Fyziologie kmenových buněk Jiří Pacherník E-mail: jipa@sci.muni.cz Tel: 532 146 223 / 116 Podpořeno FRVŠ 540/2007 KMENOVÉ BUŇKY - zdroj buněk dané tkáně / orgánu - primární buňky pro danou strukturu Schopnost - dávat vznik dalším typům buněk (schopnost diferencovat) - sebeobnovy (selfrenewal) kmenovost (stemness) (U mnohobuněčných organismů absolutně klíčové pro zachování homeostáze na buněnčné a tkáňové úrovni) maturace Diferenciace (rozrůzňování) buněk - Buňky mění svůj fenotyp v na základě změny exprese svého genotypu v důsledku vnějších signálů. - Regulace diferenciace je často provázána s proliferací (epigenetické změny v jádře během mitotického cyklu?). Kmenová buňka aktuální <-> potencionální * Často proliferují a mají schopnost krátkodobé sebeobnovy. Přechodně/transientně se dělící buňky (Progenitory)* Terminálně diferencovaná buňka** ** Post-mitotické buňky = už se nikdy nedělí. Ne všechny terminálně diferencované buňky jsou post-mitotické. Sebeobnovující dělení (proliferační) Symetricky – vznikají dvě identické buňky Asymetricky – jedna si zachovává původní fenotyp, druhá je již jiná Diferenciační dělení – obě nově vzniklé buňky mají i nový fenotym, jsou dalším stupněm v dané diferenciační linii diferenciační dělením symetrické diferenciační dělením asymetrické Dělení buněk a jejich sebeobnova sebeobnova Diferenciace buněk sebeobnova diferencace * # ** * * * # # # # # # * sebeobnovující asymetrické dělení diferenciační asymetrické dělení přestavba genomu / chromatinu –> exprese jiného paternu genů –> jíná morfologie, jiné funkce a potenciál geny a jejich produkty - „houskeeping“ (metabolismus, transkripce / translace, základy cytoskeletu) - všeobecně abundantní (transripce/translace, cytoskelet, komponenty signálních drah) - specifické (enzymy, specifické transkripční faktory, cytoskelet – komponenty intermediálních filament, s cytoskeletem asociované proteiny) Determinace – předurčení pro danou diferenciační linii / dráhu Diferenciace a fenotyp buněk basic structure basic metabolism basic structure basic metabolism basic structure basic metabolism basic structure basic metabolism basic structure basic metabolism genotyp fenotyp basic structure basic metabolism dle skupin genů, které jsou exprimovány nezralá/naivníbuňkaspecializovaná/diferencovaná/ zralábuňka basic structure basic metabolism basic structure basic metabolism basic structure basic metabolism basic structure basic metabolism basic structure basic metabolism basic structure basic metabolism basic structure basic metabolism basic structure basic metabolism basic structure basic metabolism zachování „stop“ po předchozím fenotypu Diferenciace/maturace čas Početbuněk Nezralá buňka Diferenciace neprobíhá synchronně Metylace DNA a kondenzace chromatinu během časného vývoje Meshorer & Misteli 2006 Epigenetika Bibikova, 2006 cancer cells differ. cell SSC hES Profil metylace DNA u různých typů buněk (40 genů, 49 CpG míst) Modifikace histonů – regulace transkripce Profil postranslačních modifikací (lysinových zbytků) histonů H3 a H4 u ES (J1, V6.5), EC a MEF buněk Dai & Rasmussen 2007 Polycomb group (PcG) x Trithorax group (trxG) proteins PcG jsou odpovědné za inaktivaci transkripce cílových oblastí trxG jsou odpovědné za aktivaci transkripce cílových oblastí - obecně patří mezi skupinu proteinů modifikujících chromatin - regulují zejména transkripci homeotických genů – význam v ontogenezi - jsou odpovědné za epigenetickou