ml bíle
obarveného Ludoxu.
 Mírně s plastovou nádobou pohybujte, aby se
promíchaly vrstvy Ludoxu s obsahem skleničky
s roupicemi.
 Položte misku na stůl a nechte chviličku ustát. Při
správném promíchání dojde k vynesení obarvených
roupic na povrch.
 Přeneste misku do fotografické komory a povrch
vodní hladiny s roupicemi vyfotografujte.
 Natavení fotoaparátu: po zapnutí nastavte focení
na auto (zelený nápis shora), v přední části aparátu
zmáčkněte tlačítko pro makro (symbol kytičky) a
fotografování bez blesku (symbol přeškrtnutého
blesku)
 Na fotkách spočítejte počet dospělců a juvenilů.
Laboratorní praktikum půdní ekotoxikologie
11
7 Chov a test s chvostoskokem
Folsomia candida
7.1 Založení chovu
Kultura F. candida se chová v plastových krabičkách
nebo na Petriho miskách.
 Smíchejte sádru a aktivní uhlí v poměru cca 9 :1.
 Tento prášek nasypte do misek zhruba do 1 cm
vrstvy.
 Následně opatrně přidávejte destilovanou vodu až
do úplné saturace.
 Nechte připravené misky několik hodin zaschnout.
 Do substrátu vytvořte ostrým předmětem několik
rýh (pro kladení vajíček).
 Optimální vlhkost poznáte tak, že černý substrát je
lehce matný ne lesklý a po pokapání vodou se tato
pomalu vsakuje.
 Doprostřed misky přidejte špetku sušených kvasnic
(droždí) a pokapte destilovanou vodou.
 Ze starších chovů přidejte na misku pomocí
exhaustoru cca 40 středně velkých chvostoskoků.
 Misku dobře uzavřete a popište.
 Chov uchovávejte při 20 ± 2 °C.
 Chov je nutné kvůli pevně uzavřeným nádobám
větrat minimálně dvakrát týdně, kdy také kontrolujte
vlhkost substrátu a přidávejte špetku kvasnic
ovlhčených kapkou vody.
 Do testů se používají 10 - 12 dní staří juvenilní
chvostoskoci.
 Tuto synchronní kulturu připravte tak, že 10
dospělých chvostoskoků dáte do nové misky se
substrátem a poté co nakladou vajíčka (cca 2 dny,
ale zkontrolujte mikroskopem – vajíčka jsou malé
kuličky v otvorech v substrátu) je odstraňte.
 Počkejte na vylíhnutí vajíček a poté, co se objeví
první juvenilové, odpočítejte 10 – 12 dní.
7.2 Postup testu
 Do skleněných nádobek na test navažte po 30 g
půdy.
 Na povrch půdy dejte špetku kvasnic.
 Ze synchronizovaného chovu pomocí exhaustoru
odeberte 10 juvenilů – dávejte zejména pozor na
správný počet – a vyklepte je do testovací nádobky
s půdou.
 Nádobky uzavřete a poté zvažte.
Laboratorní praktikum půdní ekotoxikologie
12
 Nádoby umístěte do temna a teploty 20 ± 2 °C.
 Každý týden nádoby zvažte a porovnejte váhu
s původní. V případě úbytku doplňte vodu.
 Každý týden taky dosypte špetičku kvasic.
 Po 28 dnech vyhodnoťte mortalitu a reprodukci
pomocí flotační metody.
 Do testovací nádobky nalijte vodu z kohoutku a
opatrně promíchejte do rovnoměrné suspenze
pomocí štětečku.
 Poté beze zbytku přelijte suspensi do počítací
nádoby (zbytky půdy můžete vypláchnout
několikerým vymytím vodou).
 K suspenzi kápněte pár kapek inkoustu a opět
opatrně zamíchejte štětečkem.
 Počítací misku vložte do fotografické komory a
vyfoťte vodní hladinu digitálním fotoaparátem.
 Natavení fotoaparátu: po zapnutí nastavte focení
na auto (zelený nápis shora), v přední části aparátu
zmáčkněte tlačítko pro makro (symbol kytičky) a
fotografování bez blesku (symbol přeškrtnutého
blesku)
 Na fotkách spočítejte počet dospělců a juvenilů.
Laboratorní praktikum půdní ekotoxikologie
13
8 Test inhibice kořene salátu
Lactuca sativa
8.1 Předklíčení semínek
 Před zahájením testu se musí nechat semínka
předklíčit.