pamět genomu - rozpoznávají specifické a vzájemně málo homologní skvence DNA PRE – PcG responsive element TRE – trxG response element - jedná se o proteinové komplexy se základní jednotnou strukturou (PcG 4 základní skupiny komplexů), specifita těchto komplexů k daným PRE/TRE je dána dalšími asociujícími specifickými podjednotkami Meshorer & Misteli 2006 Model změn trankripčního profilu v průběhu indukce diferenciace (kmenových) buněk HA – model postupné (hierarchické) aktivace (hierarchical activation) –> metylace DNA ETCM – model povolené/umožněné transkripce (early transcription competence marks) –> modifikace histonů PT – model promiskuitní transkripce (promiscuous transcription) –> kombinace transkripčních faktorů a transdukce signálu SYMETRIE DĚLENÍ BUNĚK O symetrii dělení rozhoduje - orientace dělícího aparátu (vřeténka) - polarizace buněk v tkáni - gradienty v buňce a jejím okolí -... => souvislost s niche Haydar 2002 Asymetrické x symetrické dělení v niche kmenových buněk Příklady mechanismů regulujících symetrii buněčného dělení na modelových orgaismech NB – neuroblast SOP – sensory organ progenitor (Jan & Jan 2000; Robert Andrews & Julie Ahringer 2007) Huttner 2005 Symetrické a asymetrické dělení buněk v centrálním nervovém systému savců Tsai 2005 Úloha (trimerických) G-proteinů v regulaci polohy dělícího vřeténka Dělení genomu u progenitorů/kmenových buněk při asymetrickém dělení Conboy 2007 Conboy 2007 Četnost asymetricky a symetricky dělících se kmenových buněk kosterní svaloviny in vitro - potvrzení výše uvedené hypotézy Sca-1 – znak kmenové buňky koserní svaloviny Desmin – protein charakterizující myoblast (časný progenitor svalové buňky) REGULACE KMENOVÝCH BUNĚK Existence kmenových buněk je regulována a) vnitřními (intrinsic) faktory (vývojově specifické transkripční faktory a specifické kombinace drah transdukce signálů) b) vnějšími (extrinsic) faktory (v niche) Kmenové buňky mohou existovat jen v příslušném „NICHE“ Co v NICHE najdeme? růstové faktory, proteiny extracelulární matrix, povrchy buněk / buněčný kontakt, hypoxie, nedostatek živin? Podobně jako se zdají být somatické SCs tkáńově/orgánově specifické, jsou specifické i jejich „niche“. Naveiras, 2006 NICHE KB nemohou být bez „niche“. „Niche“ KB je závislé na KB. Vybrané signální dráhy Signální dráha LIF (leukemii inhibující faktor) -> gp130 signalling Evolučně se zdá, že tato dráha hraje důležitou úlohu v regulaci pluripotentních a snad i multipotentních buněk u živočichů obecně (prokázáno i u Drosophily) Boiani & Scholer 2005 Význam gp130 signalizace v průběhu embryogeneze Signální dráha FGFs (Fibroblastové růstové faktory) Bottcher a Niehrs, 2005 Signální dráha TGFb / BMPs (Transformující růstový (growth) faktor b kostní (bone) morfogenetické proteiny) Interakce v signálování rodiny TGFbeta INTERKCE FGF & TGFb DRÁHY TRANSDUKCE SIGNÁLU Massague, 2003 Signální dráha Wnts Wnt + http://www.stanford.edu/~rnusse/wntwindow.html Signální dráha Wnts Signální dráha Hedgehog sonic hedgehog (Shh), Indian hedgehog (Ihh) off off on on Ptc – Patched Smo - Smoothened Signální dráha Notch Signální transdukce Notch, po navázání ligandu (DSL rodina = Delta, Serrate, Lag-2; Jagged) dojde k odštěpení extracelulární části receptoru a následně i intracelulární (NICD – Notch intacellular domain), ta translokuje do jádra a v dimeru s CSL (= CBF1 – Cp binding factor 1) aktivuje transkripci. Kadheriny sprostředkovaná komunikace mezi buňkami Integriny, aktivace vazbou ECM, zprostředkovaná transdukce signálu Boghog 2; Wikipedia Signální dráha jaderných receptorů obecně Signální dráha jaderných receptorů DNA DNA transkripce transkripceTF sebeobnova x diferenciace ?differenciace x sebeobnova? TF NR NR NR NR NR ligandy jaderné (nuclear) receptory transkripční faktory Kučera J. anoxie - 0% kyslíku tkáňová hypoxie – 0-3% kyslíku tkáňová normoxie – 3-5% kyslíku atmosféra – 21% kyslíku HYPEROXIE x NORMOXIE x HYPOXIE x ANOXIE In the human organisms, O2 concentration varies significantly between the tissues: in the lung parenchyma and in circulation (McKinley and Butler, 1999; Saltzman et al., 2003; Johnson et al., 2005; Wild et al., 2005), as well as in well irrigated parenchymal organs (liver, kidneys, heart; Wo¨ lfle and Jungermann, 1985; Jungermann and Kietzmann, 1997; Roy et al., 2000; Welch et al., 2001; Mik et al., 2004) it is comprised between 14% and 4%. In other tissues, relatively less irrigated, O2 concentration is even lower: in the brain, it varies from 0.5% to 7% (Whalen et al., 1970; Nwaigwe et al., 2000; Hemphill et al., 2005) in the eye (retina, corpus vitreous), from 1 to 5% (Buerk et al., 1993; reviewed in Yu and Cringle, 2005), in the bone marrow, from 0% to 4% (Tondevold et al., 1979; Chow et al., 2000). In this figure the structural and functional effects of Hypoxia, HIF-1 and VEGF on tumor microcirculation, cancer metabolism and therapies are illustrated. The vicious circles that occur are also shown. (Modified with permission from: Baronzio et al. Anticancer Res 1994; 14:1145-1154.) HYPOXIE Embryogeneze Organogeneze Homeostáza Pathologie HIF – hypoxií indukovaný faktor HIF1b (ARNT) + HIF1a = HIF1 (obecná buněčná odpověď na hypoxii) - (-) exprese c-myc / cD1 => CC arrest - stabilizace NICD (Notch)/ b-cat (Wnt) => sebeobnova - (+) glykolýza (PDK, Glut1/3, LDHA, HK,..) - (+) MTC4 (eflux laktátu) - (-) mitochondrie = (-) oxid. fosforylace (-) ROS - .... + HIF2a = HIF2 (částečně buněčně specifické, EPO) - podpora buněčného cyklu - (+) exprese Oct4... + HIF3a = HIF3 (kompetuje s HIFa, buněčně specifické) - inhibitor akce HIF (?) Regulace HIF Degradace HIF v přítomnosti O2 - hydroxylace prolyl hydroxylásami PHD, FIH - degradace v proteasomu zprostředkovaná pVHL faktorem - všechny podjednotky HIF prakticky konstitutivní exprese - regulace zejména degradací podjednotek HIFa (- částečně i regulací transkripce) Stabilita a transaktivační aktivita HIF je také regulována dalšími postranslačními modifikacemi včetně fosforylace Modifikace glykolýzy prostřednictvím HIF - zvýšení expresse GLUT1,4 - zvýšení exprese enzymů glykolýzy - inhibice přeměny pyruvátu na AcetylCoA Glykolýza – substráty intermediální produkty => růst buněk OxFos – energie => práce, produkce Inhibice glykolýzy v důsledku oxidativní fosforylace Prolyl hydroxylásy ( PHD; + Asparagin hydroxylasy; + ?) - sensory kyslíku a regulátory stabilizace HIF-Xalpfa - kofaktory a-ketoglutarát (2-oxoglutarát), O2, Fe2+,.. PHD+ PHD- Příklady dalších partnerů a substrátů PHD Zralejší mitochondrie => víc ATP => víc ROS (reaktivní kyslíkové radikály) => poškození DNA => peroxidace lipidů, deregulace signálních drah HYPOXIE => stresované mitochondrie (bez O2(?) a Acetyl-CoA) => přechodně víc ROS (=> stabilizace HIF1 (?)) => přechodně akumulace fumarátu a sukcinátu (=> inhibice PHD => stabilizace HIF1) MITOCHONDRIE x HYPOXIE Produkce ROS mitochondriemi HIF1 - indukuje