 Na dno velkých skleněných Petriho misek položte
vatu nebo filtrační papír a ovlhčete tak, aby v misce
nestála voda.
 Rovnoměrně rozprostřete semínka na povrchu a
přikryjte misku víčkem.
 Nechte semínka klíčit při laboratorní teplotě po
dobu 24-48 hodin.
 Do testu vybírejte pouze semínka s kořínkem
velikosti maximálně 2 mm.
8.2 Postup testu
 Do plastových krabiček navažte 300 g půdy
 Dovlhčete půdu tak, aby výsledná vlhkost
odpovídala 60 % WHC
 Povrch půdy v krabičkách trochu uhlaďte a
skleněnou tyčinkou si vytvořte pravoúhlou síť jamek
např. 3 x 5 bodů.
 Do vytvořených jamek pinzetou rovnoměrně
rozmístěte po 15 předklíčených semenech salátu.
 Semena saďtě kořínkem vždy dolů, jemně přitlačtě
k substrátu. Pozor, semínka půdou nezakrývejte.
 Misky se zasazenými semínky přikryjte víčkem a
ponechejte v termostatu po dobu 120 ± 2 h při
24°C.
 Po uplynutí této doby vyndejte misky z termostatu a
změřte délku kořínků salátu.
 Každou rostlinku opatrně vyndejte nejlépe pomocí
lžičky, při vytahování rostlinek ze substrátu buďte
opatrní, kořínky jsou velmi jemné a hrozí přetržení.
 Délku všech kořínků si zaznamenejte a z výsledků
vypočítejte výslednou inhibici růstu kořene.
Laboratorní praktikum půdní ekotoxikologie
14
9 Chov a test s hlísticí Caenorhabditis elegans
9.1 Založení chovu
 Hlístice C. elegans chováme na 2-3 mm NGM
agaru s nárůstem E. coli (OP50) v Petriho miskách
při teplotě 18 ± 2 °C.
 Nad plamenem ožehněte platinový drátek a ze
starého chovu přeneste několik jedinců na novou
misku získanou od vyučujícího. Hlístice nabírejte
pod binokulárním mikroskopem.
 Jednou týdně chov kontrolujte pod binokulárním
mikroskopem, kontaminované misky zrušte.
 Jedenkrát za měsíc kultury přesaďte na čerstvý
agar.
 Před vlastními testy populaci synchronizujte.
 Vyberte gravidní jedince (pod binokulárem jsou
patrná vajíčka uvnitř těla jedince) na novou misku,
po nakladení vajíček (nejpozději druhý den)
dospělce odstraňte a vajíčka nechte inkubovat v
termostatu při 20 °C.
 Z vajíček se vylíhnou dospělci po 3 - 4 dnech.
9.2 Postup testu
 Do 40 mm Petriho mističek navažte 2,3 g půd a
ovlhčete 1,5 ml destilované vody.
 Poté pomocí platinového drátku přeneste 10
synchronizovaných jedinců do půdy na mističce.
 Inkubujte mističky v termostatu při 20 °C po dobu 3
dnů.
 Po skončení expozice izolujte hlístice pomocí
koloidního roztoku Ludox©
.
 Půdu z mističky beze zbytku opláchněte do 50 ml
centrifugační zkumavky velmi pečlivě tak, aby
žádná část půdy nezůstala na mističkách.
 Celkem na toto použijte maximálně 30 - 40 ml
Ludoxu©
.
 Zkumavky uzavřete uzávěrem, protřepáním
vytvořte suspensi a centrifugujte při 2000 rpm cca 3
min.
 Poté supernatant slijte do velké Petriho misky a
pod binokulárním mikroskopem počítejte hlístice.
 Jedinci, kteří jsou vyextrahováni, jsou započítáni
jako živí, mrtví jedinci se v půdě rychle rozloží.
Laboratorní praktikum půdní ekotoxikologie
15
10 Vyhodnocení získaných výsledků, křivky dávka-odpověď
Výstupem většiny ekotoxikologických testů jsou parametry LOEC (lowest observed effect
concentration = nejnižší z testovaných koncentrací, která už způsobila statisticky významný
efekt), NOEC (no observed effect concentration = nejvyšší z testovaných koncentrací, která
ještě nezpůsobila žádný statisticky významný efekt), LC10 a LC50 (koncentrace při níž je
pozorována mortalita 10% či 50%), EC10 a EC50 (koncentrace při níž je pozorována inhibice
reprodukce nebo růstu oproti kontrole 10% či 50%). Koncentrace u těchto parametrů se
vyjadřují jako nominální (= množství látky původně nadávkované do půdy) koncentrace v
mg/kgsuš. Následující odstavce popisují jak postupovat s výsledky půdního testu ekotoxicity.