autofagii mitochondrií - potlačuje biogenezi mitochondrií => snížení ROS - potlačuje maturaci mitochondrií Kmenové buňky - některé (?) vysoká hladina HIF1, i v normoxii!!! - některé (?) hypoxické niche - Warburgůf efekt = glykolýza nezávisle na dostupnosti O2 (předpoklad růstu buněk nad energetickým ziskem => intermediální metabolity pro výstavbu buněk) -potlačená aktivita/zralost a počet mitochondrií => málo ROS => závislost na glykolýze - hypoxie (1-(3)-5%) podporuje kmenovost - hypoxie (1-(3)-5%) podporuje reprogramování na iPSC - .... FENOTYP KMENOVÝCH BUNĚK x HYPOXIE Hypoxie prostřednictvím HIF1 - potlačuje oxidativní fosforylaci inhibicí biogeneze a aktivity mitochondrií => snížení produkce ROS => podpora kmenovosti - podporuje glykolýzu => nezávislost na mitochondriích a oxidativní fosforylaci - stabilizuje NICD, b-catenin (?) => vyší aktivita Notch ~ podpora kmenovosti => vyší aktivita „Wnt“ signalizace ~ podpora kmenovosti (?) - farmakologické inhibitory PHD zvyšují pool quiescentních HSC a jejich regenerační potenciál po ozážení in vivo [Forristal et al., 2013 Blood] čímž potlačuje diferenciaci a udržuje kmenovost Mitochondrie a kmenové buňky Inhibice maturace a funkce/aktivity mitochondrií (deplecí klíčových enzymů) = podpora kmenovosti (HSC) [Yu etal., 2013 Cell Stem Cell; Takubo et al., 2013 Cell Stem Cell] Xu et al., Cell Metab. 2013 DIFERENCIAČNÍ POTENCIÁL BUNĚK Jaké typy buněk mohou vznikat z buňky mateřské www.123rf.com Z hlediska schopnosti tvořit další buněčné typy se buňky dělí na: Totipotentní – mohou z nich vznikat všechny buňky daného živočišného druhu Pluripotentní – mohou dát vznik všem buňkám budoucího jedince (všechny tři zárodečné listy) Multipotentní – může z nich vznikat větší počet buněčných typů dané buněčné řady (Oligopotentní – podobné jako multipotentní, ale méně typů) Unipotentní – dávají vznik jen dvěma typům buněk Nullipotentní – mohou se pouze dělit, nemění fenotyp totipotentní buňky pluripotentní, multipotentní, …. buňky Totipotentní buňky - 1- až 8-buněčné embryo (= Embryonální nespecifikované - pouze savci) - Omezené možnosti dělení (neprobíhá transkripce; myš 2/4 b., člověk 8 b.) - Existují pouze přechodně http://biology.kenyon.edu/courses/biol114/Chap13/Chapter_13.html#fertilization Ztráta totipotence v průběhu časné embryogeneze - vznik nerovnoměrných podmínek pro růst buněk - tento proces je ireverzibilní M – meridiální / E - ekvatoriální Dělení buněk 2-buněčného embrya, určení polarity a její vliv na další osud blastomer Magdalena Zernicka-Goetz 2006 Orientace blastomer 4-buněčného embrya a její vliv na zachování absolutní totipotence těchto buněk Pluripotentní buňky (savci) a) In vivo: buňky vnitřní buněčné masy /embryoblastu buňky epiblastu / primitivního ektodermu (buňky nerální lišty (4tý zárodečný list) široce multipotentní) kmenové buňky teratomů (?) ( ! (somatické kmenové buňky?)) b) In vitro: embryonální kmenové buňky embryonální zárodečné buňky embryonální nádorové buňky (kmenové buňky teratomů) indukované pluripotentní kmeové buňky (buňky nerální lišty (4tý zárodečný list) široce multipotentní) (spermatogoniální kmenové buňky) (z dospělých varlat) (! (somatické kmenové buňky?)) Boiani & Scholer 2005 Kmenové buňky mohou být pluripotentní, multipotentní,… ale pluripotentní nebo multipotentní buňky nemusí být kmenové. (Pleopotentní buňka) pluripotentní buňka multipotentní tkáňově specifická buňka multipotentní tkáňově specifická