 Vytvořte ze získaných dat přehlednou tabulku, kde sloupce zleva doprava jsou
jednotlivé koncentrace včetně kontroly (v podstatě koncentrace 0 mg/kg).
 Řádky jsou jednotlivá opakování (v našem případě 3 řádky).
 U mortality zapište tzv. survival (= přežívání) počet živých organismů na konci testu.
Důvodem je, že v této podobě parametr s narůstající koncentrací klesá, stejně jako u
reprodukce.
 U reprodukce zapište počet juvenilů na konci testu.
 V programu MS Excel vypočítejte průměrnou hodnotu, směrodatnou odchylku (SD) a
relativní směrodatnou odchylku (RSD, tj. koeficient variance, CV, SD dělená
průměrem v procentech) pro každou koncentraci pro oba parametry.
 Výsledky vyneste do grafu, kde na ose X jsou koncentrace a na ose Y průměrná
hodnota parametru s chybovými úsečkami.
 Z těchto grafů odhadněte okometricky jaké budou asi hodnoty parametrů NOEC,
LOEC, LC50 a EC50.
 Upravte data pro statistickou analýzu.
 V případě programu GraphPad Prism stačí tabulku otočit tak, že řádky jsou
koncentrace a sloupečky výsledky jednotlivých opakování.
 Takto data importujte do statistického programu např. Statistica for Windows nebo
GraphPad Prism.
 V případě programu Statistica for Windows tak, že první sloupec obsahuje
koncentrace, druhý kód koncentrace (kontrola = 1, první koncentrace = 2, druhá = 3
atd.), třetí číslo opakování, čtvrtý a pátý výsledné hodnoty přežívání a reprodukce.
Jednotlivá opakování jsou tedy psána pod sebou a první a druhý sloupec vlastně
fungují jako kódovací. Vložte za první sloupec ještě jeden sloupec, do nějž
vypočítejte přirozené logaritmy koncentrací.
 V programu Statistica for Windows v modulu ANOVA zjistěte, zda je celkově
významný efekt koncentrací na výsledný parametr (tj. zda ANOVA vychází s P <
0,05).
 Ověřte, zda je v jednotlivých koncentracích homogenní rozptyl např. Levenovým
testem (musí vyjít s P > 0,05).
 Následně proveďte test vzájemných kontrastů (např. Dunnetův test) mezi
koncentracemi a první koncentrace, která se liší významně (P < 0,05) od předchozí
je LOEC a ona předchozí je NOEC.
 Pro určení LC50 použijte probitovou regresi.
 Data vyjádřete tak, že v prvním sloupci budete mít přirozený logaritmus koncentrace,
v druhém sloupci jedničku či nulu (jako přežili / nepřežili) a ve třetím kolika procent
Laboratorní praktikum půdní ekotoxikologie
16
organismů se přežili / nepřežili u dané koncentrace týká. Pro každou koncentraci
jsou tedy uvedeny dvě čísla, kolik procent přežilo (např. 20 ze 30 = 67 v řádku
s jedničkou) a kolik procent nepřežilo (např. 10 ze 30 = 33 v řádku s nulou).
 Data importujte do statistického softwaru např. Statistica for Windows.
 V modulu nelineární regrese zvolte probitovou regresi a proveďte ji. Zde je nutno
modelovat jen souměrnou část křivky, začněte až od NOEC/LOEC koncentrací.
 Výsledek regrese potom v Excelu vložte do modelu a namodelujte regresní křivku.
 Hodnotu EC50 vypočítejte na stejných datech jako byly připraveny pro ANOVA
v modulu nelineární regrese, logistická regrese.
 Do zadání pro rovnici zadejte vztah: Y = c / (1 + exp(-1 * b * (Log(X) – Log(a)))), kde
Y je sloupec s výsledným parametrem a X je sloupec s nelogaritmovanou
koncentrací a a, b, c jsou parametry křivky.
 Pro model použijte metodu nejmenších čtverců a Levenberg-Mardquardt algoritmus.
Zde musíte přibližně nastavit hodnoty parametrů - c (počáteční hodnota křivky kontrola,
strop dat), b (sklon - většinou -1 až -3), a (odhadovaná 50% inhibice).
 Výsledky modelu vložte do MS Excel a modelujte regresní křivku.
 Hodnota a je přímo EC50 včetně 95% intervalů spolehlivosti.