buňka Pleopotence (změna v determinaci) Pleopotence* terminálně diferencované buňky progenitory * Schopnost sebeobnovy = self-renewal Schopnost dávat vznik jiným typům buněk = pluripotence / multipotence / ….. => kmenovost = stemness - Společné znaky s embryonálními a nádorovými buňkami, nezralý fenotyp / relativně nediferencované (= dlouhé telomery / vysoká aktivita telomeráz, specifické proteinové markery, velký jádro / plasmový poměr,…) = VYHRAZENÉ (PROFESIONÁLNÍ) KMENOVÉ BUŇKY - Některé somatické, terminálně diferencované buňky si zachovávají schopnost sebeobnovy a v případě potřeby i multipotence, normálně jsou ale quiescentní (spící) = FAKULTATIVNÍ KMENOVÉ BUŇKY (snad některé hepatocyty a buňky plicních epitelů,…) - Některé diferencované buňky si také dlouhodobě zachovávají schopnost proliferace, sebeobnovování a podílejí se tak na udržení homeostáze v tkáni = Sebeobnovující se diferencované buňky (některé glie, mikroglie, tkáňové makrofágy, některé lymfocyty,..) KMENOVÉ BUŇKY - dávají vznik buňkám dané buněčné struktury / tkáně / orgánu / (organismu) - relativně pomalá proliferace - jsou nejčastěji multipotentní, snad některé i pluripotentní či unipotentní - jsou základním zdrojem buněk pro regeneraci organismu a homeostázi - mají schopnost sebeobnovy (self-renewal) = in vivo asymetrické dělení - s věkem jich ubývá, ale pravděpodobně nikdy během života jedince úplně nevymizí profesionální SC - v tkáni jsou lokalizovány ve specifické oblasti, „niche“ (koutek) - mají společné znaky s embryonálními a nádorovými buňkami = dlouhé telomery, specifické proteinové markery, velký jádro / plasmový poměr,… - ??? KMENOVÉ BUŇKY PRIMÁRNÍ = existují „in vivo“ Somatické kmenové buňky (embryonální a adultní) Buňky některých zárodečných linií (neurální lišta) a kmenové buňky trofoblastu KMENOVÉ BUŇKY ODVOZENÉ/SEKUNDÁRNÍ = existují jen „in vitro“ - jsou připravené z populací pluripotentních embryonálních buněk, ze zárodečných buněk, nebo z progenitorů embryonálních a dospělých tkání, genetickými manipulacemi a speciálními kondicemi i ze somatických buněk - relativně rychle proliferují - některé jsou multipotentní (z embryonálních a dospělých tkání), některé pluripotentní (embryonální původ) - mohou být zdrojem buněk pro regeneraci organismu - mají schopnost sebeobnovy (self-renewal) = „asymetrické/symetrické“ dělení - mají společné znaky s embryonálními a nádorovými buňkami = dlouhé telomery, specifické proteinové markery, velký jádro / plasmový poměr,… - Problémy s jejich udržením – stabilita genotypu/fenotypu - ??? Embryonální kmenové buňky -> odvozené z vnitřní buněčné masy (Kmenové buňky epiblastu) Embryonální zárodečné buňky -> odvozené z primordiálních zárodečných buněk Embryonální nádorové buňky -> odvozené z kmenových buněk teratomů Somatické kmenové buňky odvozené -> odvozené ze somatických kmenových buněk Indukované kmenové buňky (pluripotentní (iPSC) x somatické) -> připravené ze somatikcých buněk genetickými manipulacemi a speciálními podmínkami IDENTIFIKACE KMENOVÝCH BUNĚK fenotyp x funkceFenotyp - Morfologie - Exprese specifických genů (qRT-PCR) - Exprese specifických proteinů (imuno metody) - funkční testy (vedení vzruchu, stah, sekrece, fagocytóza,…) => odpovídající kontroly!!! ( Nejlépe odpovídající tkáně a buňky vzniklé přirozeně) Funkce Kmenové buňky musí být schopny tvořit odpovídající potomky, odpovídající buněčné typy v rámci možností své potence (sebeobnova a diferenciace)